基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明一种基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒，用于检测目的基因。本发明将TaqMan探针与LAMP技术相结合，从根本上解决了非特异扩增的问题，可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到目的基因，为核酸检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测致病菌（如“超级细菌”等）等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
【专利说明】基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引 物与试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】中核酸的分子生物学检测方法，特别是涉及一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法及其在目的基因(核酸)检测中的应用。
【背景技术】
[0002]实时突光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、不需要PCR产物后处理，有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
[0003]TaqMan荧光探针PCR技术是实时荧光定量PCR技术的一种，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一条特异性的TaqMan荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' — 3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此，Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团包括FAM、TET、VIC、HEX等。
[0004]2000年Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即 LAMP (Loop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在甲型HlNl流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1LAMP试剂盒的研制。通过近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。
[0005]LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点:
[0006](I)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT-LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。
[0007](2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性.避免了温度循环而造成的时间损失.核酸扩增在Ih内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在20-30min均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至IO9倍，达0.5mg/mL.应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
[0008](3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，因此其特异性极高。
[0009](4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
[0010]LAMP技术目前的检测方法主要为以下几种:一是普通电泳法，将LAMP扩增产物进行普通凝胶电泳，但此检测方法无特异性，因为只要发生了 LAMP反应，电泳条带均一样。二是荧光染色法，染料主要包括:SYBR Green 1、羟基萘酚蓝(HydroxynaphthoI blue, HNB),钙黄绿素。但是，SYBR Green I染料只要扩增出核酸便显示阳性，无特异性；羟基萘酚蓝与钙黄绿素均是指示LAMP的副产物镁离子的变化，也无特异性。三是浊度法，此法主要是检测LAMP的副产物焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，只要发生LAMP反应溶液即变浑浊，此法也无特异性。
[0011]综合以上三种检测方法，均不能对扩增产物进行特异检测，均为间接检测，这也就带来了一个非常大的问题，如果LAMP发生了非特异性扩增，那么用这些检测方法获得的结果均是假阳性，因此，需要对LAMP技术进行改进，从根本上解决检测结果假阳性的问题。
【发明内容】
[0012]为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物和Taqman探针。
[0013]本发明所提供的LAMP引物，是首先从美国基因数据库GenBank检索获得待测目的基因的核苷酸序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到特异性的LAMP保守靶序列，再根据LAMP保守靶序列设计LAMP引 物。
[0014]如图1所示，所述LAMP保守靶序列包括以下几个部分:F1_F3和B1-B3为引物设计区，Fl和BI之间为延伸区，引物设计区主要用于LAMP引物和Taqman探针的设计，延伸区也可用于Taqman探针的设计,但不是Taqman探针设计的优选区域。
[0015]如图2所示，所述LAMP引物包括一条正向外引物F3、一条反向外引物B3、一条正向内引物 FIP (FIP=Flc+F2)、一条反向内引物 BIP (BIP=Blc+B2)。
