一种新的循环肿瘤细胞富集技术及试剂盒制备方法
【专利摘要】一种新的循环肿瘤细胞富集技术及试剂盒制备方法，包括以下步骤：根据排列组合所有可能的CD45异构体蛋白序列信息，设计抗原，从而制作多种抗体，并筛选出一种能够识别所有CD45异构体的抗体，将其偶联到磁珠上，进而从血液中捕获所有白细胞；采集10ml外周静脉血；用渗透裂解液裂解除去红细胞；混合设计的特异抗体、磁珠和剩下的无红细胞的细胞液，分离出白细胞；得到含较高浓度循环肿瘤细胞的细胞群。本发明采用负收集技术，使得循环肿瘤细胞所占比例大幅度提高，方便快速准确的检测，同时由于采用了负筛选手段，循环肿瘤细胞无损失的保留下来，防止了某些循环肿瘤细胞的损失造成肿瘤疾病无法得到检测，耽误患者治疗。
【专利说明】一种新的循环肿瘤细胞富集技术及试剂盒制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学领域，具体为一种新的循环肿瘤细胞富集技术及试剂盒制备方法。
【背景技术】
[0002]循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因。近年来，随着检测技术的不断改进，CTCs检测作为一种新型的非侵入性诊断工具，在早期发现患者术后复发与远处转移、评估疗效与预后等方面的应用价值已成为临床研究的热点。
[0003]分子生物学及临床研究显示，肿瘤的侵袭和微转移很可能在肿瘤发生的早期就已出现，而目前临床肿瘤的发现和诊断仍高度依赖于影像学及血清肿瘤标志物的检查，难以早期发现肿瘤的转移或复发，也难以及时反映疗效。因此，早期发现微转移不仅对肿瘤复发和预后的判断有重要意义，而且对指导临床治疗也有很大价值。大量研究显示，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)的检测有助于早期发现肿瘤的微转移、监测术后复发、评估疗效及预后，以及选择合适的个体化治疗。
[0004]循环肿瘤细胞是进入人体外周血的肿瘤细胞。对其分离和富集将为监测患者肿瘤状况起到重要的医学作用。当前的循环肿瘤细胞富集主要采用正向分选的方法，通过抗体和磁珠或者流式细胞仪直接分选外周血中单个核细胞的肿瘤细胞，该方法存在着缺点:1、外周血单个核细胞中的肿瘤细胞数量极低，约百万分之一，信号微弱，分析难度大，易造成误差；2、单克隆抗体筛 选，选择能力有限，抗体无法识别的肿瘤细胞被忽略，影响检测结果。
【发明内容】
[0005]本发明所解决的技术问题在于提供一种新的循环肿瘤细胞富集技术及试剂盒制备方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0006]本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现:
[0007]一种新的循环肿瘤细胞富集技术，包括以下步骤:
[0008](1)通过排列组合所有可能的⑶45异构体蛋白序列，得到一个抗体能够识别所有的⑶45异构体；
[0009](2)通过制作多种抗体，从而筛选出能够识别所有⑶45异构体的抗体，将其偶联到磁珠上，进而从血液中捕获所有白细胞，其中抗原序列包括有胞外区域的全长，不同外显子拼接的胞外区域全长，旨在筛选出一种抗体能够识别他们的共同区段，之所以不单独采用橙色蛋白区域是因为我们想通过更真实的模拟细胞膜外部分的蛋白构象，直接用多种CD45异构体抗原去筛选我们的抗体，从而得到的抗体能够在真实水平下直接识别CD45多种异构体；
[0010](3)将血液中分离到的白膜层细胞中的占大多数的CD45+的细胞筛选掉，得到的残余细胞中，循环肿瘤细胞所占比例大幅度提高，从而能快速的获得高浓度的循环肿瘤细胞，方便快速准确的检测。
[0011]一种新的循环肿瘤细胞试剂盒制备方法，包括以下步骤:
[0012](1)采集外周血10ml于肝素抗凝管中，加入渗透裂解液中，在室温下孵育；
[0013]其中渗透裂解液成为:
[0014]NH4C1
[0015]NaHC03
[0016]EDTA
[0017](2)对进行离心；
[0018](3)去掉上清，将得到细胞沉淀用无菌的生理盐水洗一遍，重新离心，搜集细胞沉淀；
[0019](4)按照 Sulfo-NHS-LC-Biotin Biotinylation 方法对 CD45 抗体进行生物素标记；
[0020](5)加入少量无菌PBS于细胞沉淀，轻轻吹打以重悬细胞，同时加入生物素标记的⑶45抗体，混合均匀，在室温下孵育；
[0021](6)在混合物中加入链霉亲和素偶联的磁珠，用移液器吹打，使得混合液混合均匀；
[0022](7)用带有多级探头的电磁设备搜集磁珠，与磁珠偶联的链霉亲和素可以高度特异性地和生物素结合，通过电磁设备搜集到的磁珠上有大量含CD45抗原的白细胞；
[0023](8)将剩余的PBS悬液进行离心，搜集循环肿瘤细胞沉淀；
[0024](9)根据不同的实验目的，对循环肿瘤细胞做进一步处理，进而制成试剂盒。
[0025]综上所述，本发明有益效果:
[0026]本发明采用负收集技术，将血液中分离到的白膜层细胞中的占大多数的CD45+的细胞筛选掉，得到的残余细胞中，循环肿瘤细胞所占比例大幅度提高，从而能快速的获得高浓度循环肿瘤细胞的细胞，方便快速准确的检测，同时由于采用了负筛选手段，循环肿瘤细胞无损失的保留下来，防止了某些循环肿瘤细胞的损失造成肿瘤疾病无法得到检测，耽误患者治疗。
【具体实施方式】
[0027]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0028]实施例1
[0029]一种新的循环肿瘤细胞富集技术，包括以下步骤:
[0030](1)排列组合所有可能的CD45异构体蛋白序列，通过仔细分析，制备相应的多种抗原，从而得到多种抗体；
[0031](2)通过制作多种抗体，从而筛选出能够识别所有CD45异构体的抗体，将其偶联到磁珠上，进而从血液中捕获所有白细胞，其中抗原序列包括有胞外区域的全长，不同外显子拼接的胞外区域全长，旨在筛选出一种抗体能够识别他们的共同区段，之所以不单独采用橙色蛋白区域是因为我们想通过更真实的模拟细胞膜外部分的蛋白构象，直接用多种CD45异构体抗原去筛选我们的抗体，从而得到的抗体能够在真实水平下直接识别CD45多种异构体；
[0032](3)将血液中分离到的白膜层细胞中的占大多数的CD45+的细胞筛选掉，得到的残余细胞中，循环肿瘤细胞所占比例大幅度提高，从而能快速的获得高浓度的循环肿瘤细胞，方便快速准确的检测。
[0033]一种新的循环肿瘤细胞试剂盒制备方法，包括以下步骤:
[0034](1)采集外周血10ml于肝素抗凝管中，加入30ml渗透裂解液中，在室温22°C孵育lOmin ；
[0035]其中渗透裂解液成分为:
[0036]NH4C1150mM
[0037]NaHC0312mM
[0038]EDTA0.1mM
[0039](2)在250g / 1500rpm的转速下对渗透裂解液进行离心5min ；
[0040](3)去掉上清，将得到细胞沉淀用0.9% NaCl无`菌的生理盐水洗一遍，重新离心，搜集细胞沉淀；
[0041](4)按照 Sulfo-NHS-LC-Biotin Biotinylation 方法对 CD45 抗体进行生物素标记；
``[0042](5)加入少量无菌PBS于细胞沉淀，轻轻吹打以重悬细胞，同时加入生物素标记的⑶45抗体,使其终浓度为0.lmg / ml,混合均匀,在室温下孵育15min ；
[0043](6)在混合物中加入链霉亲和素偶联的磁珠，用移液器吹打，吹打5次以上，使得混合液混合均匀；
[0044](7)用带有多级探头的电磁设备搜集磁珠，与磁珠偶联的链霉亲和素可以高度特异性地和生物素结合，通过电磁设备搜集到的磁珠上有大量含CD45抗原的白细胞；
[0045](8)将剩余的PBS悬液在250g的转速下离心，搜集循环肿瘤细胞沉淀；
[0046](9)根据不同的实验目的，对循环肿瘤细胞做进一步处理，进而制成试剂盒。
[0047]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【权利要求】
1.一种新的循环肿瘤细胞富集技术，其特征是，包括以下步骤:(1)分析所有可能的CD45异构体蛋白序列，设计多个抗原，制备多个抗体；(2)通过制作多种抗体，从而筛选出能够识别所有CD45异构体的抗体，将其偶联到磁珠上，进而从血液中捕获所有白细胞，其中抗原序列包括有胞外区域的全长，不同外显子拼接的胞外区域全长，旨在筛选出一种抗体能够识别他们的共同区段，之所以不单独采用橙色蛋白区域是因为我们想通过更真实的模拟细胞膜外部分的蛋白构象，直接用多种CD45异构体抗原去筛选我们的抗体，从而得到的抗体能够在真实水平下直接识别CD45多种异构体；(3)将血液中分离到的白膜层细胞中的占大多数的CD45+的细胞筛选掉，得到的残余细胞中，循环肿瘤细胞所占比例大幅度提高，从而能快速的获得高浓度的循环肿瘤细胞。
2.一种新的循环肿瘤细胞试剂盒制备方法，其特征是，包括以下步骤:(1)采集外周血10ml于肝素抗凝管中，加入渗透裂解液中，在室温下孵育；其中渗透裂解液成分为:NH4C1NaHC03EDTA(2)对渗透裂解液进行离心；(3)去掉上清，将得到细胞沉淀用无菌的生理盐水洗一遍，重新离心，搜集细胞沉淀；(4)按照Sulfo-NHS-LC-BiotinBiotinylation方法对⑶45抗体进行生物素标记；(5)加入少量无菌PBS于细胞沉淀，轻轻吹打以重悬细胞，同时加入生物素标记的⑶45抗体，混合均匀，在室温下孵育；(6)在混合物中加入链霉亲和素偶联的磁珠，用移液器吹打，使得混合液混合均匀；(7)用带有多级探头的电磁设备搜集磁珠，与磁珠偶联的链霉亲和素可以高度特异性地和生物素结合，通过电磁设备搜集到的磁珠上有大量含CD45抗原的白细胞；(8)将剩余的PBS悬液进行离心，搜集循环肿瘤细胞沉淀；(9)根据不同的实验目的，对循环肿瘤细胞做进一步处理，进而制成试剂盒。
【文档编号】C12N5/09GK103725648SQ201310470082
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年9月28日 优先权日:2013年9月28日
【发明者】张万明, 易银沙, 朱海强, 李娜, 刘彩云, 袁炳秋, 吴小宁 申请人:长沙赢润生物技术有限公司