一种全自动循环肿瘤细胞阴性富集装置的制作方法

本发明涉及循环肿瘤细胞全自动检测设备领域，尤其涉及一种全自动循环肿瘤细胞阴性富集装置。

背景技术：

循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，其可自发或通过诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶或转移灶)脱落，进入体循环系统(如外周血)。大部分CTC进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着病灶以外的组织或器官上，进而发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。因此，CTC检测可有效地应用于体外早期诊断、预后评价、个体化治疗(包括快速临床化疗药物筛选和耐药性的检测)、肿瘤复发监测及新的肿瘤药物开发等。

目前，市场上已出现的CTC富集和检测的产品或服务，唯一获得FDA批准的CTC检测设备是CellSearch系统，该系统是基于免疫磁珠分离技术而开发出的检测设备，它利用标记有针对上皮细胞黏着分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule,EpCAM)抗体的磁性颗粒进行CTC的捕获，该方法具有特异性强的优点，但是其无法识别未表达目标标记的未知细胞，且其捕获效率还是较低，白细胞的干扰较大。另外，目前的一些CTC检测设备和技术尚没有实现检测过程的全自动化控制，即没有实现血液检测样品和试剂的自动化进样，细胞的自动化捕获及鉴定分析，因此CTC的检测存在过多的人为干预，使得CTC的检测准确性低，检测成本过高。

鉴于循环肿瘤细胞也就是CTC总共有15个分型，而CellSearch只能检测到其中一个型别，漏检率很高，因此，本领域技术人员致力于开发一种以排除法原理筛选并富集CTC的全自动装置。

技术实现要素：

本发明旨在基于密度梯度离心法提供一种从全血中阴性富集循环肿瘤细胞的方法及其全自动设备，该方法利用不同种类细胞的密度差异将其分层，并用沉淀法弃去主要的干扰细胞，从而获得符合一定密度标准的循环肿瘤细胞。

为实现上述目的，本发明提供了一种全自动循环肿瘤细胞阴性富集装置，包括离心单元、转移单元、储料单元和收集分析单元；所述离心单元用于液体的离心以及细胞的染色、清洗和孵育，所述转移单元用于样本、试剂和材料的转移，所述储料单元用于试剂和材料的储存，所述收集分析单元用于收集富集获得的循环肿瘤细胞进行计数或分析。

进一步，所述离心单元以离心机为核心，所述储料单元设置于所述离心单元的周围，所述转移单元被设置于所述装置操作面的上方，其可在所述离心单元和所述储料单元之间转运样本、试剂和材料。

优选地，本发明处理的样本为血液样本。

进一步，所述储料单元包括试剂储料仓、耗材储料仓和废弃物储料仓；优选地，还可包括搅拌棒储料仓。

进一步，所述试剂储料仓中至少储存有密度梯度离心液、多联抗体试剂、细胞染色试剂和缓冲液。

优选地，所述试剂包括密度梯度离心液、多联抗体试剂、免疫荧光染色试剂、细胞固定试剂、缓冲液；其中，所述多联抗体试剂可结合至少两种干扰细胞，优选为可结合血液中的白细胞和红细胞；所述细胞染色剂优选为可特异性识别和结合循环肿瘤细胞表面抗原的荧光抗体。进一步，所述试剂还可以包括核酸染色剂、捕获增强试剂、通透试剂中的一种或多种。

阴性富集法中最大的干扰是白细胞和红细胞，上述方法采用多联抗体将白细胞与红细胞结合起来；在本发明的一种优选实施方式中，所述结合体的密度较大，经密度梯度离心而沉淀，而作为目标的CTC位于中间层，该层中除了目标CTC以外，还可能有与其密度相类似的其它细胞，这些其它细胞可能也是CTC，或是值得进一步分析研究的非CTC细胞。

优选地，所述耗材包括一次性移液枪头。

进一步，所述离心单元还包括视觉识别系统，用于对离心液体分层的成像、各层吸取液体量和高度的计算。

优选地，所述视觉识别系统的计算方法分为两部分，均是根据视觉识别照片(上下层以光电传感器对颜色加以区分)来计算的：

1)计算需抽掉的上层液体高度值：根据样本所在高度减去照片中上层与下层相接处的高度的差，加上调整的高度(防止抽液过多对下层造成扰动)；

2)计算需添加的液体高度值：用设定的最终高度减去现有液面的高度，必要时还要减去添加目标液体之前所需添加的小剂量试剂的高度。

进一步，所述离心单元采用的离心机为步进式离心机，可根据需要任意移动样本的通道位置；进一步，所述步进式移动样本通道位置即：在操作者上机时在离心机上放置离心管或转移单元添加和吸取液体时，离心机可以缓慢顺时针或逆时针旋转移动，将已操作通道移走，并将相邻通道转至操作位。采用所述步进式移动样品通道位置，便于上机放置样品管，同时可以便于配合转移单元工作，使转移单元与样本品通道通过最短路径配合，能够节约转移单元反复移动位置所消耗的时间，加快整个流程的进度。