[0016]本发明还提供一种用在线LAMP引物设计软件设计LAMP引物的方法，是先登录LAMP 引物设计软件Primer Explorer V4 的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/),然后导入LAMP保守靶序列，软件自动生成LAMP引物，该软件的具体使用方法，可包括以下步骤:
[0017]I)单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认小于22kbp，支持三个类型的文件:普通文本格式(仅含序列)、FASTA格式和GenBank格式文件；
[0018]2 )从下面三个选项中选择定参数设定条件(引物设计条件)，基于GC含量的自动判断，起始的参数是特定的:如果GC含量小于或等于45%，则选取AT丰度高的区，如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区，其它情况是标准设定状态；
[0019]3)整理软件自动设计出的LAMP引物，合成引物。
[0020]本发明还提供了一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法的专用Taqman探针，具体设计原则如下:
[0021]I)探针位置尽可能地靠近LAMP保守靶序列的两端环状位置，具体的来说就是探针的位置在Fl和F3之间(将该探针命名为TF)，或者BI和B3之间(将该探针命名为TB)；
[0022]2)探针长度应在15_45bp (最好是20_30bp)之间，以保证结合特异性；[0023]3)检测探针的DNA折叠和二级结构；
[0024]4 ) Tm 值在 60-65 °C 之间，GC 含量在 40 % -70 % 之间；
[0025]5)探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤，因为5’G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；
[0026]6)整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，因为G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；
[0027]7)为确保探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计探针。
[0028]此外，本发明所提供的TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
[0029]所述报告荧光基团可为FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA, ROX, CY3、CY5 等，优选为 FAM ；所述荧光淬灭基团可为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse等，优选为BHQ1。
[0030]本发明还提供了一种用上述LAMP引物、Taqman探针及环介导恒温扩增法检测待测样品中是否含有目的基因的方法，可包括以下步骤:
[0031]I)配制23yL LAMP反应液，其中各物质浓度为:20mM Tris.HCl (pH8.8)，IOmMKCl，IOmM(NH4)2SO4,0.1 % Tween20，0.8M 甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4,1.4mMdNTPeach，8U Bst DNA聚合酶，加入的引物及Taqman探针量为:40pmol FIP和BIP各，5pmol F3和 B3，4pmol TF 或者 4pmol TB ；
[0032]2)按常规方法提取待测样品中的核酸；
[0033]3)取2 μ L核酸提取液加入步骤I)配制的LAMP反应液中，使终反应体积为25 μ L，混匀反应液；
[0034]4)置 60-65°C (优选 63°C )恒温 55_65min (优选 60min)进行 LAMP 扩增；
[0035]5)进行结果判读，方法为:曲线上升的样本判定为阳性结果，曲线没有上升的判定为阴性结果。
[0036]本发明的另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的用于检测目的基因的基于Taqman探针的环介导恒温扩增法(LAMP)检测试剂盒。
[0037]本发明所提供的用于检测目的基因的基于Taqman探针的环介导恒温扩增法(LAMP)检测试剂盒，包含上述由一条正向外引物F3、一条反向外引物B3、一条正向内引物FIP(FIP=Flc+F2)和一条反向内引物BIP(BIP=Blc+B2)组成的LAMP引物组合，以及Taqman探针TF或TB。
[0038]本发明的试剂盒还包含LAMP反应液，与LAMP弓丨物和Taqman探针共同构成LAMP检测体系；23 μ L LAMP反应液中各物质浓度为:20mM Tris.HCl (pH8.8)，IOmM KCl，IOmM(NH4)2SO4,0.1% Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4,1.4mM dNTPeach，8U BstDNA。
[0039]具体来讲，当待测目的基因为NDM-1基因时，首先从美国基因数据库GenBank检索获得NDM-1基因的核苷酸序列(GenBank号:FN396876)，通过BLAST软件进行同源性分析，找到特异性的LAMP保守靶序列，其核苷酸序列如序列表中序列I所示，
[0040]再根据LAMP保守靶序列设计LAMP弓丨物。
[0041 ] 所述LAMP引物组合及序列如下:[0042]正向外引物CJXJ1F3:5’ -GCATAAGTCGCAATCCCCG-3’(序列表中序列 2)；
[0043]反向外引物CJXJ1B3:5’ -GGTTTGATCGTCAGGGATGG-3’(序列表中序列 3)；
[0044]正向内引物CJXJ1FIP: 5’-CTGGCGGTGGTGACTCACGAAAAGCATGCAGCGCGTCCA-3’(序列表中序列4)；
[0045]反向内引物CJXJ1BIP:5’ -CGCGACCGGCAGGTTGATCAAAAGGTCGATACCGCCTGGAC-3’(序列表中序列5)。
[0046]所述Taqman探针序列如下:
[0047]FAM-TF:5’ FAM-CATCAGGACAAGATGGGC-BHQ13’(序列表中序列 6)；
[0048]FAM-TB:5’ FAM-TCCAGTTGAGGATCTGGGC-BHQ13’(序列表中序列 7)。
