一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶重组菌，它是导入了L-谷氨酸脱羧酶GAD基因的大肠杆菌；其中所述的L-谷氨酸脱羧酶GAD基因来源于酵母Kodamaea?ohmeri?NH-9，其核苷酸序列如SEQ?ID?No：1所示。本发明还公开了上述谷氨酸脱羧酶重组菌构建方法和应用。本发明具有如下优势：（1）盐酸吡哆醛价格是5’-磷酸吡哆醛的一半，降低工艺成本；（2）酶活高，反应时间短，条件温和，底物浓度高达510g/L，产物γ-氨基丁酸浓度达352g/L；（3）细菌及旋转蒸发后的缓冲液均可重复利用，转化率100%，收率不低于99%；（4）工艺简便，绿色环保，且产品纯度99%以上。
【专利说明】一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]Y-GABA是L-谷氨酸脱去α _羧基的产物(图1 )，其化学名称是Y-氨基丁酸(简称Y -GABA),分子式为NH2CH2CH2CH2C00H，极易溶于水，在溶液中能以可变的分子结构形式存在，可伸展成线状，也可形成类似脯氨酸的环状。Y-GABA是两性分子等电点7.3接近于生理PH值。成品是无色至白色无臭针状结晶或结晶性粉末。
[0003]Y-GABA的用途广泛，可用于食品、饲料、医药和化工等行业中。它有如下生理功能:1安神、抗抑郁；2增强记忆力，提高脑功能；3促进生长激素分泌，防止肥胖；4健肝利肾，防止大肠癌变；5改善更年期综合症；6提高精子的受精率等。天然存在的Y -GABA的量供不应求，因此Y -GABA的生产得到关注。目前，Y -GABA的生产基本采用化学合成法、植物富集法和生物合成法，其中化学合成法成本较高且使用有毒试剂，安全性差，反应条件苛亥IJ，产品分离困难。植物富集法含量较低，反应液成分复杂，产物提取十分困难。生物合成法安全性高，反应条件温和，提取工艺简单，原料丰富，有显著优势，原理为:利用L-谷氨酸在L-谷氨酸脱羧酶的作用下脱去α-羧基制备Y-GABA。但是不足之处是目前生物合成法中运用的微生物含有的L-谷氨酸脱羧酶的酶活较低且下游分离提纯困难。所以筛选具有相对高活力L-谷氨酸脱羧酶的微生物并通过分子生物学技术外源高效表达L-谷氨酸脱羧酶并简化分离工艺得到该领域学者、专家的关注，即酶催化法。
[0004]目前利用酶催化法制备Y-GABA的报道中，因为具有L-谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌酶活相对较高，所以利用大肠杆菌制备的Y-GABA的产率和得率相对较高，并且所报道的L-谷氨酸脱羧酶的辅酶为5’ -磷酸吡哆醛，该辅酶是菌体自身携带。焦庆才等(CN200410064813.3)将Escherichia coliASl.505菌体加入含有L-谷氨酸和L-天冬氨酸的混合液中，28-45 °下反应，等电点结晶和离子交换树脂相结合使用分离出产物Y -GABA和L-天冬氨酸。吴晓燕等(化工进展，2005, 8:889-892)转化DL-谷氨酸，50g/L底物需15h完全转化，生成D-谷氨酸和Y-氨基丁酸，使用的细菌是Escherichia coliASl.505。李永丰等(华东化工学院学报，1981，2:7-11 )，赵景联等(生物工程学报，1989，2:124-128)，张汝平等(长沙电力学院学报自然科学版，1998，4:433-435)均用固定化大肠杆菌细胞转化L-谷氨酸制备Y-GABA，固定化材料分别为海藻酸钠-戊二醛和海藻酸钙。其中，李永丰将固定化细胞加入PH4.0，底物浓度为5%的L-谷氨酸溶液中，5h转化率达100% ;赵景联使用的底物浓度为1%，间歇反应，5h转化率达100% ;张汝平将包埋后的大肠杆菌加入后道味精母液进行酶促反应，Y -GABA的收率为49.65%，纯度达98.94%。这些使用野生大肠杆菌制备Y-GABA的普遍存在以下几个问题:1)酶活力不高；2)反应周期长；3)产物浓度低；4)提取工艺仍然相对复杂。
[0005]随着分子生物学的崛起，利用分子克隆和外源表达技术可以大幅度地提高目的酶在宿主微生物中的表达量，通过这种方法构建的基因工程菌株酶催化效率远远高于普通微生物；利用重组菌生产Y-GABA的工艺在国内报道尚少。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种适合于大规模工业化生产的谷氨酸脱羧酶重组菌。
[0007]本发明还要解决的技术问题是提供上述重组菌的构建方法。
[0008]本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组菌在生产Y-GABA中的应用。
