用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片及其制备方法。本发明是将洁净的基片置于燃烧的火焰上，在基片的表面沉积得到由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层，并以此纳米烟灰颗粒作为模板，采用化学气相沉积法，在纳米烟灰颗粒的外表面沉积一层二氧化硅外壳层；通过高温煅烧处理，将二氧化硅外壳层内部的纳米烟灰颗粒除去，得到具有微米厚度的由纳米二氧化硅颗粒组成的二氧化硅层；最后，将特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体修饰在所述的二氧化硅层的表面，得到用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片。本发明的生物芯片具有对循环肿瘤细胞高效和高灵敏度富集，而且在水环境下具有高透明性，可用于实时检测捕获的循环肿瘤细胞。
【专利说明】用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学材料、功能材料【技术领域】，特别涉及用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片及其制备方法。
【背景技术】
[0002]早在1896年，澳大利亚病理学家托马斯.阿什沃思(Thomas Ashworth)就曾报道
I例转移性癌症患者血液中观察到了循环肿瘤细胞(circulating tumorcells,CTCs)-
从实体瘤中脱离出来并进入血液循环的肿瘤细胞。现在，一般认为，循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临床筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。如今，随着人们对肿瘤转移机制研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视，也研究并开发了许多用于循环肿瘤细胞富集、检测和分子生物学表征的技术。比如免疫磁珠分离法、基于尺寸的膜过滤法、基于表面抗体修饰的微流体器件等。然而，要想实现对循环肿瘤细胞富集、检测和分子生物学表征于一体的生物平台还是一个非常具有挑战性的技术难题。原因主要在于:血液中CTC极其微量，往往大约每十亿个正常血细胞中才会发现一个CTC，要想有效富集这些细胞极其困难，需要灵敏的检测设备；另外，富集得到的CTC必须具有活性，这样才能有利于后续分子生物学表征。所以如何寻找一种简便高效的方法实现对循环肿瘤细胞的富集、检测和分子生物学表征的技术成为了一个人们关注的课题。
[0003]CN201120255677.1、CN201110433615.X、CN200820169047.0、CN200890100321.7、CN201210023487.6、CN201210023487.6 和 CN200810162901.5 中分别公开了循环肿瘤细胞富集的方法。虽然上述技术方案都具有一定的富集循环肿瘤细胞的功能，但也存在着不同的不足，如制造过程较为复杂`，有的富集效率不高，有的富集和检测时间较长等。
[0004]同样，文献 Angewandte Chemie 2009, 121, 9132, J Am Chem Soc 2008, 130, 8633,Nano Letters 2012, 12，163也报道了可以用来循环肿瘤细胞富集的生物芯片或生物平台，但也存在上述类似的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片。
[0006]本发明的再一目的在于提供一种制备成本低廉、简单便捷的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片的制备方法。
[0007]本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，是将洁净的基片置于燃烧的火焰上，在基片的表面沉积得到由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层(优选烟灰层的厚度为微米厚度)，并以此纳米烟灰颗粒作为模板，采用化学气相沉积法，在所述的纳米烟灰颗粒的外表面沉积一层二氧化硅外壳层(优选二氧化硅外壳层的厚度为纳米厚度)，然后通过高温煅烧处理，将所述的二氧化硅外壳层内部的所述的纳米烟灰颗粒除去，得到具有微米厚度的由纳米二氧化硅颗粒组成的二氧化硅层；最后，通过化学反应的方法，将特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体修饰在所述的二氧化硅层的表面，得到生物芯片，即本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片。
[0008]本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，是在基片的表面包覆有微米厚度的由纳米二氧化硅颗粒组成的二氧化硅层，在所述的二氧化硅层的表面修饰有特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体。
[0009]所述的二氧化硅层的表面修饰有特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体，其特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的修饰量不少于0.1 μ g/cm2。
[0010]所述的微米厚度的由纳米二氧化硅颗粒组成的二氧化硅层的厚度优选为I~50微米。 [0011]所述的纳米二氧化硅颗粒中的纳米二氧化硅颗粒的平均粒径为20~900纳米。
[0012]本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片具有微米厚度的由纳米二氧化硅颗粒组成的二氧化硅层，通过纳米结构与循环肿瘤细胞的三维拓扑结构产生增强粘附效应，以及特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体与循环肿瘤细胞表面特定蛋白的特异性结合的协同作用，从而实现了对循环肿瘤细胞的高效和高敏度富集；同时，透射光谱测试的结果表明，本发明的生物芯片在水环境下具有高透明性，可见光波透过率为30~99%，可以利用光学检测平台(比如激光共聚焦、荧光显微镜)实时检测捕获的循环肿瘤细胞，提供诸如细胞形态等有效信息，有利于对循环肿瘤细胞的正确检测。
[0013]实验结果表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片对特异性的循环肿瘤细胞(如乳腺癌细胞MCF7)的富集效率高达30~99%，且非特异性的细胞系(如jurkat T淋巴细胞和Daudi淋巴细胞等)却极少粘附在生物芯片上，从而可以实现在生物样品中的循环肿瘤细胞的高效富集。比如将血液样品加入到放置有本发明的生物芯片的6孔板中，可以实现对血液样品中循环肿瘤细胞的高效和高灵敏富集，而正常血细胞却极少粘附在生物芯片上。本发明的生物芯片具有高透明性的特点，在紫外-可见光区域的透过率高达30~99%，因此可以通过荧光显微镜和激光共聚焦等光学检测平台实现对捕获的循环肿瘤细胞进行实时检测，提供诸如细胞形态等有效信息，有利于对循环肿瘤细胞的正确检测。
[0014]本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片的制备方法包括以下步骤:
[0015](I)将基片清洗干净(可分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗10分钟，然后用Piranha溶液(浓H2S04/30%H202，V/V=7:3)清洗30分钟)，氮气吹干，然后将基片置于燃烧的火焰上，在基片的表面沉积一层由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层；