[0049]本发明还提供了一种用上述LAMP引物、Taqman探针及环介导恒温扩增法检测待测样品中是否含有NDM-1基因的方法，可包括以下步骤:
[0050]I)配制23 μ L LAMP反应液，反应液中各物质浓度为:20mM Tris.HCl (pH8.8)，IOmM KCl，10mM(NH4)2S04，0.1% Tween20，0.8M 甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4,1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA聚合酶，加入的引物量及Taqman探针量为:40pmolCJXJlFIP和CJXJ1BIP，5pmol CJXJ1F3 和 CJXJlB3，4pmol FAM-TF 或者 4pmol FAM-TB ；
[0051]2)按常规方法提取待测样品中的核酸；
[0052]3)取2 μ L核酸提取液加入步骤I)配制的LAMP反应液中，使终反应体积为25 μ L，混匀反应液；
[0053]4)置 60-65°C恒温 60min 进行 LAMP 扩增；
[0054]5)进行结果判读，方法为:曲线上升的样本判定为阳性结果，曲线没有上升的判定为阴性结果。
[0055]本发明提供了一种用于检测目的基因的基于Taqman探针的环介导恒温扩增法(LAMP)检测方法及其专用引物、Taqman探针与试剂盒。本发明具有以下优点:
[0056]I)高特异性:4条引物对目的基因靶序列的6个特异区域的识别保证了 LAMP扩增的高度特异性，并增加了一条探针，可以对扩增产物直接检测；
[0057]2)高灵敏度:灵敏度比普通PCR高100倍，与普通LAMP检测方法的灵敏度相当；
[0058]3)解决了因LAMP非特异扩增而造成的假阳性问题；
[0059]4)操作简单:只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入荧光定量仪器中60-65°C保持60分钟就可以判断结果；
[0060]5)快速、高效扩增:整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0.5mg/
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[0061]综上所述，本发明将TaqMan探针与LAMP技术相结合，从根本上解决了非特异扩增的问题，可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到目的基因，为核酸检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测致病菌(如“超级细菌”等)等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
[0062]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】[0063]图1为LAMP靶基因的组成示意图
[0064]图2为LAMP引物与靶基因的位置关系
[0065]图3为Taqman探针的组成示意图
[0066]图4为在反应体系中添加FAM-TF探针或FAM-TB探针，以确定最佳Taqman探针的检测结果(NDM-1基因)
[0067]图5为在反应体系中添加不同浓度(0.5μΜ、1μΜ、2μΜ、3μΜ、4μΜ、6μΜ、8μΜ、10 μ Μ、12 μ Μ)的Taqman探针FAM-TB，以确定最佳Taqman探针反应浓度的检测结果(NDM_1基因)
[0068]图6为在反应体系中添加相同浓度(4 μ Μ)的Taqman探针FAM-TB，平行检测6次，以确定结果重现性的检测结果(NDM-1基因)
【具体实施方式】
[0069](一)本发明将Taqman探针应用于LAMP的技术原理
[0070]1.LAMP靶基因的组成
[0071]如图1所示，LAMP靶基因被人为分为以下几个部分:F1_F3和B1-B3为引物设计区，Fl和BI之间为延伸区，引物设计区主要用于LAMP引物和Taqman探针的设计，延伸区也可用于Taqman探针的设计,但不是Taqman探针设计的优选区域。
[0072]2.LAMP 引物
[0073]如图2所示，LAMP 引物主要由 FIP、BIP、F3、B3组成，其中 FIP=Flc+F2, BIP=Blc+B2。
[0074]3.LAMP技术的原理
[0075]60-65 °C是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65 °C左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。
[0076]第一阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的Flc与此单链上的Fl为互补结构。迅速以3’末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
[0077]第二阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的BI区段为起点，以自身为模板。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
[0078]4.Taqman 探针
[0079]如图3所示，TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团(R)连接在探针的5’末端，而淬灭剂(Q)则在3’末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团是FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5等，常见的淬灭基团有TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 等。
[0080](二)LAMP引物的设计
[0081]用在线LAMP引物设计软件可进行LAMP引物的设计，先登录LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/),然后导入LAMP保守祀序列，软件自动生成LAMP引物，该软件的具体使用方法，可包括以下步骤:
[0082]I)单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认小于22kbp，支持三个类型的文件:普通文本格式(仅含序列)、FASTA格式和GenBank格式文件；
[0083]2 )从下面三个选项中选择定参数设定条件(引物设计条件)，基于GC含量的自动判断，起始的参数是特定的:如果GC含量小于或等于45%，则选取AT丰度高的区，如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区，其它情况是标准设定状态；
[0084]3)整理软件自动设计出的LAMP引物，合成引物。
[0085](三)Taqman探针的设计
[0086]用于LAMP的Taqman探针的设计和用于PCR的Taqman探针设计基本一致,略有不同，具体设计原则如下:
[0087]I)探针位置尽可能地靠近LAMP保守靶序列的两端环状位置，具体的来说就是探针的位置在Fl和F3之间(将该探针命名为TF)，或者BI和B3之间(将该探针命名为TB)；
[0088]2)探针长度应在15_45bp (最好是20_30bp)之间，以保证结合特异性；
[0089]3)检测探针的DNA折叠和二级结构；
[0090]4 ) Tm 值在 60-65 °C 之间，GC 含量在 40 % -70 % 之间；
[0091]5)探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤，因为5’ G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；
[0092]6)整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，因为G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；
[0093]7)为确保探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，需重新设计探针。
[0094]此外，本发明所提供的TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
[0095]所述报告荧光基团可为FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA, ROX, CY3、CY5 等，优选为 FAM ；所述荧光淬灭基团可为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse等，优选为BHQ1。
[0096]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J.,Russell,David ff.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0097]所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V，单位g/100ml)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
[0098]实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0099]所用引物和TaqMan探针均由上海生工生物公司合成。
[0100]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0101]实施例1、用基于Taqman探针的LAMP法检测NDM-1基因
[0102]以NDM-1基因为例详细说明本发明基于Taqman探针的LAMP法，具体检测方法包括以下步骤:
[0103]一、对NDM-1基因进行基于Taqman探针的LAMP检测的引物设计
[0104]从美国基因数据库检索获得NDM-1基因序列(GenBank号:FN396876.1)，通过BLAST软件进行同源性分析，获得NDM-1基因的特异性保守靶序列(序列表中序列1)，再根据该保守革G DNA 序列，用软件 Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/e/)设计用于对NDM-1基因进行基于Taqman探针的LAMP检测的引物，引物序列如下:
[0105]正向外引物CJXJ1F3:5’ -GCATAAGTCGCAATCCCCG-3’(针对 NDM-1 基因靶序列的自5’端第390-408位碱基的特异区域设计，序列表中序列2)；
[0106]反向外引物CJXJ1B3:5’ -GGTTTGATCGTCAGGGATGG-3’(针对 NDM-1 基因靶序列的自5’端第564-583位碱基的特异区域设计，序列表中序列3)；
[0107]正向内引物CJXJ1FIP: 5’ -CTGGCGGTGGTGACTCACGAAAAGCATGCAGCGCGTCCA-3’(针对NDM-1基因靶序列的自5’端第411-426位碱基的特异区域与NDM-1基因靶序列的自5’端第451-469位碱基的特异区域设计，序列表中序列4)；
[0108]反向内引物CJXJ1BIP:5’ -CGCGACCGGCAGGTTGATCAAAAGGTCGATACCGCCTGGAC-3’(针对NDM-1基因靶序列的自5’端第470-488位碱基的特异区域与NDM-1基因靶序列的自5’端第531-548位碱基的特异区域设计，序列表中序列5)。
[0109]以上4条引物的组合为本发明用于对NDM-1基因进行基于Taqman探针的LAMP检测的引物。
[0110]二、对NDM-1基因进行基于Taqman探针的LAMP检测的Taqman探针设计
[0111]根据前述(三)的设计原则得到的Taqman探针序列如下:
[0112]FAM-TF:5’ FAM-CATCAGGACAAGATGGGC-BHQ13’(针对 NDM-1 基因靶序列的自 5’ 端第431-449位碱基的特异区域设计，序列表中序列6)；
[0113]FAM-TB:5’FAM-TCCAGTTGAGGATCTGGGC-BHQ13’(针对 NDM-1 基因靶序列的自 5’端第499-516位碱基的特异区域设计，序列表中序列7)。
[0114]三、建立本发明NDM-1基因的基于Taqman探针的LAMP检测方法
[0115]用步骤一获得的用于对NDM-1基因进行LAMP检测的四条引物和步骤二获得的两条Taqman探针对含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌(来自中国人民解放军疾病预防控制所传染病控制中心)进行LAMP检测，以获得最佳反应体系及反应条件，具体方法如下:
[0116]1、用不同的Taqman探针进行检测
[0117]在相同反应条件(置63 °C恒温60min )下，在反应体系中添加FAM-TF探针或FAM-TB探针，以确定最佳Taqman探针,包括以下步骤:
[0118]I)以含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA (用Promega的Wizard GenomicDNA purification Kit商品化DNA提取试剂盒提取待测样品中的核酸)为模板,在步骤一获得的四条引物和步骤二获得的Taqman探针的引导下进行LAMP扩增，其中，25uLLAMP反应体系内物质浓度为:含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA2yL，20mMTris -HCl (pH8.8)，IOmM KCl，10mM(NH4)2S04，0.1% Tween20，0.8M 甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4,1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA 聚合酶，加入的引物量为:40pmol CJXJ1FIP 和 CJXJ1BIP，5pmol CJXJ1F3和CJXJlB3，4pmol FAM-TF或者4pmolFAM_TB ;反应条件为置于63°C荧光定量PCR仪60min。
[0119]2)用Bio-Rad公司的IQ5荧光定量仪检测荧光生成量，结果如图4 (横坐标表示反应时间，纵坐标表示荧光积累量)所示，可以看出两条探针的曲线均上升，表明Taqman探针可以应用到LAMP之中，所设计的两个探针均有效。[0120]2、用不同浓度的Taqman探针FAM-TB进行检测
[0121]在相同反应条件(置63°C恒温60min)下，在反应体系中添加不同引物量(0.5pmol、lpmol、2pmol、3pmol、4pmol、6pmol、8pmol、10pmol、12pmol) 的 Taqman 探针FAM-TB,以确定最佳Taqman探针的反应浓度，包括以下步骤:
[0122]I)以含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA (用Promega的Wizard GenomicDNA purification Kit商品化DNA提取试剂盒提取待测样品中的核酸)为模板,在步骤一获得的四条引物和步骤二获得的Taqman探针FAM-TB的引导下进行LAMP扩增，其中，25uL LAMP反应体系内物质浓度为:含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA2 μ L，20mM Tris *HCl(pH8.8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4,0.1% Tween20，0.8M 甜菜碱(betaine),8mM MgS04,1.4mM dNTP each，8U Bst DNA 聚合酶，加入的引物量为:40pmol CJXJ1FIP 和CJXJlBIP，5pmol CJXJ1F3 和 CJXJ1B3,不同浓度(0.5pmol、lpmol、2pmol、3pmol、4pmol、6pmoI>8pmoI> IOpmoI> 12pmoI)的Taqman探针FAM-TB ;反应条件为置63°C恒温水浴锅中60mino
[0123]2)用Bio-Rad公司的IQ5荧光定量仪检测荧光生成量，结果如图5 (横坐标表示反应时间，纵坐标表示荧光积累量)所示，可以看出当添加探针量为4pmol时，荧光上升的曲线最高，表明4pmol的探针量为最佳浓度。
[0124]3、同一 Taqman探针(FAM-TB)及相同添加量(4pmol)的结果重现性(6次)
[0125]在相同反应条件(置63°C恒温60min)下，在反应体系中添加相同量(4pmol)的Taqman探针FAM-TB，平行检测6次，以确定结果的重现性，包括以下步骤:
[0126]I)以含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA (用Promega的Wizard GenomicDNA purification Kit商品化DNA提取试剂盒提取待测样品中的核酸)为模板,在步骤一获得的四条引物和步骤二获得的Taqman探针FAM-TB的引导下进行LAMP扩增，其中，25uL LAMP反应体系内物质浓度为:含NDM-1基因的鲍曼不动杆菌的基因组DNA2 μ L，20mM Tris *HCl(pH8.8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4,0.1% Tween20，0.8M 甜菜碱(betaine),8mM MgSO4,1.4mM dNTP each，8U Bst DNA 聚合酶，加入的引物量为:40pmol CJXJ1FIP 和CJXJlBIP,5pmol CJXJ1F3 和 CJXJ1B3，4pmol Taqman 探针 FAM-TB ;反应条件为置 63°C恒温水浴锅中60min。
[0127]2)用Bio-Rad公司的IQ5荧光定量仪检测荧光生成量，结果如图6 (横坐标表示反应时间，纵坐标表示荧光累积量)所示，可以看出同一探针浓度下，曲线上升时间和高度基本一致，表明Taqman探针应用到LAMP具有很好的稳定性和重现性。
[0128]实施例3、基于Taqman探针的LAMP检测试剂盒[0129]将以下物质浓度的反应液:20mM Tris.HCl (pH8.8), IOmM KCI, IOmM(NH4)2SO4, 0.1% Tween20，0.8M 甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4L, 1.4mM dNTP each，8U BstDNA 聚合酶，以及作为阴性对照的不含DNA的LAMP扩增体系(双蒸水)共同包装，得到基于Taqman探针的LAMP检测的试剂盒。
【权利要求】
1.一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法的专用LAMP引物，是从美国基因数据库GenBank检索获得待测目的基因的核苷酸序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到特异性的LAMP保守靶序列，再根据LAMP保守靶序列设计LAMP引物。
