牛呼吸道疾病综合征多重pcr检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒及其制备方法，涉及牛呼吸道疾病主要病毒检测领域，解决了检测牛呼吸道疾病综合征多联PCR方法存在无法同时有效检测牛呼吸道疾病综合征的四种病原的问题。该试剂盒包括MightyAmp?DNA聚合酶，2xBuffe?Mix缓冲液，无菌双蒸水，分别鉴定牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒以及牛副流感3型病毒的四对特异性引物，还包括上述四种病毒的阳性对照质粒。本发明可在同一反应体系中同时检测是否含有上述四种病毒的核酸，特异性和敏感性较高，可对牛群中隐形感染或持续带毒宿主和发病动物进行准确检测，无感染性，安全性高，可在短时间检测出结果，省时省力。
【专利说明】牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及牛呼吸道疾病主要病毒的检测【技术领域】，具体涉及一种牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]随着我国进出口贸易和养牛业的快速发展，牛系统性疾病时有发生且危害严重，研究表明，牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratorydisease compLex,简称BRDC)是由于牛生产运输和早期断奶造成的主要系统性疾病之一，由多个致病因子或病原包括应激、病毒和细菌的共同作用引起的，因此病毒的潜在感染是造成该病的重要原因，也是导致牛呼吸道疾病的启动器。在牛呼吸道疾病中分离出的病毒主要包括牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛副流感3型病毒(BPI3)，这些病毒常常形成持续型感染，且急性感染更容易造成大面积的死亡，一旦感染，将会严重影响架子牛生长及奶牛的产奶量和牛奶的质量。
[0003]目前，对牛呼吸道疾病综合征的检测采用国家标准规定的血清中和试验方法以及多联PCR方法，由于牛呼吸道疾病综合征存在潜伏感染和长期排毒，血清中和试验方法操作复杂且费时费力，进口产品价格昂贵，检测成本也较高，并且局限在实验室操作，很难实现推广和应用；多联PCR方法对牛呼吸道疾病综合征的检测灵敏高效、经济简便，适合推广应用，多联PCR方法在疾病的诊断中也是常规的检测方法有着重要的意义，更适合牛呼吸道疾病综合征的检测，但是，目前多联PCR方法在检测时主要是针对牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛副流感3型病毒(BPI3)建立的PCR检测方法，因牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)基因组的特殊性，给同一体系同时检测牛呼吸道疾病综合征的四种病原带来极大困难，而临床往往会发生同时感染的情况，因此，迫切需要建立一种能同时检测牛呼吸道疾病综合征的四种病原的多重PCR检测试剂盒。
【发明内容】
[0004]为了解决现有检测牛呼吸道疾病综合征的多联PCR方法存在的无法同时有效检测牛呼吸道疾病综合征的四种病原的问题，本发明提供一种牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒及其制备方法。
[0005]本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下:
[0006]牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒，该试剂盒包括:
[0007]MightyAmp DNA聚合酶、2xBuffe Mix缓冲液、无菌双蒸水、四对特异性引物和四个阳性对照质粒；
[0008]所述四对特异性引物分别为:鉴定牛传染性鼻气管炎病毒的引物P1和P2，鉴定牛呼吸道合胞体病毒的引物P3和P4,鉴定牛病毒性腹泻病毒的引物P5和P6,鉴定牛副流感3型病毒的引物P7和P8:
[0009]P1:5’-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3’，[0010]P2:5，-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3，，[0011]P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’，
[0012]P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’，
[0013]P5:5’-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3’，
[0014]P6:5’-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3’ ，
[0015]P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’ ，
[0016]P8:5’-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3’ ；
[0017]所述四个阳性对照质粒分别为:牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒、牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒、牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒和牛副流感3型病毒阳性对照质粒;
[0018]所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒为含有306个碱基的核苷酸片段构成的pMDlS-T重组质粒，所述牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒为含有600个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒，所述牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒为含有130个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒，所述牛副流感3型病毒阳性对照质粒为含有425个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒；
[0019]所述含有306个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒、含有600个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒、含有130个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒和含有425个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒均能在大肠杆菌DH5 a感受态细胞中增殖。
[0020]所述含有306个碱基的核苷酸片段的序列为:
[0021]GCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTGGGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGGGTGCCGCGCTCTCGACCGTGTCGGGCATCGCCTCGTTTATTGCGAACCCGTTCGGCGCGCTGGCCACGGGGCTGCTGGTGCTCGCCGGGCTGGTGGCCGCTTTCCTGGCGTACCGGTACATTTCCCGCCTCCGCAGCAACCCCATGAAGGCGCTGTACCCGATCACCACGCGCGCGCTCAAGGACGACGCCCGGGGCGCAACCGCCCCGGGCGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACGC ；
[0022]所述含有600个碱基的核苷酸片段的序列为:
[0023]TATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGT ；
[0024]所述含有130个碱基的核苷酸片段的序列为:
[0025]GGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAG ；
[0026]所述含有425个碱基的核苷酸片段的序列为:
[0027]GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAACCCAGAATTGTATTTAACATCAAATGGTAGTAATGCAGATGTTAAGTATGT
CATCTACATGATAGAGAAAGACCCAGGAAGACAAAAATATGGTGGGTTAGTAGTCAAGACTAGAGAGATGGTTTATG
AAAAGACAACCGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGATAATATGTTGCAAAATGGTAGAGGCACT
TCTACAATTGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGGTATCCATCATGTCTTGGAGCTCTAATAATCCAGATTTGGATAAT
ACTTGTCAAGGCTATAACCAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGGTTo
[0028]该试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为蒸馏水。
[0029]所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到长度为306bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒；
[0030]P1:5’-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3’，
[0031]P2:5’-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3’ ；
[0032]得到的牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒的序列为:
[0033]ATGCAGTGAATGATTACGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTGGGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGGGTGCCGCGCTCTCGACCGTGTCGGGCATCGCCTCGTTTATTGCGAACCCGTTCGGCGCGCTGGCCACGGGGCTGCTGGTGCTCGCCGGGCTGGTGGCCGCTTTCCTGGCGTACCGGTACATTTCCCGCCTCCGCAGCAACCCCATGAAGGCGCTGTACCCGATCACCACGCGCGCGCTCAAGGACGACGCCCGGGGCGCAACCGCCCCGGGCGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACGCAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTT。
[0034]所述牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛呼吸道合胞体病毒的NP基因为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增，得到长度为600bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒；
[0035]P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’ ，
[0036]P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’ ；
[0037]得到的牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒的序列为:
[0038]TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCo
[0039]所述牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛病毒性腹泻病毒的5’ -UTR基因为模板，以P5和P6为引物进行PCR扩增，得到长度为130bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒；
[0040]P5:5’-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3’ ，
[0041]P6: 5，-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3，；
[0042]得到的牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒的序列为:[0043]TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAGAATCGTCGACCTGCAGGCATo
[0044]所述牛副流感3型病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛副流感3型病毒的NP基因为模板，以P7和P8为引物进行PCR扩增，得到长度为425bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到牛副流感3型病毒阳性对照质粒；
[0045]P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’ ，
[0046]P8:5’-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3’ ；
[0047]得到的牛副流感3型病毒阳性对照质粒的序列为:
[0048]ATGCAGTGAATGATTACGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAACCCAGAATTGTATTTAACATCAAATGGTAGTAATGCAGATGTTAAGTATGTCATCTACATGATAGAGAAAGACCCAGGAAGACAAAAATATGGTGGGTTAGTAGTCAAGACTAGAGAGATGGTTTATGAAAAGACAACCGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGATAATATGTTGCAAAATGGTAGAGGCACTTCTACAATTGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGGTATCCATCATGTCTTGGAGCTCTAATAATCCAGATTTGGATAATACTTGTCAAGGCTATAACCAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGGTTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGo
[0049]牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒的制备方法，该方法的条件和步骤如下:[0050](I)配制PCR反应液:所述PCR反应液包括MightyAmp DNA聚合酶、2xBuffer Mix缓冲液、无菌双蒸水和四对特异性引物；
[0051]所述四对特异性引物分别为:鉴定牛传染性鼻气管炎病毒的引物P1和P2，鉴定牛呼吸道合胞体病毒的引物P3和P4,鉴定牛病毒性腹泻病毒的引物P5和P6,鉴定牛副流感3型病毒的引物P7和P8:
[0052]P1:5’-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3’，
[0053]P2:5，-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3，，
[0054]P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’，
[0055]P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’，
[0056]P5:5’-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3’，
[0057]P6:5’-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3’，
[0058]P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’，
[0059]P8:5’-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3’ ；
[0060](2)建立四个阳性对照质粒:
[0061]所述四个阳性对照质粒分别为:牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒、牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒、牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒和牛副流感3型病毒阳性对照质粒;