[0016](2)将步骤⑴得到的沉积有由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的基片置于含硅化合物所挥发的气体环境中，通过化学气相沉积，在由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的纳米烟灰颗粒的外表面沉积一层二氧化娃外壳层；
[0017](3)将步骤(2)得到的基片进行高温煅烧处理，除去二氧化硅外壳层内部的所述的纳米烟灰颗粒，在基片的表面沉积得到微米厚度的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化
娃层;
[0018](4)将步骤(3)得到的基片用氧等离子体处理(优选功率是200mW，处理时间为5分钟左右)，以在纳米二氧化硅颗粒的表面产生羟基；然后置于1-10%体积浓度的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷无水乙醇溶液中进行反应(优选室温下反应30分钟左右);取出基片并清洗(可用乙醇润洗表面后，再用二甲基亚砜润洗);
[0019](5)将步骤(4)得到的基片置于浓度为0.1-0.5mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液中，室温下放置(优选室温下放置45分钟左右)，使4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯偶联到纳米二氧化硅颗粒的表面上；将基片取出并清洗(可用磷酸盐缓冲液充分润洗);
[0020](6)将步骤(5)得到的基片置于l-ΙΟμ g/mL的链霉亲和素的磷酸盐缓冲液中，室温下放置进行反应(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，将基片取出并清洗(可用磷酸盐缓冲液洗涤);
[0021](7)将浓度为1-10 μ g/mL的特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的磷酸盐缓冲液滴加到步骤(6)得到 的基片上(如取25 μ L滴加到的1X1平方厘米的基片表面上)，室温放置(优选室温下放置30分钟左右)，使特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体修饰在所述的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层的表面，得到所述的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片。
[0022]所述的由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的厚度优选为微米厚度，较佳的微米厚度为0.1~500微米。
[0023]所述的微米厚度的由纳米二氧化硅颗粒组成的二氧化硅层的厚度为I~50微米。
[0024]所述的纳米二氧化硅颗粒中的纳米二氧化硅颗粒的平均粒径为20~900纳米。
[0025]所述的基片选自玻璃片、石英片和云母片等透明片材中的一种。
[0026]所述的火焰是由动物油脂、植物油脂、蜡烛、酒精或煤油等碳氢化合物燃烧所产生的火焰。
[0027]所述的含硅化合物选自四氢化硅、四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷和四氯化硅所组成的组中的至少一种。
[0028]所述的化学气相沉积的时间优选为10分钟~72小时。
[0029]所述的高温煅烧处理的温度优选为400~1300°C。
[0030]所述的高温煅烧处理的时间优选为I~8小时。
[0031]本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片具有制备成本低廉，原料易得，设备和制作工艺简单，易工业化生产等优点，可一次性用于临床诊断。本发明的生物芯片的循环肿瘤细胞的捕获效率和灵敏度高，分离纯度高，富集后的循环肿瘤细胞活性高，特别适用于对前列腺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、恶性黑色素瘤、软组织腺泡状肉瘤等引起转移的血液中的循环肿瘤细胞均有很好的富集效果，还可实时检测捕获的循环肿瘤细胞，提供诸如细胞形态等有效信息，有利于对循环肿瘤细胞的正确检测。本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片的制备过程无有毒有害物质，环境友好，稳定性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1a.本发明实施例1制备的厚度为5.4微米的由纳米二氧化硅颗粒组成的二氧化硅层的正面扫描电镜照片。
[0033]图1b.本发明实施例1制备的厚度为5.4微米的由纳米二氧化硅颗粒组成的二氧化硅层的侧面扫描电镜照片
[0034]图2.本发明实施例1制备的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片置于水中的照片，展示其在水中具有优异的透明性。
[0035]图3.本发明实施例1制备的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片的乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据。
[0036]图4a.采用本发明实施例1制备的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片捕获的乳腺癌细胞MCF7的明场照片。
[0037]图4b.采用本发明实施例1制备的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片捕获的乳腺癌细胞MCF7的荧光显微照片。
【具体实施方式】
[0038]实施例1.[0039](1)将I X I平方厘米的石英片分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗10分钟，然后用Piranha溶液(浓H2S04/30%H202，V/V=7:3)清洗30分钟，再在去离子水中超声清洗10分钟，直至石英片洁净，最后用氮气充分吹干；点燃蜡烛，待火焰稳定后(5分钟左右)，用镊子夹取石英片置于蜡烛燃烧的火焰上，在石英片的表面沉积一层厚度为20微米的由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层；
[0040](2)将步骤(1)得到的沉积有由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的石英片置于培养皿(D=40mm,H=llmm)中，加入0.1mL四氯化娃液体,密封后置于通风橱中，I小时后将石英片取出，在由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的纳米烟灰颗粒的外表面化学气相沉积一层厚度为20纳米的二氧化硅外壳层；
[0041](3)将步骤⑵得到的石英片放置于管式炉中于800°C下煅烧2小时，除去二氧化硅外壳层内部的所述的纳米烟灰颗粒，在石英片的表面沉积得到厚度为5.4微米的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层，其中，纳米二氧化硅颗粒中的纳米二氧化硅颗粒的平均粒径为269纳米；如图1a及图1b所示；
[0042](4)将步骤(3)得到的石英片用功率是200mW的氧等离子体处理5分钟左右，以在纳米二氧化硅颗粒的表面产生羟基；然后置于1%体积浓度的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷无水乙醇溶液中，室温下反应30分钟左右；取出石英片并用乙醇润洗表面三次，再用二甲基亚砜润洗一次；