优选地，所述离心单元能够实时记忆和记录每个样本通道的位置，便于将样本初始编号和提取物/分析物样本编号的对应，并且每一个生物样本在离心过程中的任意位置是有路径记忆以及动态与静态位置可设定和控制的。

更优选地，所述离心机为数字化离心机，在离心过程中，操作者可根据样本的离心要求设定加速与减速曲线，采用的减速曲线是智能可控的有刹车减速，在不扰动样本分层的基础上，能够快速刹车，节省了时间，而现有的离心机减速，为了避免样本的分层扰动，都是采取无刹车减速，减速时间非常长。

进一步，本发明所述离心单元还具有混匀机构，所述混匀机构被设置在离心机的每个样本通道底部，该机构可带动离心试管进行自旋和/或摇晃运动。

进一步，所述转移单元由一个或多个机械臂组成，所述机械臂能够进行上下、左右和/或转轴运动；优选地，所述机械臂可兼容hamilton的移动系统；在本发明的一种优选实施方式中，所述多个机械臂分别用于转移样品、废弃液、试剂和固体材料；在本发明的另一种优选实施例中，所述机械臂具有“一臂多用”的特点，可用于移取液体或固体材料。

在本发明的一种优选实施方式中，所述全自动循环肿瘤细胞阴性富集装置还包括搅拌棒。优选地，所述搅拌棒通过电磁场被所述机械臂抓取而实现转移。

进一步优选地，所述搅拌棒为螺旋桨状。

优选地，所述机械臂能带动所述搅拌棒进行自转运动，从而实现搅拌和混匀的动作。

进一步，所述收集分析单元具有观察窗，可供操作者观察或机器自动拍照。

此外，本发明还提供一种全自动循环肿瘤细胞阴性富集方法，包括以下步骤：

1)在离心单元中，交错放置装有全血样本的试管A和装有密度梯度离心液的试管B，在离心单元外的试管架中放置干净的试管C；

2)向全血样本试管A中加入缓冲液和交联抗体试剂，进行混匀和孵育；

3)将孵育后的全血样本轻轻加入旁边预装了密度梯度离心液的试管B中，经离心后进行视觉识别与计算，然后吸取循环肿瘤细胞层；

4)将吸取的循环肿瘤细胞层移入离心单元外的试管C中，并用转移单元将试管B从离心单元中移出；

5)用转移单元将试管C移入离心单元中，加入缓冲液后离心，弃去上清；

6)向试管C中加入免疫荧光染色试剂，经染色孵育后，加入缓冲液，再经离心弃上清后，加入固定试剂并混匀；

7)将用固定试剂重悬后的循环肿瘤细胞转移至收集分析单元内进行进一步的分析。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的阴性富集装置是首次实现阴性富集循环肿瘤细胞的自动化设备，结构紧凑，循环肿瘤细胞的富集和染色步骤均可在离心单元内完成，不需要专设染色平台；

(2)本发明的离心单元采用步进式移动样本通道位置，便于配合机械臂工作，使机械臂与样本通道通过最短路径配合，能够节约机械臂反复移动所需时间，加快整个流程的进度；所述离心平台所用离心机的减速曲线采用智能可控的有刹车减速，与传统的离心机自由停车相比，即避免了离心停车对液体的扰动，又节约了离心时间。

(3)本发明每个通道的样本和试剂操作是独立的，样本和试剂没有交叉污染，本发明的孵育过程是动态的，有搅拌和外磁强化，且本发明需要对生物样本进行预处理的过程是全自动的。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的结构示意图；

图2是本发明中机械臂的另一个较佳实施例的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述，但本领域技术人员根据以下实施例中具体方案的替换、转用或组合均包含于本发明的保护范围之内。采用与本发明装置类似设计流程样本处理的液体工作站形式，或者采用与本发明方法类似的富集方法，均在本发明的构思范围之内。

实施例1

本实施例提供了一种全自动循环肿瘤细胞阴性富集装置(图1)，包括离心单元、转移单元、储料单元和收集分析单元；其中，离心单元的核心部件为具有12个样本通道的数字化离心机1，所述离心单元用于液体的离心以及细胞的染色、清洗和孵育；转移单元由具有横向(X)和纵向(Y)轨道的两个转移机械头2-1、2-2组成，该两个转移机械头还可在垂直操作面的方向上(Z，图中未示出)移动；储料单元包括试剂储料仓3、移液枪头储料仓4、搅拌棒储料仓5、试管储料仓6和废液储料仓7，所述试剂储料仓3中至少储存有密度梯度离心液、多联抗体试剂、免疫荧光染色试剂、细胞固定试剂和缓冲液，多联抗体试剂可结合白细胞与红细胞；收集分析单元，该收集分析单元包括多个读数盒8，用于收集富集获得的循环肿瘤细胞进行计数或分析。

