黄蘑菇标准化组分制法及其在肝癌治疗中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种黄蘑菇标准化组分制法，该方法包括以下步骤：⑴将黄蘑菇干燥粉碎后进行水提并离心收集菌渣，该菌渣用丙酮提取并离心收集滤液；滤液经减压浓缩至膏状，即得丙酮提取物；⑵丙酮提取物用正己烷-乙酸乙酯混合液溶解后过滤，得到含丙酮提取物的样品溶液；含丙酮提取物的样品溶液在制备色谱上分离，即得Fr1、Fr2、……、Fr13、Fr14共14个标准化组分样品；⑶将14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪进行体外抗肝癌细胞模型筛选从而确定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14号标准化组分具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。本发明不但工艺简单，而且易于实施。同时，本发明所得的活性组分可应用于肝癌治疗中。
【专利说明】黄蘑菇标准化组分制法及其在肝癌治疗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物化学及生物医药【技术领域】，尤其涉及黄蘑菇标准化组分制法及其在肝癌治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一。根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。我国肝癌发病人数约占全球的半数以上，发病年龄趋于年轻化。目前我国肝癌年死亡率为20/10万左右，位居我国各种恶性肿瘤死亡率的第2位，并且近10年来一直呈上升趋势。肝癌已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容忽视。[0003]研究表明，一些中药复方或单味药的有效成分能诱导肿瘤细胞凋亡，其抗癌疗效与中药诱导肿瘤细胞凋亡有关。高等真菌中普遍存在多糖、留醇、生物碱、萜类、酶类具有提高人体免疫力、抗肿瘤、抗菌等生物功效的活性组分；其中1，3-β -D-葡聚糖被鉴定为抗肿瘤、抗艾滋病或免疫刺激性化合物；单萜、倍半萜、双萜、三萜和类固醇具有保肝、排毒、降血压和胆固醇等医药活性；真菌多糖是具有明显的协同作用的免疫增强剂，如香菇多糖具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性，免疫作用和对胆固醇的溶解作用，并能使载癌状态和因使用化疗药物而降低的活体免疫机能恢复，与各种药物亦有协同作用。在高等真菌中还存在许多结构新颖的物质，这些物质具有显著的生理功效，如从口蘑、杨树菇、金针菇、斑玉蕈等高等真菌中分离得到的各种凝集素，已被证实具有重要的医学功能。
[0004]肝癌起病隐匿，病程进展快，手术切除率低，对常规放化疗手段缺乏敏感，死亡率高。因此，从高等真菌中寻找新的抗肝癌治疗药物意义重大。
[0005]黄蘑菇是生长于青藏高原的珍稀野生食药用菌。目前有限的定性研究表明，黄绿蜜环菌子实体中含有较丰富的蛋白质、氨基酸、糖类、生物碱和少量有机酸、黄酮、强心苷、甾体三萜类、苷类、皂苷、挥发油、香豆素萜类、鞣质、酚类化合物等，该类化合物具有抗流感、防治神经炎、脚气病、促进儿童发育、抗氧化及抗肿瘤等生物活性。
[0006]制备液相色谱是近些年发展起来的分离纯化技术。随着天然药物现代化的迅速发展，制备液相色谱作为一种快速高效的分离标准化组分的技术而备受天然产物化学各领域的青睐。目前很多样品组分只能用制备液相色谱技术进行分离纯化，正相制备型高效液相色谱是制备色谱中应用较多的分离质量均一、稳定、可靠组分的方法之一。
[0007]中国专利申请CN 200910154901.5《生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法》涉及了黄绿蜜环菌生物转化合成白桦脂酸；中国专利申请CN200710069803.2《一种黄绿蜜环菌纤溶酶及其生产方法》涉及了黄绿蜜环菌代谢合成纤溶酶；中国专利申请CN200710066667.1《一种微生物细胞生物转化对羟基苯甲醇合成天麻素的方法》涉及了黄绿蜜环菌通过生物转化合成天麻素；中国专利申请CN200610155189.7《一种黄绿蜜环菌及其培养方法与应用》、在审专利《一种抗癌的黄绿蜜环菌多糖及提取工艺》、《一种黄绿蜜环菌的深层发酵及其应用》主要涉及黄绿蜜环菌菌丝体培养及多糖提取工艺。并未涉及黄绿蜜环菌子实体化学成分。上述文献关于黄绿蜜环菌的研究，主要集中在生物转化上，对黄绿蜜环菌子实体化学成分的研究很少。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易于实施的黄蘑菇标准化组分制法。
[0009]本发明所要解决的另一个技术问题是提供该黄蘑菇标准化组分制法在肝癌治疗中的应用。
[0010]为解决上述问题，本发明所述的黄蘑菇标准化组分制法，包括以下步骤:
⑴将黄蘑菇经干燥粉碎后，按Ig:4mL^20 mL的料液比用分析纯水在4(T90°C提取3次，每次flOh，并离心收集菌渣，该菌渣用丙酮按Ig:lmL^20 mL的料液比在1(T80°C提取3次，每次5~72h，并离心收集滤液；所述滤液经减压浓缩至膏状，即得丙酮提取物；
⑵所述丙酮提取物中加入其体积的1飞倍正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样 品溶液；所述含丙酮提取物的样品溶液在以ΙΟμπι硅胶为分离基质的制备色谱上分离，即得Frl、Fr2、……、Frl3、Frl4共14个标准化组分样品；