[0043](5)将步骤(4)得到的石英片置于浓度为0.1mM的4_马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液中，室温下放置45分钟左右，使4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯偶联到纳米二氧化硅颗粒的表面上；将石英片取出并用磷酸盐缓冲液充分润洗；
[0044](6)将步骤(5)得到的石英片置于1 μ g/mL链霉亲和素的磷酸盐缓冲液中，室温下放置反应30分钟左右，将石英片取出并用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0045](7)取25 μ L浓度为I μ g/mL的特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的磷酸盐缓冲液滴加到步骤(6)得到的石英片上，室温下放置30分钟左右，使特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体修饰在所述的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层的表面，其特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的修饰量不少于0.1 μ g/cm2，得到如图2所示在水中具有优异的透明性的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片；另外透射光谱测试的结果表明，沉积二氧化硅层的石英片在水环境下的可见光波透过率为30~99%。
[0046](8)将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将生物芯片在硫酸缓冲液中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的乳腺癌细胞MCF7用质量浓度4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液溶液固定20分钟后，再用0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟，再用2 μ g/ml的DAPI磷酸盐缓冲液染色15分钟后，在PBS中涮洗1_2次后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图3所示；捕获的乳腺癌细胞MCF7的明场照片如图4a所示，荧光显微照片如图4b所示。
[0047]作为对照组1，将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的人淋巴B细胞瘤Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去人淋巴B细胞瘤Daudi悬浮液，将生物芯片在PBS中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi用含4%体积浓度的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定20分钟，再用含0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分钟，在磷酸缓冲液中涮洗1_2次后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi进行计数，计算捕获效率。人淋巴B细胞瘤Daudi粘附的定量数据如图3所示。
[0048]作为对照组2，将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的人淋巴瘤Jurkat T细胞悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去人淋巴瘤Jurkat T细胞悬浮液，将生物芯片在PBS中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的人淋巴瘤Jurkat T细胞用含4%体积浓度的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定20分钟后在磷酸缓冲液中涮洗1-2次，再用含0.2%体积浓度的Triton `X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟后在PBS中涮洗1_2次，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分钟后在PBS中涮洗1_2次，最后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的人淋巴瘤JurkatT细胞进行计数，计算捕获效率。人淋巴瘤Jurkat T细胞粘附的定量数据如图3所示。
[0049]实验结果表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片的乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为73.2%。对照实验中的人淋巴B细胞瘤Daudi的捕获效率仅为8.4% ;人淋巴瘤Jurkat T细胞的捕获效率仅为5.0%。这些数据表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，具有闻的循环肿瘤细胞的捕获效率和灵敏度，富集后的循环肿瘤细胞活性高。
[0050]实施例2.[0051](I)将I X I平方厘米的石英片分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗10分钟，然后用Piranha溶液(浓H2S04/30%H202，V/V=7:3)清洗30分钟，再在去离子水中超声清洗10分钟，直至石英片洁净，最后用氮气充分吹干；点燃蜡烛，待火焰稳定后(5分钟左右)，用镊子夹取石英片置于蜡烛燃烧的火焰上，在石英片的表面沉积一层厚度为500微米的由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层；[0052](2)将步骤⑴得到的沉积有由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的石英片置于培养皿(D=40mm, H=Ilmm)中，加入0.1mL四氯化娃液体,密封后置于通风橱中，72小时后将石英片取出，在由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的纳米烟灰颗粒的外表面化学气相沉积一层厚度为200纳米的二氧化硅外壳层；
[0053](3)将步骤(2)得到的石英片放置于管式炉中于800°C下煅烧2小时，除去二氧化硅外壳层内部的所述的纳米烟灰颗粒，在石英片的表面沉积得到厚度为50微米的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层，其中，纳米二氧化硅颗粒中的纳米二氧化硅颗粒的平均粒径为900纳米；
[0054](4)将步骤(3)得到的石英片用功率是200mW的氧等离子体处理5分钟左右，以在纳米二氧化硅颗粒的表面产生羟基；然后置于1%体积浓度的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷无水乙醇溶液中，室温下反应30分钟左右；取出石英片并用乙醇润洗表面三次，再用二甲基亚砜润洗一次；
[0055](5)将步骤(4)得到的石英片置于浓度为0.1mM的4_马来酰亚胺基丁酸_N_琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液中，室温下放置45分钟左右，使4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯偶联到纳米二氧化硅颗粒的表面上；将石英片取出并用磷酸盐缓冲液充分润洗；