进一步，离心平台的离心机1为步进式离心机，可根据需要任意移动样本的通道位置，在一种优选的实施方式中，如图1所示的a和b位为机械臂的操作位，每次需要移液操作时，将样本离心管转至a和b位，两个转移机械头2-1、2-2同时移动至此位进行添加或吸取液体，固定操作位后，由于机械臂的移动路径被缩短，且机械臂和离心机同时参与位移，使总的运行流程缩短。此外该数字化离心机可根据样本的离心要求设定加速与减速曲线，采用的减速曲线是智能可控的有刹车减速，在不扰动样本分层的基础上，能够快速刹车，可进一步节省时间。该离心机还能够实时记忆和记录每个样本通道的位置，便于将样本初始编号和提取物/分析物样品编号的对应，并且每一个生物样本在离心过程中的任意位置是有路径记忆，以及动态与静态位置可设定和控制。

本实施例的离心单元还包括视觉识别系统，能够对离心液体分层的成像、各层吸取液体量和高度进行计算；此外离心机的通道底部还设置有混匀机构，可通过自旋和/或摇晃使样品中的液体混匀。

所述转移单元的机械臂连有两个转移机械头2-1和2-2，可以插取和释放移液枪头，吸取和吹出液体，此外还可以通过电磁场抓取、转移搅拌棒，所述搅拌棒的上端设置有铁磁性物质，可被转移机械头抓取，此处抓取方式不唯一，能满足要求的抓取方式都是可行的。

在本发明的另一种实施方式中，机械臂除了可以设置直线轨道外，还可以设置成绕轴旋转的形式，如图2所示，该离心单元有两个旋转式机械臂2-3和2-4，它们从左侧可沿轨道滑动的储料仓9中移取枪头、试剂等，为离心机1提供液体转移。

如图1中所示，本实施例中的离心机内样本通道为两个一组，共6组，机器运行之前在每组通道中的a位置放置全血样本，b位置放置密度梯度离心液，转移单元则可在离心机a通道和b通道之间转移液体，以及在离心机和试管架之间转移液体和离心试管。

在本发明的一种优选实施例中，样本的稀释步骤和密度梯度离心步骤分别在离心机的a和b位置进行，收集获得的CTC细胞被转移至试管储料仓6上的干净试管中，然后将该试管转移至离心机中进行后续的染色步骤，在此实施例中转移单元可转移试管，转移试管的方式可以是夹取式、磁抓取式等；在本发明的另一种优选实施例中，样本的稀释步骤在试管储料仓6上的试管中进行，用搅拌棒进行搅拌混匀，混匀后的液体样本转移至离心机中的a位置，密度梯度离心步骤在b位置进行，此实施例中无需转移试管。

本实施例中的装置可同批富集和检测6个样本，且兼容了样本前处理过程，运行时间短、效率高。

实施例2

本发明所述的视觉识别系统的一种优选实施例的具体计算方法包括两部分，分别是吸取液体高度的计算和需要添加液体高度的计算，都是根据视觉识别系统所拍摄的照片进行计算。

计算需抽掉的上层液体高度值：根据样本所在高度减去照片中上层与下层相接处的高度的差，加上调整的高度(防止抽液过多对下层造成扰动)；

计算需添加的液体高度值：用设定的最终高度减去现有液面的高度，必要时还要减去添加目标液体之前所需添加的小剂量试剂的高度。

例如，默认全血样本体积为10mL，离心后样本分为上层血浆和下层血细胞，吸取上层血浆后，需添加0.2mL的试剂，然后添加稀释缓冲液至5mL，其中调整的高度为0.8mL液体对应的高度，则其计算的总步骤为两步：

1)计算需抽掉的上层血浆的高度值：10mL样本所在高度减去照片中上层血浆与下层血细胞相接处的高度的差，加上7mm的高度(0.8mL液体对应的高度)；

2)计算需添加的稀释缓冲液高度值：所需稀释缓冲液为5mL所在高度值减去抽取血浆后的液面高度与需在稀释缓冲液之前添加的0.2mL的小剂量试剂之和；

例：10mL样本中共有7mL的上层血浆，则抽取值为6.2mL(7-0.8)，需添加的稀释缓冲液为1mL(5-3.8-0.2)。

实施例3

一种全自动循环肿瘤细胞的阴性富集方法，主要包括以下步骤：

1)在离心单元中，交错放置装有全血样本的试管A和装有密度梯度离心液的试管B，在离心单元外的试管架中放置干净的试管C；

2)向全血样本试管A中加入缓冲液和交联抗体试剂，进行混匀和孵育；

3)将孵育后的全血样本轻轻加入旁边预装了密度梯度离心液的试管B中，经离心后进行视觉识别与计算，然后吸取循环肿瘤细胞层；

4)将吸取的循环肿瘤细胞层移入离心单元外的试管C中，并用转移单元将试管B从离心单元中移出；

5)用转移单元将试管C移入离心单元中，加入缓冲液后离心，弃去上清；

6)向试管C中加入免疫荧光染色试剂，经染色孵育后，加入缓冲液，再经离心弃上清后，加入固定试剂并混匀；

7)将用固定试剂重悬后的循环肿瘤细胞转移至收集分析单元内进行进一步的分析。

具体地，所述阴性富集方法的自动化操作步骤可参见表1。

表1 CTC阴性富集自动化操作步骤

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。