本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，是一种个体化外周血循环肿瘤细胞联合肿瘤标记物检测对晚期结肠癌患者化疗疗效的评估。
背景技术：
化疗联合靶向药物治疗是目前晚期结直肠癌患者的一线标准治疗方案选择。目前评价对肿瘤治疗疗效的金标准是基于影像学检查的实体肿瘤疗效评估标准，即RECIST标准。随着精准医学概念的提出以及生物靶向药物及免疫治疗在临床中的应用，基于细胞毒性药物的肿瘤疗效评价方法不足之处凸显，对现有的RECIST标准提出了挑战：化疗的疗效不仅仅只表现在形态的改变(如肿瘤体积的缩小)，还表现在肿瘤生物活性的变化(如囊性变、空洞等)。虽然PET-CT融合了形态影像和功能影像的两大特点，但由于评价周期较长、价格昂贵，作为化疗疗效的判断标准临床应用仍受限制。而血液中肿瘤标记物检测虽然简单，重复性强，但其变化不能单独作为疗效判断的标准。如何发现血液中是否有癌细胞以及数量，以前我们无法通过影像学、血液检测做出判断。因此，亟待寻找更加敏感的早期疗效评价标志物。
近年来，个体化循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)计数可成为肿瘤个体化治疗的重要指标。CTCs检测被看作液体活检，最大特点在于实时、多次监测功能，是一种非侵入性的新型诊断工具，有助于发现外周血循环系统中的肿瘤细胞。CTCs检测比单独的生物学标志物更好地判断疗效和预后。首先，CTCs检测能预测患者无进展生存期(PFS)和总体生存期(OS)。其次，CTCs作为独立的预后因子能及时反映治疗过程中患者的状况变化，CTCs数量升高提示疗效不好而数量降低提示疗效较好。再者，CTCs检测比影像学更早、更准确、更灵敏地判断疗效和预后。最后，CTCs检测比其他生物标志物更准确地判断疗效和预后。研究显示，肺癌患者CTCs检出率超过80％，肺癌患者外周血CTCs的数量与患者的临床分期和生存期有关，CTCs可作为预测肺癌患者治疗反应一个重要指标。
目前，国内外已开展了外周血CTCs检测研究，其中绝大多数用于临床前研究，主要研究工作集中在肿瘤患者预后的判断。有关个体化CTCs联合肿瘤标记物检测对晚期结肠癌化疗疗效的判断尚未见报道，国内外亦无专利授权。
综上所述，并不是所有的患者都能从相同的治疗中获益，因此，我们需要能早期检测和预测出哪些患者是可以获益的。而对于那些不能获益的患者，就要及时地更换治疗方案。随着对CTCs进行深入研究将有助于我们更好地了解肿瘤转移的生物学特性，根据这些特性制定的治疗策略将会有针对性地抑制肿瘤远处转移的发生。CTCs计数及其分子特征检测对确定肿瘤复发风险和预后、实时检测治疗效果、合理选择靶向药物、了解肿瘤耐药和转移机制都有重要意义。无权-视为撤
中国专利文献，发明专利申请号：201310187025.2公开了一种恶性肿瘤放化疗规范符合度的评估方法。但是关于一种个体化外周血循环肿瘤细胞联合肿瘤标记物检测对晚期结肠癌患者化疗疗效的评估，目前还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种个体化外周血循环肿瘤细胞联合肿瘤标记物检测对晚期结肠癌患者化疗疗效的评估方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种个体化外周血循环肿瘤细胞联合肿瘤标记物检测对晚期结肠癌患者化疗疗效的评估方法，所述的的方法如下：FOLFIRI化疗方案、治疗前d0、d8外周血3.2ml检测CTCs、肿瘤标记物检测、CTCs变化曲线、RECIST 1.1评估、比较3种疗效评估方法的优劣和检测ctDNA基因突变情况。
所述的方法包括下一周期化疗d0，d8重复检测CTCs。