[0056](6)将步骤(5)得到的石英片置于I μ g/mL的链霉亲和素的磷酸盐缓冲液中，室温下放置反应30分钟左右，将石英片取出并用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0057](7)取25 μ L浓度为I μ g/mL的特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的磷酸盐缓冲液滴加到步骤(6)得到的石英片上，室温下放置30分钟左右，使特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体修饰在所述的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层的表面，其特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的修饰量不少于0.1 μ g/cm2，得到在水中具有优异的透明性的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片；透射光谱测试的结果表明，沉积二氧化硅层的石英片在水环境下的可见光波透过率为30~99%。
[0058](8)将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将生物芯片在硫酸缓冲液中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的乳腺癌细胞MCF7用质量浓度4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液溶液固定20分钟后，再用0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟，再用2 μ g/ml的DAPI磷酸盐缓冲液染色15分钟后，在PBS中涮洗1_2次后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕获效率。
[0059] 作为对照组1，将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的人淋巴B细胞瘤Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去人淋巴B细胞瘤Daudi悬浮液，将生物芯片在PBS中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi用含4%体积浓度的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定20分钟，再用含0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分钟，在磷酸缓冲液中涮洗1_2次后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi进行计数，计算捕获效率。
[0060]作为对照组2，将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的人淋巴瘤Jurkat T细胞悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去人淋巴瘤Jurkat T细胞悬浮液，将生物芯片在PBS中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的人淋巴瘤Jurkat T细胞用含4%体积浓度的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定20分钟后在磷酸缓冲液中涮洗1-2次，再用含0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟后在PBS中涮洗1_2次，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分钟后在PBS中涮洗1_2次，最后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的人淋巴瘤JurkatT细胞进行计数，计算捕获效率。
[0061]实验结果表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片的乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为74.2%。对照实验中的人淋巴B细胞瘤Daudi的捕获效率仅为5.4% ;人淋巴瘤Jurkat T细胞的捕获效率仅为6.1%。这些数据表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，具有闻的循环肿瘤细胞的捕获效率和灵敏度，富集后的循环肿瘤细胞活性高。
[0062]实施例3.[0063](I)将将I X I平方厘米的石英片分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗10分钟，然后用Piranha溶液(浓H2S04/30%H202，V/V=7:3)清洗30分钟，再在去离子水中超声清洗10分钟，直至云 母片洁净，最后用氮气充分吹干；点燃植物油脂的燃烧灯，待火焰稳定后(5分钟左右)，用镊子夹取云母片置于植物油脂燃烧的火焰上，在云母片的表面沉积一层厚度为I微米的由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层；
[0064](2)将步骤(1)得到的沉积有由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的云母片置于培养皿(D=40mm, H=Ilmm)中，加入0.1mL四氯化娃液体,密封后置于通风橱中，10分钟后将云母片取出，在由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的纳米烟灰颗粒的外表面化学气相沉积一层厚度为10纳米的二氧化硅外壳层；
[0065](3)将步骤(2)得到的云母片放置于管式炉中于1300°C下煅烧10分钟，除去二氧化硅外壳层内部的所述的纳米烟灰颗粒，在云母片的表面沉积得到厚度为I微米的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层，其中，纳米二氧化硅颗粒中的纳米二氧化硅颗粒的平均粒径为20纳米；
[0066](4)将步骤(3)得到的云母片用功率是200mW的氧等离子体处理5分钟左右，以在纳米二氧化硅颗粒的表面产生羟基；然后置于10%体积浓度的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷无水乙醇溶液中，室温下反应30分钟左右；取出云母片并用乙醇润洗表面三次，再用二甲基亚砜润洗一次；
[0067](5)将步骤(4)得到的云母片置于浓度为0.5mM的4_马来酰亚胺基丁酸_N_琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液中，室温下放置45分钟左右，使4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯偶联到纳米二氧化硅颗粒的表面上；将云母片取出并用磷酸盐缓冲液充分润洗；
