马立克氏病抗性鸡的快速检出方法
【专利摘要】本发明公开了一种马立克氏病抗性鸡的快速检出方法，采用半巢式PCR对BF基因可变剪接外显子7进行两轮扩增，两轮扩增的引物序列分别为SEQ.ID.No.1和2、3和4。第一轮扩增中，对于MD易感霞烟鸡A5和B21，可扩增到195bp和162bp两个片段；而对于MD抗性霞烟鸡A11,C23,D12和D8，只能扩增到195bp片段。第二轮扩增中，对于MD易感霞烟鸡A5和B21，可扩增到141bp片段；而对于MD抗性霞烟鸡A11,C23,D12和D8，不能扩增到141bp片段。因此，本发明可简单、快速、方便地鉴定MD抗性/易感单倍体，进而鉴定鸡的MD抗性/易感。
【专利说明】马立克氏病抗性鸡的快速检出方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及马立克氏病，尤其是一种马立克氏病(Marek’s disease，MD)抗性鸡的快速检出方法。
【背景技术】
[0002]Dalgaard 等利用 PCR 法扩增白来航鸡 B21、B13。、BffUB12, B19 和 B15 单倍体 BF mRNA可变剪接外显子7，结果发现B12、B19和B15这些MD易感的单倍体BF mRNA部分缺少外显子7 (即单倍体BF中BF2mRNA缺少外显子7而BFlmRNA不缺少)，而B21及与B21MD抗性类似的B13°、BW1的BF mRNA都不缺少外显子7(即单倍体BF中BF2和BFlmRNA都不缺少外显子7)。尽管如此，但在检测中，该项技术难度较大，因为有时目的片段的量太少，电泳结果太弱，不容易判断。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种简单、快速、方便的马立克氏病抗性鸡的快速检出方法。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:马立克氏病抗性鸡的快速检出方法，采用半巢式PCR对BF基因可变剪接外显子7进行两轮扩增，
[0005]第一轮扩增的引物序列为外上游引物5'-GCAGGGAAGAAGGGGAAGGG-3'和外下游引物 5'-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3' ；`
[0006]第二轮扩增的引物序列为内上游引物5'-TACAACATTGCGCCCGGG-3'和内下游引物5'-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3'。
[0007]第一轮和第二轮扩增PCR反应体系和反应条件分别为:
[0008]第一轮扩增PCR 反应体系:10 X PCR Buffer5.0 μ L，cDNA 模板 5.0 μ L，25mM 外上游引物 1.0μ L，25mM 外下游引物 l.0yL, 1.5U Taq 酶 0.6 μ L，IOmM dNTP Mixturel.0 μ L,dd Η2036.4μ L，共 50μ L ；
[0009]第一轮扩增PCR反应条件:95 V 5min ；随后进行35个循环，每个循环包括950C 30s,61°C 30s, 72°C 45s ;最后 72°C IOmin ；
[0010]第二轮扩增PCR 反应体系:10 X PCR Buffer5.0 μ L，DNA 模板 5.0 μ L，25mM 内上游引物 1.0yL，25mM 内下游引物 1.0yL，1.5U Taq 酶 0.6 μ L，IOmM dNTP Mixturel.0 μ L, ddΗ2036.4 μ L，共50 μ L ；DNA模板来自第一轮PCR扩增产物；
[0011]第二轮扩增PCR反应条件:95 V 5min ；随后进行35个循环，每个循环包括950C 30s, 520C 30s, 72°C 45s ;最后 72°C IOmin0
[0012]针对目前马立克氏病抗性鸡检测技术难度大、结果难判断的问题，发明建立了马立克氏病抗性鸡的快速检出方法，采用半巢式PCR对BF基因可变剪接外显子7进行两轮扩增