本发明优点在于：
1.CTCs检测联合肿瘤标记物、影像学检查能更加准确的评估晚期结肠癌的患者化疗疗效；
2.个体化循环肿瘤细胞联合肿瘤标记物检测能较早的预测晚期结肠癌患者对化疗的反应情况，尤其是当化疗联合靶向治疗时，这种优势将更加明显，可以减少不必要的化疗所致的毒副反应，提高患者生活质量，同时减少经济负担，该技术具有较好的临床推广及应用前景。
具体实施方式
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
2004年，基于AVF2107g临床研究，贝伐单抗作为首个靶向药物获批应用于晚期结肠癌的治疗。迄今为止，化疗联合靶向药物治疗是目前晚期结直肠癌患者的一线标准治疗方案选择。除血管内皮生长因子及受体(VEGF/VEGFR)的单克隆抗体外，针对人表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体亦是主要选择的靶向药物之一，代表性药物为西妥昔单抗。来自CRYSTAL、OPUS研究的数据充分显示了化疗联合西妥昔单抗治疗可以延长患者的PFS和OS；Fire-3研究、中国TAILOR研究的数据也再次证明了西妥昔单抗联合FORFIRI或FOLFOX方案化疗能给患者带来生存获益。但由于西妥昔单抗单抗价格昂贵，为避免在临床应用过程给患者带来了不必要的经济浪费，有必要探索有效的疗效判断标准指导临床工作。
1.现有肿瘤化疗疗效评价标准的不足
目前评价对肿瘤治疗疗效的金标准是基于影像学检查的实体肿瘤疗效评估标准，即RECIST标准。随着精准医学概念的提出以及生物靶向药物及免疫治疗在临床中的应用，基于细胞毒性药物的肿瘤疗效评价方法不足之处凸显，对现有的RECIST标准提出了挑战：化疗的疗效不仅仅只表现在形态的改变(如肿瘤体积的缩小)，还表现在肿瘤生物活性的变化(如囊性变、空洞等)。虽然PET-CT融合了形态影像和功能影像的两大特点，但由于评价周期较长、价格昂贵，作为化疗疗效的判断标准临床应用仍受限制。而血液中肿瘤标记物检测虽然简单，重复性强，但其变化不能单独作为疗效判断的标准。如何发现血液中是否有癌细胞以及数量，以前我们无法通过影像学、血液检测做出判断。因此，亟待寻找更加敏感的早期疗效评价标志物。
2.个体化循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)计数可成为肿瘤个体化治疗的重要指标
肿瘤进展是一个动态的过程，在疾病发展和治疗过程中，肿瘤细胞的特征会发生不同程度的变化，表现出与原来异同的生物学特点，如耐药、侵袭能力增强、转入休眠等，带来肿瘤耐药、化疗不敏感、快速进展等一系列临床问题。因此，这就要求对肿瘤的监测应贯穿整个治疗过程，可多次、反复进行检查，目前可部分满足此要求的监测手段为影像学检查、血清肿瘤标记物检测等，但即使是高分辨率的影像学检查也仅能发现明显的转移灶、对比肿块大小等，血清肿瘤标记物则缺乏特异性。纵观目前的肿瘤监测手段：手术或活检标本检测、血清学标志物检测以及影像学检查，尚未出现一种手段可以同时满足上述两大要求。因此肿瘤监测手段已严重制约肿瘤个体化治疗的发展，成为亟待解决的瓶颈。
近年来，CTCs在恶性肿瘤转移过程中的作用日益受到关注。远处转移是晚期结肠癌患者死亡的主要原因，但由于缺乏有效的生物标志物进行疗效评判和难以获取血液中肿瘤细胞是阻碍恶性肿瘤远处转移治疗的主要因素，而CTCs的出现则为打破这一僵局带来了希望。CTCs是实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。进入循环的肿瘤细胞绝大多数在短期内死亡。只有极少数具有高度活力、高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶。进入外周血循环是肿瘤发生远处转移的先决条件，因此在外周血中检测到CTCs有助于早期发现肿瘤的微转移。