⑶将所述14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选:
①确认iCelligence测试系统正确连接，37°C、5%C02培养箱工作正常；
②8孔细胞板内按150μ L/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线；所述培养基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基；
③将所述14个标准化组分样品中的每个组分样品用DMSO配制成浓度为5mg/mL的样品溶液；
④将对数生长期的人肝癌细胞H印G2，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于所述培养基中，并将细胞浓度调至2.85 X IO4个/mL，得到对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液，并按345 μ L/孔、每孔10000个细胞的量将所述对数生长期的人肝癌细胞H印G2悬液接种入所述8孔细胞板的相应孔中，室温放置30 min ；
⑤将所述14个标准化组分样品分两批按每孔加5μ L所述浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345 μ L所述对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液的量接种入所述8孔细胞板的相应孔中，并置于所述iCelligence测试台，放入所述培养箱中开始检测；45 h后得到两张黄蘑菇抗肝癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数(cell index)，横坐标为实时细胞增殖动态效应(RTCA)；
⑥根据所述两张黄蘑菇抗肝癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14号标准化组分具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
[0011]所述步骤⑴中减压浓缩的条件是指真空度为0.03、.1 MPa，温度为3(T80 °C。
[0012]所述步骤⑵中正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按I mL:0.1 mL~10 mL的比例混合的溶液。[0013]所述步骤⑵中制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为260X50 mm ;采用A为正己烷、B为乙酸乙酯的二元流动相体系进行分离:0~15 min, 100%A~100%A ; 15~35 min,60%A~60%A ;35~50 min，0%A~0%A ;检测波长为260 nm ;上样量为1.0 g。
[0014]如上所述的黄蘑菇标准化组分制法所得的活性组分在肝癌治疗中的应用，其特征在于:该活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。
[0015]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明采用溶剂提取、离心、工业制备色谱等常规方法，从黄蘑菇中分离得到了具有抗肝癌活性的标准化组分(参见图1、图2)，不但工艺简单，而且易于实施。
[0016]2、本发明利用iCELLigence系统检测，可实时动态检测细胞贴壁和增殖过程，提供高信息量的细胞效应图谱，提供大量、重要的动态反应信息；无标记、无创伤的电子检测不会干扰细胞生长和分析；可高准确/精确度的定量衡量细胞生长，提供高于2个数量级的动态范围；整个实验过程自动收集数据，实时分析，大大改善仅仅在最终点分析的结果；在培养孔中检测细胞质量，达到了活细胞品质控制的目的(参见图3、图4)。
[0017]3、本发明以细胞生长曲线为基本指标判定标准化组分对贴壁、繁殖等细胞生理活性的影响，结果直观、易判断；所得的活性组分可用于研发制备抗肝癌治疗药物。
[0018]4、本发明拓展了抗肝癌药物的原料来源，扩大了黄蘑菇的用途，使黄蘑菇成为抗肝癌药物的有效组分原料，显著提高黄蘑菇的附加值。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0020]图1为本发明黄蘑菇标准化组分的色谱分离图A。
[0021]图2为本发明黄蘑菇标准化组分的色谱分离图B。
[0022]图3为本发明黄蘑菇标准化组分的抗肝癌活性检测图A。
[0023]图4为本发明黄蘑菇标准化组分的抗肝癌活性检测图B。
【具体实施方式】
[0024]实施例1 黄蘑菇标准化组分制法，包括以下步骤:
⑴将黄蘑菇经干燥粉碎后，按Ig:4mL的料液比用分析纯水在40°C提取3次，每次10h，并离心收集菌渣，该菌渣用丙酮按Ig: ImL的料液比在10°C提取3次，每次72h，并离心收集滤液；滤液在真空度为0.03 MPa、温度为30°C的条件下经减压浓缩至膏状，即得丙酮提取物。
[0025]⑵丙酮提取物中加入其体积的I倍正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；含丙酮提取物的样品溶液在以ΙΟμπι硅胶为分离基质的制备色谱上分离，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Frl0、Fr 11、Fr 12、Fr 13、Fr 14共14个标准化组分样品。