[0009]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0010]一种谷氨酸脱羧酶重组菌，所述谷氨酸脱羧酶重组菌，它是导入了 L-谷氨酸脱羧酶GAD基因的大肠杆菌；其中所述的L-谷氨酸脱羧酶GAD基因来源于酵母(Kodamaeaohmeri) NH-9，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0011]上述谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，该方法包括如下步骤:
[0012](I)以酵母Kodamaea ohmeri NH-9的基因组DNA作为模板,酵母属于真核微生物，一般L-谷氨酸脱羧酶来源是原核微生物，以包含BamH I和Xho I酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增:
[0013]引物1:5' -CGGGATCCATGTTACACAGGCAC-3'(下划线处为 BamH I 酶切位点)；
[0014]引物2:5' -GCCGCTCGAGTCAACATGTTCCTCT-3'(下划线处为 Xho I 酶切位点)；
[0015]PCR的扩增体系为:基因组DNA2y L，引物I和引物2各2yL，dNTP4 μ L，IOXTaq缓冲液(含 Mg2+) 5 μ L，Taq 酶 I μ L，ddH2034 μ L ；
[0016]PCR反应程序为:94°C预变性2min ;94°C变性30s，然后50°C退火lmin，72°C延伸lmin，循环25次；最后72°C延伸IOmin ；
[0017]回收PCR扩增产物，经限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-gad ；
[0018](2)将重组质粒pET-gad转化至感受态大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布含25 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，20g/L琼脂，pH7.0)，37°C培养12~16h得到单克隆；
[0019](3)挑取10个单克隆于5mL含有25 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl,pH7.0)中，37°C、200rpm培养12h后提质粒，用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切，根据电泳结果判断含有与gad基因相同大小DNA片段的质粒为重组质粒pET-gad，具有该重组质粒的菌落为阳性克隆，即为目的基因工程菌。
[0020]上述谷氨酸脱羧酶重组菌在制备Y -氨基丁酸中的应用。
[0021]具体方法是，将谷氨酸脱羧酶重组菌接种于LB液体培养基中培养过夜，然后以I~10(v/v)%的接种量转接入发酵培养基中30~40°C发酵培养2~3h，再加入终浓度
0.5~1.0mM的IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)或终浓度2~5g/L的乳糖诱导，并置于20~25°C下诱导表达20~24h ;将诱导表达后的发酵液离心，获取湿菌泥，用pH3.8~4.6的醋酸缓冲液洗涤并悬浮细菌，将L-谷氨酸加入到细胞悬浮液中，加入盐酸吡哆醛15-25mg/L，反应开始，维持反应温度35~40°C，反应6~12h ;反应过程中观测有无气泡产生，待无气泡产生时，停止反应，离心除去菌体，母液加入5g/L活性炭(即IL母液中加入Ig活性炭，以下相同)在80~100°C加热15~30min,抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到Y -GABA粗品。转化率接近100.0%，产品纯度达到99.6%以上。
[0022]除上述单批次发酵方法之外，也可采用多批次添加底物制备Y-GABA的方法，诱导表达的方式与前述单批次方法相同，再将诱导表达后的发酵液离心，获取湿菌泥，用pH3.8~4.6的醋酸缓冲液洗涤并悬浮细菌，将L-谷氨酸加入到细胞悬浮液中，加入盐酸吡哆醛15-25mg/L，反应开始，维持反应温度35~40°C，反应6~12h ;反应过程中观测有无气泡产生，待无气泡产生时，继续添加底物，继续反应，连续批次添加底物后，待反应无气泡释放时，离心收集菌体，母液用加入5g/L活性炭在80~100°C加热15~30min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到Y-GABA粗品。