[0068](6)将步骤(5)得到的云母片置于10μ g/mL的链霉亲和素的磷酸盐缓冲液中，室温下放置反应30分钟左右，将云母片取出并用磷酸盐缓冲液洗涤；[0069](7)取25 μ L浓度为I μ g/mL的特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的磷酸盐缓冲液滴加到步骤(6)得到的石英片上，室温下放置30分钟左右，使特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体修饰在所述的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层的表面，其特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的修饰量不少于0.1 μ g/cm2，得到在水中具有优异的透明性的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片；透射光谱测试的结果表明，沉积二氧化硅层的石英片在水环境下的可见光波透过率为30~99%。
[0070](8)将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将生物芯片在硫酸缓冲液中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的乳腺癌细胞MCF7用质量浓度4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液溶液固定20分钟后，再用0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟，再用2 μ g/ml的DAPI磷酸盐缓冲液染色15分钟后，在PBS中涮洗1_2次后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕获效率。
[0071]作为对照组1，将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的人淋巴B细胞瘤Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去人淋巴B细胞瘤Daudi悬浮液，将生物芯片在PBS中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi用含4%体积浓度的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定20分钟，再用含0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分钟，在磷酸缓冲液中涮洗1_2次后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi进行计数，计算捕获效率。
[0072]作为对照组2，将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的人淋巴瘤Jurkat T细胞悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应`的时间为30分钟左右)，吸去人淋巴瘤Jurkat T细胞悬浮液，将生物芯片在PBS中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的人淋巴瘤Jurkat T细胞用含4%体积浓度的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定20分钟后在磷酸缓冲液中涮洗1-2次，再用含0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟后在PBS中涮洗1_2次，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分钟后在PBS中涮洗1_2次，最后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的人淋巴瘤JurkatT细胞进行计数，计算捕获效率。
[0073]实验结果表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片的乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为70.2%。对照实验中的人淋巴B细胞瘤Daudi的捕获效率仅为8.9% ;人淋巴瘤Jurkat T细胞的捕获效率仅为5.3%。这些数据表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，具有闻的循环肿瘤细胞的捕获效率和灵敏度，富集后的循环肿瘤细胞活性高。
[0074]实施例4.[0075](I)将I X I平方厘米的石英片分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗10分钟，然后用Piranha溶液(浓H2S04/30%H202，V/V=7:3)清洗30分钟，再在去离子水中超声清洗10分钟，直至玻璃片洁净，最后用氮气充分吹干；点燃动物油脂的燃烧灯，待火焰稳定后(5分钟左右)，用镊子夹取玻璃片置于动物油脂燃烧的火焰上，在玻璃片的表面沉积一层厚度为40微米的由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层；
[0076](2)将步骤(1)得到的沉积有由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的玻璃片置于培养皿(D=40mm，H=llmm)中，加入0.1mL SiCl4液体，密封后置于通风橱中，I小时后将玻璃片取出，在由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的纳米烟灰颗粒的外表面化学气相沉积一层厚度为200纳米的二氧化硅外壳层； [0077](3)将步骤⑵得到的玻璃片放置于管式炉中于400°C下煅烧2小时，除去二氧化硅外壳层内部的所述的纳米烟灰颗粒，在玻璃片的表面沉积得到厚度为5微米的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层，其中，纳米二氧化硅颗粒中的纳米二氧化硅颗粒的平均平均粒径为200纳米；
[0078](4)将步骤(3)得到的玻璃片用功率是200mW的氧等离子体处理5分钟左右，以在纳米二氧化硅颗粒的表面产生羟基；然后置于4%体积浓度的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷无水乙醇溶液中，室温下反应30分钟左右；取出玻璃片并用乙醇润洗表面三次，再用二甲基亚砜润洗一次；
[0079](5)将步骤(4)得到的玻璃片置于浓度为0.25mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液中，室温下放置45分钟左右，使4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯偶联到纳米二氧化硅颗粒的表面上；将玻璃片取出并用磷酸盐缓冲液充分润洗；
[0080](6)将步骤(5)得到的玻璃片置于10μ g/mL的链霉亲和素的磷酸盐缓冲液中，室温下放置反应30分钟左右，将玻璃片取出并用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0081](7)取25 μ L浓度为I μ g/mL的特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的磷酸盐缓冲液滴加到步骤(6)得到的石英片上，室温下放置30分钟左右，使特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体修饰在所述的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层的表面，其特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的修饰量不少于0.1 μ g/cm2，得到在水中具有优异的透明性的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片；透射光谱测试的结果表明，沉积二氧化硅层的石英片在水环境下的可见光波透过率为30~99%。