[0013]在第一轮扩增中，对于MD易感霞烟鸡A5和B21,不管是哪个脏器或淋巴白细胞，都能扩增到195bp (BF基因第6外显子、第7外显子、第8外显子以及3'非翻译区3' -UT的编码外显子)和162bp (BF基因第6外显子、第8外显子以及3'非翻译区3'-UT的编码外显子)两个片段，经序列测定和参考GenBank上的相关序列，证实162bp片段实际上是195bp片段剪接掉可变外显子7 (恰好是33个碱基对)的部分；而对于MD抗性霞烟鸡An，C23, D12和队，不管是哪个脏器或淋巴白细胞，都只能扩增到195bp片段。由此可见，MD易感的BF基因单倍体A5和B21缺少外显子7，而A11, C23, D12和D8这些MD抗性的BF基因单倍体不缺少外显子7。这种差别为MD抗性BF基因单倍体的检出提供了可能。虽然如此，但在实践检测中，这项技术难度仍然较大，因为有时162bp片段的量太少，电泳结果太弱，不容易判断。因此，第二轮扩增显得异常重要。
[0014]在第二轮扩增中，对于MD易感霞烟鸡A5和B21，不管是哪个脏器或淋巴白细胞，都能扩增到141bp(BF基因部分第6外显子、第8外显子以及3'非翻译区3'_UT的编码外显子)片段，经序列测定和参考GenBank上的相关序列，证实141bp片段实际上是前述162bp片段去掉前面的21个碱基所剩余的部分；而对于MD抗性霞烟鸡A11, C23, D12和D8,不管是哪个脏器或淋巴白细胞，都不能扩增到141bp片段。因此，可以根据“有和无”141bp片段来判断广西三黄鸡BF基因单倍体可变剪接外显子7的缺失与否，进而确定其MD易感或抗性。
[0015]本发明可简单、快速、方便地鉴定MD抗性/易感单倍体，进而鉴定鸡的MD抗性/易感，但针对BF基因纯种鸡和杂种鸡，鉴定的具体结果不尽相同。
[0016]对于BF基因纯种的鸡，如果本发明半巢式PCR法检测结果为阳性(有一条141bp的目的带，且目的带测序结果确认为BF基因的部分片段)，那么此鸡单倍体为MD易感BF单倍体，此鸡相应地为MD易感鸡，如【具体实施方式】的霞烟鸡A5和B21 ;如果检测结果为阴性(无141bp的目的带，且第一次PCR有大小为195bp的目的带，此目的带测序结果确认为BF基因的部分片段)，那么此鸡单倍体为MD抗性BF单倍体，此鸡相应地的为MD抗性鸡，如【具体实施方式】的霞烟鸡A11, C23, D12和D8。
[0017]对于BF基因杂种的鸡，如果本发明半巢式PCR法检测结果为阳性，那么此鸡一定有一条单倍体为MD易感BF单倍体，`但无法确定另一条单倍体是BF抗性还是BF易感单倍体，因而无法确定此杂种鸡是MD抗性鸡还是易感鸡；如果检测结果为阴性，那么此杂种鸡的两条单倍体一定都是MD抗性BF单倍体，此杂种鸡相应地的为MD抗性鸡。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是半巢式PCR扩增BF基因外显子7的示意图。
[0019]图2第一轮PCR扩增A5、B21、An、C2^D1JPD8PBLs BF基因可变剪接部分——外显子7的产物，图中M为pUC19DNA/Msp I (Hpa I I )Marker ；1, 3分别为样品A5和B21扩增的195bp和162bp片断；2，4，5，6分别为样品A11, C23, D12和D8扩增的195bp片断；7为阴性对照。
[0020]图3是第一轮PCR扩增D12和A5肝脏、脾脏、心脏BF基因可变剪接部分——外显子7的产物，图中=M为pUC19DNA/Msp I (Hpa I I ) Marker; I, 2，3分别为样品D12的肝脏、脾脏、心脏扩增的195bp片断；4，5，6分别为样品A5的肝脏、脾脏、心脏扩增的195bp和162bp片断。
[0021]图4是第一轮扩增霞烟鸡A5和D12PBLs中的BF基因外显子7PCR产物的核苷酸序列，图中:下划线对应的核酸序列为扩增195bp和\或162bp片断的引物.33个星号表示195bp片段可变剪接掉的外显子7 (恰好是33个碱基对)部分。
[0022]图5是第二轮PCR扩增A5, B21, AmC23J^PD8PBLs BF基因可变剪接部分——外显子7的产物，图中:M为pUC19DNA/Msp I (Hpa I I ) Marker; I, 3分别为样品A5和B21扩增的141bp片断；2，4，5，6分别显示样品A11, C23, D12和D8无141bp片断扩增；7为阴性对照。