[0026]其中:
制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为260X50 mm;采用A为正己烷、B为乙酸乙酯的二元流动相体系进行分离:0~15 min，100%A~100%A ;15~35 min，60%A~60%A ;35~50 min,0%Α、%Α ;检测波长为260 nm ;上样量为1.0 g。正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按I mL:0.1 mL的比例混合的溶液。
[0027]⑶将14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选:
①确认iCelligence测试系统正确连接，37°C、5%C02培养箱工作正常。
[0028]②8孔细胞板内按150 μ L/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线。[0029]其中:培养基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基。
[0030]③将14个标准化组分样品中的每个组分样品用DMSO配制成浓度为5mg/mL的样品溶液(即每mLDMSO中含有5 mg组分样品)。
[0031]④将对数生长期的人肝癌细胞H印G2，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于培养基中，并将细胞浓度调至2.85 X IO4个/mL，得到对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液，并按345 μ L/孔、每孔10000个细胞的量将对数生长期的人肝癌细胞ifepG2悬液接种入8孔细胞板的相应孔中，室温放置30 min。
[0032]⑤将14个标准化组分样品分两批按每孔加5 μ L所述浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345 μ L对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液的量接种入8孔细胞板的相应孔中，并置于iCelligence测试台，放入培养箱中开始检测；45 h后得到两张黄蘑菇抗肝癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数(cell index)，横坐标为实时细胞增殖动态效应(RTCA)。
[0033]⑥根据两张黄蘑菇抗肝癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第7、第8、第9、第10、第U、第13以及第14号标准化组分具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
[0034]实施例2 黄蘑菇标准化组分制法，包括以下步骤:
⑴将黄蘑菇经干燥粉碎后，按Ig:20 mL的料液比用分析纯水在90°C提取3次，每次Ih,并离心收集菌渣，该菌渣用丙酮按Ig:20 mL的料液比在80°C提取3次，每次5h，并离心收集滤液；滤液在真空度为0.1 MPa、温度为80°C的条件下经减压浓缩至膏状，即得丙酮提取物。
[0035]⑵丙酮提取物中加入其体积的6倍正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过
0.45 μ m的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；含丙酮提取物的样品溶液在以ΙΟμπι硅胶为分离基质的制备色谱上分离，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Frl0、Fr 11、Fr 12、Fr 13、Fr 14共14个标准化组分样品。
[0036]其中:
制备色谱分离的条件同实施例1。正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按I mL: 10 mL的比例混合的溶液。
[0037]⑶将14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按实施例1所述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选，确定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14号标准化组分具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
[0038]实施例3 黄蘑菇标准化组分制法，包括以下步骤:⑴将黄蘑菇经干燥粉碎后，按Ig:12 mL的料液比用分析纯水在65°C提取3次，每次
5.5h，并离心收集菌渣，该菌渣用丙酮按Ig: IOmL的料液比在45°C提取3次，每次38h，并离心收集滤液；滤液在真空度为0.06 MPa、温度为55°C的条件下经减压浓缩至膏状，即得丙酮提取物。
[0039]⑵丙酮提取物中加入其体积的3.5倍正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；含丙酮提取物的样品溶液在以10 μ m硅胶为分离基质的制备色谱上分离，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Fr IO、Fr 11、Fr 12、Fr 13、Fr 14共14个标准化组分样品。