2.根据权利要求1所述的专用LAMP引物，其特征在于:所述LAMP引物包括一条正向外引物F3、一条反向外引物B3、一条正向内引物FIP (FIP=Flc+F2)、一条反向内引物BIP(BIP=Blc+B2)。
3.根据权利要求1或2所述的专用LAMP引物，其特征在于:一种用在线LAMP引物设计软件设计LAMP引物的方法,是先登录LAMP引物设计软件Primer Explorer V4的在线网站(http: //primerexplorer.jp/e/),然后导入LAMP保守祀序列，软件自动生成LAMP引物，该软件的具体使用方法，可包括以下步骤: O单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认小于22kbp，支持三个类型的文件:普通文本格式(仅含序列)、FASTA格式和GenBank格式文件； 2)从下面三个选项中选择定参数设定条件(引物设计条件)，基于GC含量的自动判断，起始的参数是特定的:如果GC含量小于或等于45%，则选取AT丰度高的区，如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区，其它情况是标准设定状态； 3)整理软件自动设计出的LAMP引物，合成引物。
4.根据权利要求1或2或3所述的专用LAMP引物，其特征在于:当待测目的基因为NDM-1基因时，所述专用LAMP引物包括以下序列表示的引物组合: 正向外引物 CJXJ1F3:5’ -GCATAAGTCGCAATCCCCG-3’(序列表中序列 2)； 反向外引物 CJ XJ1B3:5’ -GGTTTGATCGTCAGGGATGG-3’(序列表中序列 3)； 正向内引物 CJXJ1FIP:5’ -CTGGCGGTGGTGACTCACGAAAAGCATGCAGCGCGTCCA-3’(序列表中序列4)； 反向内引物 CJXJ1BIP:5’ -CGCGACCGGCAGGTTGATCAAAAGGTCGATACCGCCTGGAC-3’(序列表中序列5)。
5.—种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法的专用Taqman探针,其设计原则如下: 1)探针位置尽可能地靠近LAMP保守靶序列的两端环状位置，具体的来说就是探针的位置在Fl和F3之间(将该探针命名为TF)，或者BI和B3之间(将该探针命名为TB)； 2)探针长度在15-45bp(最好是20-30bp)之间； 3)检测探针的DNA折置和二级结构； 4)Tm值在60-65°C之间，GC含量在40% -70%之间； 5)探针的5’端避免使用G鸟嘌呤； 6)整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量； 7)将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，需重新设计探针。
6.根据权利要求5所述的专用Taqman探针,其特征在于:所述TaqMan探针为经过突光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团可为FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA, ROX, CY3、CY5等，优选为FAM ;所述荧光淬灭基团可为BHQl、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse 等，优选为 BHQl。
7.根据权利要求5或6所述的专用Taqman探针，其特征在于:当待测目的基因为NDM-1基因时，所述Taqman探针序列如下: FAM-TF:5’ FAM-CATCAGGACAAGATGGGC-BHQ13’(序列表中序列 6)； FAM-TB:5’ FAM-TCCAGTTGAGGATCTGGGC-BHQ13’(序列表中序列 7)。
8.一种用权利要求1-4任一所述LAMP引物、权利要求5-7任一所述Taqman探针及环介导恒温扩增法检测待测样品中是否含有目的基因的方法，包括以下步骤: 1)配制23 μ L LAMP 反应液，其中各物质浓度为:20mM Tris.HCl (pH8.8), IOmMKCl,IOmM(NH4)2SO4,0.1% Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4,1.4mMdNTP each，8U BstDNA聚合酶，加入的引物量及Taqman探针量为:40pmol FIP和BIP，5pmol F3和B3，4pmolTF 或者 4pmol ； 2)按常规方法提取待测样品中的核酸； 3)取2μ L核酸提取液加入步骤I)配制的LAMP反应液中，使终反应体积为25 μ L，混匀反应液； 4)置60-650C (优选 630C )恒温 55_65min (优选 60min)进行 LAMP 扩增； 5)进行结果判读，方法为:曲线上升的样本判定为阳性结果；曲线没有上升的判定为阴性结果。
9.一种用于检测目的基因的基于Taqman探针的环介导恒温扩增法(LAMP)检测试剂盒，包含权利要求2-4任一所 述由一条正向外引物F3、一条反向外引物B3、一条正向内引物FIP (FIP=Flc+F2)和一条反向内引物BIP (BIP=Blc+B2)组成的LAMP引物组合，以及权利要求7所述Taqman探针TF或TB。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包含LAMP反应液，与LAMP引物和Taqman探针共同构成LAMP检测体系；23 μ L LAMP反应液中各物质浓度为:20mM Tris *HCl(pH8.8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4,0.1% Tween20，0.8M 甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4,1.4mM dNTP each，8U Bst DNA 聚合酶。
【文档编号】C12Q1/68GK103540660SQ201310469839
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】刘威, 黄留玉, 袁静, 杨展, 李环, 崔茜 申请人:中国人民解放军疾病预防控制所