CTCs检测被看作液体活检，最大特点在于实时、多次监测功能，是一种非侵入性的新型诊断工具，有助于发现外周血循环系统中的肿瘤细胞。研究显示，肺癌患者CTCs检出率超过80％，肺癌患者外周血CTCs的数量与患者的临床分期和生存期有关，CTCs可作为预测肺癌患者治疗反应一个重要指标。首先，CTCs检测能预测患者无进展生存期(PFS)和总体生存期(OS)。无论是治疗前还是治疗后，CTCs数量均是强有力的独立预测因子。临床研究证实，当血样中的循环肿瘤细胞高于cut-off值(乳腺癌和前列腺癌≥5个/7.5ml；结直肠癌≥3个/7.5ml)时提示预后不好，当样本中循环肿瘤细胞低于阈值(cut-off)提示预后良好。其次，CTCs作为独立的预后因子能及时反映治疗过程中患者的状况变化，CTCs数量升高提示疗效不好而数量降低提示疗效较好。患者在化疗过程中可能出现耐药，提示患者体内肿瘤细胞的基因表达谱发生了改变，但此时原发病灶已切除，常难以再获得肿瘤细胞进行基因表达的检测，而通过CTCs检测技术，只需要抽取患者外周血，对其CTCs耐药相关基因的表达进行检测，即可揭示肿瘤耐药的可能机制，为进一步的治疗提供依据。这种实时、灵敏、可靠的方法能够帮助医生正确判断疗效和制定高效的个体化治疗方案。再者，CTCs检测比影像学更早、更准确、更灵敏地判断疗效和预后。CTCs检测比传统的影像学更早、更准确、更灵敏地判断预后。大量研究表明，治疗4周后监测CTCs对于预后判断的结果与传统影像学在治疗12周后的判断结果极其吻合；而且，当CTCs数值大于等于cut-off值时，CTCs检测对于预后判断比影像学更加精准。最后，CTCs检测比其他生物标志物更准确地判断疗效和预后。CTCs检测比单独的生物学标志物更好地判断疗效和预后。研究表明，在前列腺癌中，CTCs检测对于预后的判断比传统的标志物PSA更准确和灵敏。
3.RAS野生型晚期结肠癌化疗疗效评估现状
目前，晚期结肠癌基本的化疗药物的是5-FU类药物、奥沙利铂、伊立替康；针对人表皮生长因子受体(EGFR)和血管内皮生长因子及受体(VEGF/VEGFR)的单克隆抗体是两大类主要的靶向药物。化疗药物与靶向药物的联合是目前晚期结肠癌患者一线治疗方案的主要选择。其中，西妥昔单抗作为靶向EGFR的代表性抗体已广泛应用于临床。西妥昔单抗是作用于EGFR的单克隆抗体，可以抑制下游的信号通路传导，但通过免疫组化测定的EGFR状态并不能预测这些单抗的疗效，仅约有10％至20％的结直肠癌患者应用西妥昔单抗有效，CRYSTAL试验充分证实了KRAS基因第2外显子野生型患者在加用西妥昔单抗治疗后PFS得到了显著改善，并未导致患者生活质量的下降。随着临床研究的深入，近来更多的证据显示KRAS第二外显子以外的突变以及NRAS突变也可以预测对西妥昔单抗的治疗无效。III期临床研究CALGB/SWOG80405试验，充分说明了只有KRAS/NRAS均为野生型的患者可以从化疗联合西妥昔单抗的治疗中获益，最新来自中国的TAILORⅢ期临床研究在全球首次确诊西妥昔单抗联合FOLFOX方案能为中国的RAS野生型转移性结肠癌患者带来生存获益。但是，很多具有KRAS/NRAS野生型基因状态的患者依然对EGFR抑制剂无效。因此，很多研究探索了位于KRAS基因下游的很多因素，如大约5％-9％的结直肠癌会出现BRAF基因的特异性突变(V600E)，这部分患者也难以从西妥昔单抗的治疗中获益。因此，期望能找到更多标志物或检测方法来预测对西妥昔单抗的疗效。
研究内容