[0023]上述反应结束后收集的菌体可以重复用于Y-GABA的生产。
[0024]其中，所述的发酵培养基的组份:以乳糖或L-谷氨酸作为碳源，浓度为0.5~10g/L ;以酵母粉或蛋白胨为氮源，浓度为20~40g/L ;以氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠或七水硫酸镁作为盐离子，浓度为5~10g/L。
[0025]本发明菌株依赖的辅酶是盐酸吡哆醛，可以替换L-谷氨酸依赖型辅酶5’ -磷酸吡哆醛，添加等浓度20mg/L的盐酸吡哆醛与5’ -磷酸吡哆醛，酶活提高的倍数相同。但是盐酸吡哆醛价格只有5’-磷酸吡哆醛的一半，大工艺生产Y-氨基丁酸(Y-GABA )，节约成本。
[0026]有益效果:本发明与现有技术相比，具有如下优势:
[0027]本发明选择一株从自然界筛选得到的酵母Kodamaea ohmeri NH-9 (本实验室自主保存)作为分子生物学操作的出发菌株，通过PCR技术从该菌株的基因组上扩增得到了L-谷氨酸脱羧酶的编码基因(gad基因)，利用大肠杆菌BL21作为宿主，成功构建了能够高效表达L-谷氨酸脱羧酶的基因工程菌。同时，找到了 L-谷氨酸脱羧酶依赖型辅酶5’ -磷酸吡哆醛的替代辅酶-盐酸吡哆 醛，反应需外源添加盐酸吡哆醛。具有原料来源广，酶活高，条件温和，经济，反应时间短、转化率高、可以多批次重复利用细胞等优点，底物浓度高达510g/L，产物Y-氨基丁酸浓度达352g/L，转化率100%，收率不低于99%，有效解决了使用野生菌制备Y-GABA出现的问题，有良好的工业应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1 为 L-谷氨酸(L-glutamate)与 Y-GABA ( Y-aminobutyric acid)的结构式比较。
[0029]图2为Kodamaea ohmeri NH-9基因组的琼脂糖凝胶电泳图。
[0030]图3为重组质粒构建流程图。
[0031]图4为重组质粒pET-gad的单-双酶切验证。其中，1_4:GAD片段；5_6:重组质粒
单切产物。
[0032]图5为L-谷氨酸脱羧酶蛋白胶电泳验证。其中，M-标准蛋白；1_全细胞；2_3细胞上清；4_细胞破碎残渣。
【具体实施方式】
[0033]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0034]实施例1:Kodamaea ohmeri NH-9 基因组 DNA 的提取。
[0035]用Genomic DNA Purification Kit (Takara,大连)提取处于对数生长期的Kodamaeaohmeri NH-9的基因组DNA，并用1% (10g/L)的琼脂糖凝胶电泳对所获得的基因组DNA进行检测，结果见图2。
[0036]实施例2:L-谷氨酸脱羧酶基因(gad基因)的克隆和基因工程菌的构建。
[0037]2.1PCR扩增L-谷氨酸脱羧酶基因(gad基因)。
[0038]根据Genbank上已报道的Kodamaea ohmeri NH-9来源L-谷氨酸脱羧酶基因的序列，运用Vector NTI软件设计下列两条引物:
[0039]引物1:5' -CGGGATCCATGTTACACAGGCAC-3'(下划线处为 BamH I 酶切位点)
[0040]引物2:5' -GCCGCTCGAGTCAACATGTTCCTCT-3'(下划线处为 Xho I 酶切位点)[0041 ] 以实施例1获得的Kodamaea ohmeri NH-9的基因组DNA为模板，扩增目的基因片段。
[0042]PCR体系:基因组DNA2y L，引物I和引物2各2 μ L，dNTP4 μ L，10 X exTaq缓冲液(含 Mg2+) 5 μ L，exTaq 酶 I μ L，ddH2034 μ L ；
[0043]PCR反应程序:94 °C预变性5min ;94°C变性30s，然后50°C退火30s，72 °C延伸lmin，循环35次，最后72°C延 伸IOmin ；
[0044]1% (10g/L)琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，得出结论:与预期分子量(1758bp)大小相符。因为无杂带，所以用DNA纯化试剂盒回收。