[0082](8)将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将生物芯片在硫酸缓冲液中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的乳腺癌细胞MCF7用质量浓度4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液溶液固定20分钟后，再用0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟，再用2 μ g/ml的DAPI磷酸盐缓冲液染色15分钟后，在PBS中涮洗1_2次后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕获效率。
[0083]作为对照组1，将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的人淋巴B细胞瘤Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去人淋巴B细胞瘤Daudi悬浮液，将生物芯片在PBS中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi用含4%体积浓度的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定20分钟，再用含0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分钟，在磷酸缓冲液中涮洗1_2次后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi进行计数，计算捕获效率。
[0084]作为对照组2，将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的人淋巴瘤Jurkat T细胞悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去人淋巴瘤Jurkat T细胞悬浮液，将生物芯片在PBS中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的人淋巴瘤Jurkat T细胞用含4%体积浓度的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定20分钟后在磷酸缓冲液中涮洗1-2次，再用含0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟后在PBS中涮洗1_2次，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分钟后在PBS中涮洗1_2次，最后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的人淋巴瘤JurkatT细胞进行计数，计算捕获效率。
[0085]实验结果表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片的乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为67.4%。对照实验中的人淋巴B细胞瘤Daudi的捕获效率仅为10.2% ；人淋巴瘤Jurkat T细胞的捕获效率仅为4.7%。这些数据表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，具有闻的循环肿瘤细胞的捕获效率和灵敏度，富集后的循环肿瘤细胞活性高。
[0086]实施例5.[0087](I)将I X I平方厘米的石英片分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗10分钟，然后用Piranha溶液(浓H2S04/30%H202，V/V=7:3)清洗30分钟，再在去离子水中超声清洗10分钟，直至石英片洁净，最后用氮气充分吹干；点燃酒精灯，待火焰稳定后(5分钟左右)，用镊子夹取石英片置于酒精灯燃烧的火焰上，在石英片的表面沉积一层厚度为40微米的由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层；
[0088](2)将步骤(1)得到的沉积有由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的石英片置于培养皿(D=40mm，H=llmm)中，加入0.1mL四乙氧基硅烷液体，密封后置于通风橱中，I小时后将石英片取出，在由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的纳米烟灰颗粒的外表面化学气相沉积一层厚度为200纳米的二氧化硅外壳层；
[0089](3)将步骤(2)得到的石英片放置于管式炉中于600°C下煅烧2小时，除去二氧化硅外壳层内部的所述的纳米烟灰颗粒，在石英片的表面沉积得到厚度为5微米的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层，其中，纳米二氧化硅颗粒中的纳米二氧化硅颗粒的平均粒径为400纳米；
[0090](4)将步骤(3)得到的石英片用功率是200mW的氧等离子体处理5分钟左右，以在纳米二氧化硅颗粒的表面产生羟基；然后置于4%体积浓度的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷无水乙醇溶液中，室温 下反应30分钟左右；取出石英片并用乙醇润洗表面三次，再用二甲基亚砜润洗一次；[0091](5)将步骤(4)得到的石英片置于浓度为0.25mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液中，室温下放置45分钟左右，使4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯偶联到二氧化硅纳米颗粒的表面上；将石英片取出并用磷酸盐缓冲液充分润洗；
[0092](6)将步骤(5)得到的石英片置于5μ g/mL的链霉亲和素的磷酸盐缓冲液中，室温下放置反应30分钟左右，将石英片取出并用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0093](7)取25 μ L浓度为I μ g/mL的特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的磷酸盐缓冲液滴加到步骤(6)得到的石英片上，室温下放置30分钟左右，使特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体修饰在所述的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层的表面，其特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的修饰量不少于0.1 μ g/cm2，得到在水中具有优异的透明性的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片；透射光谱测试的结果表明，沉积二氧化硅层的石英片在水环境下的可见光波透过率为30~99%。