[0062]所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒为含有306个碱基的核苷酸片段构成的pMDlS-T重组质粒，所述牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒为含有600个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒，所述牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒为含有130个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒，所述牛副流感3型病毒阳性对照质粒为含有425个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒；
[0063]所述含有306个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒、含有600个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒、含有130个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒和含有425个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒均能在大肠杆菌DH5 α感受态细胞中增殖；
[0064](3)阴性对照:所述阴性对照为蒸馏水。
[0065]所述含有306个碱基的核苷酸片段的序列为:
[0066]GCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTGGGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGGGTGCCGCGCTCTCGACCGTGTCGGGCATCGCCTCGTTTATTGCGAACCCGTTCGGCGCGCTGGCCACGGGGCTGCTGGTGCTCGCCGGGCTGGTGGCCGCTTTCCTGGCGTACCGGTACATTTCCCGCCTCCGCAGCAACCCCATGAAGGCGCTGTACCCGATCACCACGCGCGCGCTCAAGGACGACGCCCGGGGCGCAACCGCCCCGGGCGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACGC ；
[0067]所述含有600个碱基的核苷酸片段的序列为:
[0068]TATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGT ；
[0069]所述含有130个碱基的核苷酸片段的序列为:
[0070]GGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAG ；
[0071]所述含有425个碱基的核苷酸片段的序列为:
[0072]GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAACCCAGAATTGTATTTAACATCAAATGGTAGTAATGCAGATGTTAAGTATGTCATCTACATGATAGAGAAAGACCCAGGAAGACAAAAATATGGTGGGTTAGTAGTCAAGACTAGAGAGATGGTTTATGAAAAGACAACCGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGATAATATGTTGCAAAATGGTAGAGGCACTTCTACAATTGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGGTATCCATCATGTCTTGGAGCTCTAATAATCCAGATTTGGATAATACTTGTCAAGGCTATAACCAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGGTTo
[0073]所述牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛呼吸道合胞体病毒的NP基因为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增，得到长度为600bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒；
[0074]P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’ ，
[0075]P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’ ；
[0076]得到的牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒的序列为:
[0077]TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATC
【权利要求】
1.牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括: MightyAmp DNA聚合酶、2xBuffe Mix缓冲液、无菌双蒸水、四对特异性引物和四个阳性对照质粒； 所述四对特异性引物分别为:鉴定牛传染性鼻气管炎病毒的引物P1和P2，鉴定牛呼吸道合胞体病毒的引物P3和P4,鉴定牛病毒性腹泻病毒的引物P5和P6,鉴定牛副流感3型病毒的引物P7和P8:
P1:5’-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3’，
P2:5’-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3’ ，
P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’，
P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’ ，
P5:5，-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3，，
P6:5’-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3’，
P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’，
P8:5’-AACCCCTTCCTCA ATCCTGATATAC-3’ ； 所述四个阳性对照质粒分别为:牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒、牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒、牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒和牛副流感3型病毒阳性对照质粒; 所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒为含有306个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒，所述牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒为含有600个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒，所述牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒为含有130个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒，所述牛副流感3型病毒阳性对照质粒为含有425个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒； 所述含有306个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒、含有600个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒、含有130个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒和含有425个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒均能在大肠杆菌DH5 α感受态细胞中增殖。
2.根据权利要求1所述的牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述含有306个碱基的核苷酸片段的序列为:
GCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTGGGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGGGTGCCGCGCTCTCGACCGTGTCGGGCATCGCCTCGTTTATTGCGAACCCGTTCGGCGCGCTGGCCACGGGGCTGCTGGTGCTCGCCGGGCTGGTGGCCGCTTTCCTGGCGTACCGGTACATTTCCCGCCTCCGCAGCAACCCCATGAAGGCGCTGTACCCGATCACCACGCGCGCGCTCAAGGACGACGCCCGGGGCGCAACCGCCCCGGGCGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACGC ； 所述含有600个碱基的核苷酸片段的序列为:
TATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGT ； 所述含有130个碱基的核苷酸片段的序列为:
GGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAG ； 所述含有425个碱基的核苷酸片段的序列为:
GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAACCCAGAATTGTATTTAACATCAAATGGTAGTAATGCAGATGTTAAGTATGTCATCTACATGATAGAGAAAGACCCAGGAAGACAAAAATATGGTGGGTTAGTAGTCAAGACTAGAGAGATGGTTTATGAAAAGACAACCGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGATAATATGTTGCAAAATGGTAGAGGCACTTCTACAATTGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGGTATCCATCATGTCTTGGAGCTCTAATAATCCAGATTTGGATAATACTTGTCAAGGCTATAACCAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGGTTo
3.根据权利要求1所述的牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为蒸馏水。
4.根据权利要求1所述的牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到长度为306bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒；
P1:5’-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3’，
P2:5’-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3’ ； 得到的牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒的序列为:
ATGCAGTGAATGATTACGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTGGGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGGGTGCCGCGCTCTCGACCGTGTCGGGCATCGCCTCGTTTATTGCGAACCCGTTCGGCGCGCTGGCCACGGGGCTGCTGGTGCTCGCCGGGCTGGTGGCCGCTTTCCTGGCGTACCGGTACATTTCCCGCCTCCGCAGCAACCCCATGAAGGCGCTGTACCCGATCACCACGCGCGCGCTCAAGGACGACGCCCGGGGCGCAACCGCCCCGGGCGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACGCAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTT。
5.根据权利要求1所述的牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛呼吸道合胞体病毒的NP基因为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增，得到长度为600bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒；
P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’，
P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’ ； 得到的牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒的序列为:
TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCo
6.根据权利要求1所述的牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛病毒性腹泻病毒的5’-UTR基因为模板，以？5和P6为引物进行PCR扩增，得到长度为130bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒；
P5:5，-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3，，
P6:5’-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3’ ； 得到的牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒的序列为:TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGT TGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAGAATCGTCGACCTGCAGGCATo
7.根据权利要求1所述的牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述牛副流感3型病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛副流感3型病毒的NP基因为模板，以？7和P8为引物进行PCR扩增，得到长度为425bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到牛副流感3型病毒阳性对照质粒；
P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’ ，
P8:5’-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3’ ； 得到的牛副流感3型病毒阳性对照质粒的序列为:
ATGCAGTGAATGATTACGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAACCCAGAATTGTATTTAACATCAAATGGTAGTAATGCAGATGTTAAGTATGTCATCTACATGATAGAGAAAGACCCAGGAAGACAAAAATATGGTGGGTTAGTAGTCAAGACTAGAGAGATGGTTTATGAAAAGACAACCGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGATAATATGTTGCAAAATGGTAGAGGCACTTCTACAATTGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGGTATCCATCATGTCTTGGAGCTCTAATAATCCAGATTTGGATAATACTTGTCAAGGCTATAACCAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGGTTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGo
8.制备权利要求1所述的牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒的方法，其特征在于，该方法的条件和步骤如下: (I)配制PCR反应液:所述PCR反应液包括MightyAmp DNA聚合酶、2xBuffer Mix缓冲液、无菌双蒸水和四对特异性引物； 所述四对特异性引物分别为:鉴定牛传染性鼻气管炎病毒的引物P1和P2，鉴定牛呼吸道合胞体病毒的引物P3和P4,鉴定牛病毒性腹泻病毒的引物P5和P6,鉴定牛副流感3型病毒的引物P7和P8:
P1:5’-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3’，
P2:5’-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3’ ，