[0040]其中:
制备色谱分离的条件同实施例1。正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按I mL:5 mL的比例混合的溶液。
[0041]⑶将14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按实施例1所述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选，确定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14号标准化组分具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
[0042]上述实施例广3中黄蘑菇标准化组分制法所得的活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂应用于肝癌治疗中。
【权利要求】
1.黄蘑菇标准化组分制法，包括以下步骤: ⑴将黄蘑菇经干燥粉碎后，按Ig:4mL^20 mL的料液比用分析纯水在4(T90°C提取3次，每次flOh，并离心收集菌渣，该菌渣用丙酮按Ig:lmL^20 mL的料液比在1(T80°C提取3次，每次5~72h，并离心收集滤液；所述滤液经减压浓缩至膏状，即得丙酮提取物； ⑵所述丙酮提取物中加入其体积的1飞倍正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；所述含丙酮提取物的样品溶液在以ΙΟμπι硅胶为分离基质的制备色谱上分离，即得Frl、Fr2、……、Frl3、Frl4共14个标准化组分样品； ⑶将所述14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选: ①确认iCelligence测试系统正确连接，37°C、5%C02培养箱工作正常； ②8孔细胞板内按150μ L/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线；所述培养基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基； ③将所述14个标准化组分样品中的每个组分样品用DMSO配制成浓度为5mg/mL的样品溶液； ④将对数生长期的人肝癌细胞H印G2，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于所述培养基中，并将细胞浓度调至2.85 X IO4个/mL，得到对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液，并按345 μ L/孔、每孔10000个细胞的量将所述对数生长期的人肝癌细胞H印G2悬液接种入所述8孔细胞板的相应孔中，室温放置30 min ；` ⑤将所述14个标准化组分样品分两批按每孔加5μ L所述浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345 μ L所述对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液的量接种入所述8孔细胞板的相应孔中，并置于所述iCelligence测试台，放入所述培养箱中开始检测；45 h后得到两张黄蘑菇抗肝癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数，横坐标为实时细胞增殖动态效应； ⑥根据所述两张黄蘑菇抗肝癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14号标准化组分具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
2.如权利要求1所述的黄蘑菇标准化组分制法，其特征在于:所述步骤⑴中减压浓缩的条件是指真空度为0.03~0.1 MPa，温度为30~80 °C。
3.如权利要求1所述的黄蘑菇标准化组分制法，其特征在于:所述步骤⑵中正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按I mL:0.1 mL~10 mL的比例混合的溶液。
4.如权利要求1所述的黄蘑菇标准化组分制法，其特征在于:所述步骤⑵中制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为260X50 mm;采用A为正己烷、B为乙酸乙酯的二元流动相体系进行分离:0~15 min，100%A~100%A ;15~35 min，60%A~60%A ;35~50 min，0%A~0%A ;检测波长为260 nm ;上样量为1.0 g。
5.如权利要求1所述的黄蘑菇标准化组分制法所得的活性组分在肝癌治疗中的应用，其特征在于:该活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。
【文档编号】C12Q1/02GK103494844SQ201310469545
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】王启兰, 党军, 陶燕铎, 梅丽娟, 史强强, 顾朋嫒, 马琳, 李园园 申请人:中国科学院西北高原生物研究所