[0045]利用pET_28a质粒(Novagen)构建表达载体。流程图见图3。
[0046]2.2限制性酶切反应，纯化及连接反应。
[0047]对实施例2.1获得的PCR产物用对应的酶进行双酶切反应。本实验中，所用的限制性内切酶是 BamH I 和 Xho I。酶切体系为:PCR 产物 50 μ L，BamH 12.5 μ L，Xho 12.5μ L,IOX缓冲液10 μ L，ddH2035 μ L，总体积100 μ L。将DNA纯化试剂盒纯化酶切后的PCR产物。
[0048]同样的用限制性内切酶是BamH I和Xho I对pET_28a质粒进行酶切，因为pET_28a质粒的多克隆位点上BamH I和Xho I相距很近，大约20bp，所以线性化后的质粒只需要经过DNA纯化试剂盒纯化即可。
[0049]连接经过纯化后的PCR产物和pET_28a线性化质粒进行。连接体系为:酶切纯化的PCR产物4 μ L，酶切纯化的pET-28a质粒4μ L，Τ4连接酶I μ L，10ΧΤ4连接酶缓冲液IuL0在37°C过夜连接获得重组质粒pET-gad。
[0050]2.3重组质粒pET-gad的转化。
[0051]氯化钙法制备感受态大肠杆菌细胞。
[0052](I)取 10 μ L 重组质粒 pET-gad 于 50 μ L 大肠杆菌 Escherichia coli BL21 (DE3)感受态细胞中，冰浴30min。
[0053](2) 42°C水浴热激90s，快速置于冰上I~2min。
[0054](3)加入新鲜LB液体培养基800 μ L，于37°C振荡培养45~60min。
[0055](4)取200 μ L菌体涂布于含有25 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基表面。37°C培养12~16h至单菌落出现。
[0056]2.4重组子的鉴定。
[0057]将单菌落接种于含有卡那霉素(25 μ g/mL)的LB液体培养基中37°C培养12h，提取质粒，按照“限制性酶切反应，纯化及连接反应”中的酶切体系和条件分别用BamH I和XhoI对重组质粒pET-gad进行单-双酶切，酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定结果见图4,实验结果说明获得的重组质粒pET-gad是正确的。
[0058]电泳结果表明，该阳性克隆菌落含有目的DNA片段，测序结果显示插入片段含有一个长 1758bp 的开放阅读框架(Open Reading Frame, ORF)。
[0059]实施例3:L-谷氨酸脱羧酶的诱导表达。
[0060]配制种子液IOOmL,培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaC110g/L)，经121°C高压湿热灭菌15min后装入500mL广口三角瓶中。用接种环向种子液接入一环基因工程菌菌种，并置于37°C摇床以200rpm的转速过夜培养。配制含有酵母粉20g/L (或蛋白胨30g/L)、乳糖8g/L、L-谷氨酸0.5g/L、氯化钠10g/L的发酵培养基500mL分装于容量500mL的广口三角瓶中，每瓶的装液量为IOOmL ;将上述发酵培养基于121°C高压湿热灭菌15min。待培养基冷却后接入过夜培养的种子液lmL，将三角瓶置于37°C摇床以200rpm的转速培养，约2h后加入终浓度为2g/L的乳糖，或者加入终浓度为0.5mM的IPTG (异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，并置于25°C的摇床，以200rpm转速进行诱导20_24h。SDS验证L-谷氨酸脱羧酶的表达，条带大小66kDa，与理论值一致，见图5。
[0061]实施例4:利用基因工程菌生产Y -GABA的方法。
[0062]将基因工程菌发酵液离心手机菌体，用pH4.2，10g/L的50mL谷氨酸溶液悬浮菌体，细菌浓度为10g/L，加入辅酶盐酸吡哆醛20mg/L，反应温度37°C，摇床转速200rpm。将反应后的液体进行活性炭吸附脱色15-30min，活性炭使用量为5g/L，脱色温度100°C ;待过滤后用旋转蒸发仪进行真空浓缩干燥，得到产品0.35g，转化率接近100.0%，得率不低于99% ；用液相检测与Y -GABA标品出峰时间一致，产品的化学纯度为99.6%。
[0063]实施例5:利用基因工程菌多批次生产Y -GABA的方法