对于RAS基因野生型、BRAF基因野生型的晚期结肠癌患者而言，FOLFIRI(伊立替康和氟尿嘧啶和醛氢叶酸)联合西妥昔单抗是标准的一线治疗方案选择。本发明通过一项单臂、单中心、观察性临床研究，研究晚期结肠癌患者化疗前后CTCs早期变化与化疗疗效的相关性，评估CTCs联合肿瘤标记物检测能否更早的预测化疗后影像学评估的结果。主要研究内容包括：
1.研究初治的晚期结肠癌患者肿瘤组织中RAS基因、BRAF基因突变状态；
2.研究化疗前后，患者循环肿瘤细胞的变化情况，结合肿瘤标记物CEA、CA19-9的变化，评估化疗疗效，并与RECIST 1.1标准进行比较；
3.选择与RECIST 1.1标准疗效评估不一致的患者，进一步探索ctDNA中的异常基因突变情况。
研究目标
利用阴性富集法和imFISH技术检测外周血CTCs情况，旨在：
1.探索建立晚期结直肠癌患者在化疗、靶向治疗治疗过程中CTCs表达的连续监测检测方法；
2.探索CTCs联合肿瘤标记物检测可作为化疗疗效判断的潜在应用价值。解决的关键问题
本发明通过检测外周血CTCs情况，解决CTCs联合肿瘤标记物检测预测化疗疗效的cut-off值以及与西妥昔单抗耐药有关的异常基因突变这一关键科学问题。
创新之处
目前CTCs富集方法大都以上皮标志为基础(CellSearch系统为其代表)，使检测受到病种限制，同时由于受肿瘤EMT等因素的影响，使现有临床应用的CTCs检测系统敏感性和特异性较低，而成本较高。本发明采用阴性富集法和imFISH检测技术，这是一种敏感性更高、特异性更强并且检查成本低的CTCs检测方法。本发明利用这一技术，检测外周血CTCs变化情况，在此基础上建立晚期结直肠癌患者在化疗、靶向治疗等治疗过程中CTCs表达的连续监测检测方法。这是本发明的特色之处。同时，结合特殊人群中(即CTCs联合肿瘤标记物检测与RECIST 1.1标准疗效评估不一致的患者)ctDNA检测，探索与西妥昔单抗耐药相关的异常基因突变情况，这是本发明的创新之处。研究方法及步骤
1.研究对象：晚期结肠癌患者全部来自上海交通大学附属第一人民医院肿瘤中心，以初治的晚期结肠癌患者作为筛选对象，有符合RECIST 1.1标准的可测量病灶。检测组织中RAS基因、BRAF基因突变状态；最终选取RAS基因野生型、BRAF基因野生型的患者作为研究对象。该研究得到医院人类研究伦理委员会的批准，同时入组患者都
2.入组标准：
(1)签署了书面知情同意书
(2)18-75岁患者
(3)组织学确诊的结肠癌
(4)首次出现转移性病灶，而无法进行根治性切除
(5)肿瘤组织RAS基因为野生型
(6)经CT或MRI证实，至少存在一个符合RECIST 1.1标准的可测量病灶
(7)预计生存时间至少为12周
(8)入组时体力状况ECOG状态评分为0-1分
(9)血常规/生化/肝肾功能正常
3.排除标准
(1)既往曾接受针对CRC的化疗，研究开始前＞9个月(含伊立替康的化疗)，＞6个月(不含伊立替康的化疗)结束的辅助治疗除外
(2)研究治疗前30天内曾行放疗或手术
(3)既往曾行单克隆抗体治疗、VEGF通路靶向治疗、EGFR通路靶向治疗或其他信号转导通路抑制剂
(4)其他排除标准参照标准临床研究要求
4.采血时间：患者全套血清标本采集分成两个固定时间点：化疗的d0(化疗前)、d8(化疗第8天)分别采血3.2ml。治疗前行胸部、腹部作为基线。这些检查结果由同一位影像学医生采用RECIST 1.1版标准判定治疗疗效。
5.ctDNA分析：患者血液采集后3小时内提取血浆。每个患者每次采集5ml血浆，分离和纯化血浆中的DNA，然后采BEAMing扩增法检测ctDNA，进行突变基因分析。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。