[0094](8)将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将生物芯片在硫酸缓冲液中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的乳腺癌细胞MCF7用质量浓度4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液溶液固定20分钟后，再用0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟，再用2 μ g/ml的DAPI磷酸盐缓冲液染色15分钟后，在PBS中涮洗1_2次后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕获效率。
[0095]作为对照组1，将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的人淋巴B细胞瘤Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行`反应的时间为30分钟左右)，吸去人淋巴B细胞瘤Daudi悬浮液，将生物芯片在PBS中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi用含4%体积浓度的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定20分钟，再用含0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分钟，在磷酸缓冲液中涮洗1_2次后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi进行计数，计算捕获效率。
[0096]作为对照组2，将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的人淋巴瘤Jurkat T细胞悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去人淋巴瘤Jurkat T细胞悬浮液，将生物芯片在PBS中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的人淋巴瘤Jurkat T细胞用含4%体积浓度的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定20分钟后在磷酸缓冲液中涮洗1-2次，再用含0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟后在PBS中涮洗1_2次，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分钟后在PBS中涮洗1_2次，最后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的人淋巴瘤JurkatT细胞进行计数，计算捕获效率。
[0097]实验结果表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片的乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为68.3%。对照实验中的人淋巴B细胞瘤Daudi的捕获效率仅为4.5% ;人淋巴瘤Jurkat T细胞的捕获效率仅为10.3%。这些数据表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，具有闻的循环肿瘤细胞的捕获效率和灵敏度，富集后的循环肿瘤细胞活性高。
[0098]实施例6.[0099](I)将面积为Icm2的云母片先后在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗10分钟，然后用piranha溶液(70%:30%(V/V)H2S04/H202)清洗30分钟，再在去离子水中超声清洗10分钟，直至云母片洁净，最后用氮气充分吹干；点燃煤油灯，待火焰稳定后(5分钟左右)，用镊子夹取云母片置于煤油燃烧的火焰上，在云母片的表面沉积一层厚度为500微米的由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层；
[0100](2)将步骤(1)得到的沉积有由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的云母片置于培养皿(D=40mm, H=Ilmm)中，加入0.1mL四甲氧基硅烷液体，密封后置于通风橱中，24小时后将云母片取出，在由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的纳米烟灰颗粒的外表面化学气相沉积一层厚度为100纳米的二氧化硅外壳层；
[0101](3)将步骤(2)得到的云母片放置于管式炉中于800°C下煅烧2小时，除去二氧化硅外壳层内部的所述的纳米烟灰颗粒，在云母片的表面沉积得到厚度为50微米的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层，其中，纳米二氧化硅颗粒中的纳米二氧化硅颗粒的平均粒径为400纳米；
[0102](4)将步骤(3)得到的云母片用功率是200mW的氧等离子体处理5分钟左右，以在纳米二氧化硅颗粒的表面产生羟基；然后置于4%体积浓度的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷无水乙醇溶液中，室温下反应30分钟左右；取出云母片并用乙醇润洗表面三次，再用二甲基亚砜润洗一次；
[0103](5)将步骤(4)得到的云母片置于浓度为0.25mM的4_马来酰亚胺基丁酸_N_琥珀酰亚胺酯(GMBS)的二甲基亚砜溶液中，室温下放置45分钟左右，使GMBS偶联到二氧化硅纳米颗粒的表面上；将云母片取出`并用磷酸盐缓冲液充分润洗；
[0104](6)将步骤(5)得到的云母片置于10μ g/mL的链霉亲和素的磷酸盐缓冲液中，室温下放置反应30分钟左右，将云母片取出并用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0105](7)取25 μ L浓度为I μ g/mL的特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的磷酸盐缓冲液滴加到步骤(6)得到的石英片上，室温下放置30分钟左右，使特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体修饰在所述的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层的表面，其特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的修饰量不少于0.1 μ g/cm2，得到在水中具有优异的透明性的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片；透射光谱测试的结果表明，沉积二氧化硅层的石英片在水环境下的可见光波透过率为30~99%。
[0106](8)将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将生物芯片在硫酸缓冲液中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的乳腺癌细胞MCF7用质量浓度4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液溶液固定20分钟后，再用0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟，再用2 μ g/ml的DAPI磷酸盐缓冲液染色15分钟后，在PBS中涮洗1_2次后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕
获效率。