[0023]图6是第二轮PCR扩增A5和D12内脏BF基因可变剪接部分——外显子7的产物，图中:M为pUC19DNA/Msp I (Hpa I I ) Marker; I, 2，3分别显示样品D12的肝脏、脾脏、心脏无141bp片断扩增；4，5，6分别为样品A5的肝脏、脾脏、心脏扩增的141bp片断。
【具体实施方式】
[0024]1.试验步骤
[0025]I)样品RNA的提取
[0026]选取4羽MD抗性(BF基因)纯合霞烟鸡(A11, C23, D8和D12)和2羽MD易感(BF基因)纯合霞烟鸡(A5和B21)的肝脏、脾脏、心脏、PBLs (外周血淋巴细胞)，按产品说明书方法使用Trizol RNA抽提试剂盒提取上述组织、器官的总RNA，并溶入35 μ L无RNA酶的双蒸水中，立即反转录合成cDNA。
[0027]2) cDNA 的合成
[0028]取RNA样品14.5 μ L，加入25pm BF外(内)下游引物I μ L，70 V 5min，置于一20°C 5min ;然后加入 5μ L RT-Buffer (5 X), 2 μ L dNTP (IOmM), 200U M-MLV 逆转录酶，25URnasin并混匀，37°C放置lh，96°C作用5min，最终得25 μ L cDNA，保存于一 20°C备用。
[0029]3)半巢式PCR第一轮扩增BF基因可变剪接部分——外显子7
[0030]根据GenBank数据库中提供的BF基因的mRNA序列，运用01igo6.31和Primer Premier5.0软件在BF基因保守区域设ii 对外引物:外上游引物5' -GCAGGGAAGAAGGGGAAGGG-3' (见序列表SEQ.1D.N0.1 )，外(内)下游引物(外下游引物与内下游引物相同)5'-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3' (见序列表 SEQ.1D.N0.2)，用于扩增 BF基因的第6外显子、第7外显子、第8外显子以及3'非翻译区3'-UT的编码外显子(图1)，预计扩增片段约为195bp (扩增外显子7没有被剪接掉的BF mRNA的产物)和162bp (扩增外显子7被剪接掉的BF mRNA的产物)，引物合成由大连宝生物有限公司完成。
[0031]PCR反应体系:
[0032]
【权利要求】
1.一种马立克氏病抗性鸡的快速检出方法，其特征在于采用半巢式PCR对BF基因可变剪接外显子7进行两轮扩增， 第一轮扩增的引物序列为外上游引物5' -GCAGGGAAGAAGGGGAAGGG-3 '和外下游引物5'-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3' ； 第二轮扩增的引物序列为内上游引物5' -TACAACATTGCGCCCGGG-3'和内下游引物5'-GGAAGCAGAATGAGATGTGAGAGG-3'。
2.根据权利要求1所述的马立克氏病抗性鸡的快速检出方法，其特征在于所述第一轮和 第二轮扩增PCR反应体系和反应条件分别为: 第一轮扩增PCR反应体系:10 X PCR Buffer5.0yL, cDNA模板5.0 μ L，25mM外上游引物 1.0μ L，25mM 外下游引物 1.0μ L，1.5U Taq 酶 0.6 μ L，IOmM dNTP Mixturel.0 μ L, ddΗ2036.4μ L，共 50μ L ； 第一轮扩增PCR反应条件:95°C 5min ;随后进行35个循环，每个循环包括95°C 30s，61°C 30s, 72°C 45s ;最后 72°C IOmin ； 第二轮扩增PCR反应体系:10 X PCR Buffer5.0yL, DNA模板5.0 μ L，25mM内上游引物 1.0μ L，25mM 内下游引物 1.0μ L，1.5U Taq 酶 0.6 μ L，IOmM dNTP Mixturel.0 μ L, ddH2036.4 μ L，共50 μ L ;所述DNA模板来自第一轮PCR扩增产物； 第二轮扩增PCR反应条件:95°C 5min ;随后进行35个循环，每个循环包括95°C 30s，52°C 30s, 72°C 45s ;最后 72°C IOmi`n0
【文档编号】C12Q1/68GK103468824SQ201310469433
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】韦平, 金元昌, 韦天超, 磨美兰, 黄亮, 崔帅 申请人:广西大学