[0064]将实施例3所得的基因工程菌发酵液离心并收集菌体，用pH4.2，I吨谷氨酸溶液悬浮2吨发酵液所得菌体，底物浓度为10g/L，加入辅酶盐酸吡哆醛20mg/L，反温度37°C，摇床转速200rpm。待无气泡时继续添加底物，继续反应。连续添加51批次底物后，待反应无气泡释放时，离心除去菌体，加入活性炭至上清液中，用5g/L，活性炭在80~100°C加热15-30min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到y-GABA粗品。二次收集的菌体可以重复用于Y-GABA的生产。称量Y-GABA的质量为352kg，即转化率接近100%，得率不低于99%。
【权利要求】
1.一种谷氨酸脱羧酶重组菌，其特征在于，它是导入了 L-谷氨酸脱羧酶GAD基因的大肠杆菌；其中所述的L-谷氨酸脱羧酶GAD基因来源于酵母Kodamaea ohmeri NH-9,其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: (I)以酵母Kodamaea ohmeri NH-9的基因组DNA作为模板，以包含BamH I和Xho I酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增: 引物 1:5' -CGGGATCCATGTTACACAGGCAC-3'； 引物 2:5' -GCCGCTCGAGTCAACATGTTCCTCT-3'； PCR的扩增体系为:基因组DNA2 μ L，引物I和引物2各2 μ L，dNTP4 μ L，IOXTaq缓冲液 5 μ L, Taq 酶 I μ L, ddH2034 μ L ； PCR反应程序为:94°C预变性2min ;94°C变性30s，然后50°C退火lmin，72°C延伸lmin，循环25次；最后72°C延伸IOmin ； 回收PCR扩增产物，经限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-gad ； (2 )将重组质粒pET-gad转化至感受态大肠杆菌BL21 (DE3 )中，涂布含25 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基，37°C培养12~16h得到单克隆； (3)挑取10个单克隆于5mL含有25 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养12h后提质粒，用限制性内切酶BamH I和X`ho I酶切，根据电泳结果判断含有与gad基因相同大小DNA片段的质粒为重组质粒pET-gad，具有该重组质粒的菌落为阳性克隆，即为目的基因工程菌。
3.权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶重组菌在制备Y-氨基丁酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将谷氨酸脱羧酶重组菌接种于LB液体培养基中培养过夜，然后以I~10(v/v)%的接种量转接入发酵培养基中30~40°C发酵培养2~3h，再加入终浓度0.5~1.0mM的IPTG或终浓度2~5g/L的乳糖诱导，并置于20~25°C下诱导表达20~24h ;将诱导表达后的发酵液离心，获取湿菌泥，用pH3.8~4.6的醋酸缓冲液洗涤并悬浮细菌，将L-谷氨酸加入到细胞悬浮液中，加入盐酸吡哆醛15-25mg/L，反应开始，维持反应温度35~40°C，反应6~12h ;反应过程中观测有无气泡产生，待无气泡产生时，停止反应，离心除去菌体，母液加入5g/L活性炭在80~100°C加热15~30min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到Y -GABA粗品。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将L-谷氨酸加入到细胞悬浮液中，加入盐酸吡哆醛15-25mg/L，反应开始，维持反应温度35~40°C，反应6~12h ;反应过程中观测有无气泡产生，待无气泡产生时，继续添加底物，继续反应，连续批次添加底物后，待反应无气泡释放时，离心收集菌体，母液用加入5g/L活性炭在80~100°C加热15~30min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到Y -GABA粗品。
【文档编号】C12N15/70GK103484419SQ201310469515
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】徐虹, 许露, 顾峰, 詹伊婧, 李莎 申请人:南京工业大学