[0107]作为对照组1，将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的人淋巴B细胞瘤Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去人淋巴B细胞瘤Daudi悬浮液，将生物芯片在PBS中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi用含4%体积浓度的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定20分钟，再用含0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分钟，在磷酸缓冲液中涮洗1_2次后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi进行计数，计算捕获效率。
[0108]作为对照组2，将步骤(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个孔内加入3毫升浓度为I X IO5个/mL的人淋巴瘤Jurkat T细胞悬浮液，置于细胞培养箱中(优选室温下放置进行反应的时间为30分钟左右)，吸去人淋巴瘤Jurkat T细胞悬浮液，将生物芯片在PBS中充分涮洗；然后将生物芯片捕获的人淋巴瘤Jurkat T细胞用含4%体积浓度的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定20分钟后在磷酸缓冲液中涮洗1-2次，再用含0.2%体积浓度的Triton X-100磷酸盐缓冲液穿膜10分钟后在PBS中涮洗1_2次，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分钟后在PBS中涮洗1_2次，最后用空气气流轻轻吹干；用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间部分10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的人淋巴瘤JurkatT细胞进行计数，计算捕获效率。
[0109]实验结果表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片的乳腺癌细胞MCF7的捕获效率为74.3%。对照实验中的人淋巴B细胞瘤Daudi的捕获效率仅为10.3% ；人淋巴瘤Jurkat T细胞的捕获效率仅为6.7%。这些数据表明，本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，具有闻的循环肿瘤细胞的捕获效率和灵敏度，富集后的循环肿瘤细胞活性高。
【权利要求】
1.一种用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，其特征是:所述的生物芯片是在基片的表面包覆有微米厚度的由纳米二氧化硅颗粒组成的二氧化硅层，在所述的二氧化硅层的表面修饰有特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体。
2.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，其特征是:所述的二氧化硅层的表面修饰有特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体，其特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的修饰量不少于0.1 μ g/cm2。
3.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，其特征是:所述的微米厚度的由纳米二氧化硅颗粒组成的二氧化硅层的厚度为I~50微米；所述的纳米二氧化硅颗粒中的纳米二氧化硅颗粒的粒径为20~900纳米。
4.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，其特征是:透射光谱测试的结果表明，所述的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片在水环境下的可见光波透过率为30~99%。
5.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片，其特征是:所述的基片选自玻璃片、石英片和云母片中的一种。
6.一种根据权利要求1~5任意一项所述的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片的制备方法，其特征是，所述的制备方法包括以下步骤: (1)将基片清洗干净，氮气吹干，然后将基片置于燃烧的火焰上，在基片的表面沉积一层由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层； (2)将步骤(1)得到的沉积有由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的基片置于含硅化合物所挥发的气体环境中，通过化学气相沉积，在由纳米烟灰颗粒组成的烟灰层的纳米烟灰颗粒的外表面沉积一层二氧化娃外壳层； (3)将步骤(2)得到的基片进行煅烧处理，除去二氧化硅外壳层内部的所述的纳米烟灰颗粒，在基片的表面沉积得到微米厚度的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层； (4)将步骤(3)得到的基片用氧等离子体处理，以在纳米二氧化硅颗粒的表面产生羟基；然后置于1-10%体积浓度的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷无水乙醇溶液中进行反应；取出基片并清洗； (5)将步骤(4)得到的基片置于浓度为0.1-0.5mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯的二甲基亚砜溶液中，室温下放置，使4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯偶联到纳米二氧化硅颗粒的表面上；将基片取出并清洗； (6)将步骤(5)得到的基片置于l-ΙΟμg/mL的链霉亲和素的磷酸盐缓冲液中，室温下放置进行反应，将基片取出并清洗； (7)将浓度为1-10μ g/mL的特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体的磷酸盐缓冲液滴加到步骤(6)得到的基片上，室温放置，使特异识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体修饰在所述的由纳米二氧化硅颗粒层组成的二氧化硅层的表面，得到所述的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是:所述的微米厚度的由纳米二氧化硅颗粒组成的二氧化硅层的厚度为I~50微米；所述的纳米二氧化硅颗粒中的纳米二氧化硅颗粒的粒径为20~900纳米。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是:所述的火焰是由动物油脂、植物油脂、蜡烛、酒精或煤油燃烧所产生的火焰。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是:所述的含硅化合物选自四氢化硅、四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷和四氯化硅所组成的组中的至少一种。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是:所述的进行煅烧处理的温度为400~1300℃。
【文档编号】C12M1/00GK103725589SQ201210382382
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月10日 优先权日:2012年10月10日
【发明者】王树涛, 杨高, 江雷 申请人:中国科学院化学研究所