P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’，P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’，
P5:5，-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3，，
P6:5’-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3’，
P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’，
P8:5’-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3’ ； (2)建立四个阳性对照质粒: 所述四个阳性对照质粒分别为:牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒、牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒、牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒和牛副流感3型病毒阳性对照质粒; 所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒为含有306个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒，所述牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒为含有600个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒，所述牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒为含有130个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒，所述牛副流感3型病毒阳性对照质粒为含有425个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒； 所述含有306个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒、含有600个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒、含有130个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒和含有425个碱基的核苷酸片段构成的PMD18-T重组质粒均能在大肠杆菌DH5 a感受态细胞中增殖； (3)阴性对照:所述阴性对照为蒸馏水。
9.根据权利要求8所述的牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述含有306个碱基的核苷酸片段的序列为:
GCTCGCCAACTTCTTTCAGGGCCTGGGCGCCGTCGGGCAGGCGGTGGGCACGGTGGTGCTGGGCGCCGCGGGTGCCGCGCTCTCGACCGTGTCGGGCATCGCCTCGTTTATTGCGAACCCGTTCGGCGCGCTGGCCACGGGGCTGCTGGTGCTCGCCGGGCTGGTGGCCGCTTTCCTGGCGTACCGGTACATTTCCCGCCTCCGCAGCAACCCCATGAAGGCGCTGTACCCGATCACCACGCGCGCGCTCAAGGACGACGCCCGGGGCGCAACCGCCCCGGGCGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACGC ； 所述含有600个碱基的核苷酸片段的序列为:
TATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGT ； 所述含有130个碱基的核苷酸片段的序列为:
GGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAG ； 所述含有425个碱基的核苷酸片段的序列为:GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAACCCAGAATTGTATTTAACATCAAATGGTAGTAATGCAGATGTTAAGTATGTCATCTACATGATAGAGAAAGACCCAGGAAGACAAAAATATGGTGGGTTAGTAGTCAAGACTAGAGAGATGGTTTATGAAAAGACAACCGACTGGATGTTCGGGAGTGATCTTGAGTATGATCAAGATAATATGTTGCAAAATGGTAGAGGCACTTCTACAATTGAGGATCTTGTTCATACTTTTGGGTATCCATCATGTCTTGGAGCTCTAATAATCCAGATTTGGATAATACTTGTCAAGGCTATAAC CAGTATATCAGGATTGAGGAAGGGGTT。
10.根据权利要求8所述的牛呼吸道疾病综合征多重PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛呼吸道合胞体病毒的NP基因为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增，得到长度为600bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒；
P3:5’-TATGCTATGTCCCGATTGG-3’，
P4:5’-ACTGATTTGGCTAGTACACCC-3’ ； 得到的牛呼吸道合胞体病毒阳性对照质粒的序列为:
TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTATGCTATGTCCCGATTGGGGAGAGAAGATACCCTTAAAATACTCAAAGATGCAGGCTACCAAGTGAGGGCCAATGGGGTTGATGTGATAACACATCGACAGGATGTGAATGGAAAAGAAATGAAATTTGAAGTGCTAACATTAGTCAGCTTAACATCAGAAGTTCAAGGTAATATAGAAATAGAGTCAAGGAAGTCTTACAAAAAGATGCTAAAAGAGATGGGAGAGGTAGCTCCAGAATACAGACATGACTTTCCTGATTGTGGTATGATAGTGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTATAACAAAATTAGCAGCAGGTGATAGGTCAGGCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCAACAATGTACTAAGGAATGAAATGAAACGATACAAAGGACTCATCCCGAAAGATATAGCCAACAGCTTCTATGAAGTATTTGAAAAGTACCCTCATTACATAGATGTATTCGTACATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAACTAGAGGAGGTAGTAGGGTAGAAGGAATCTTTGCAGGGTTATTCATGAATGCATATGGAGCAGGTCAAGTGATGTTAAGATGGGGTGTGCTAGCCAAATCAGTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGC ； 所述牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛病毒性腹泻病毒的5’ -UTR基因为模板，以P5和P6为引物进行PCR扩增，得到长度为130bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒；
P5:5，-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3，，
P6:5’-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3’ ； 得到的牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒的序列为:
TTACGTGCATTCGATTTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAAGGCTGAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCTTCGGAGGACAAGCCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCATGCCCACAGCACATCTTAACCTGAGAATCGTCGACCTGCAGGCAT ； 所述牛副流感3型病毒阳性对照质粒通过以下方法制备:以牛副流感3型病毒的NP基因为模板，以NP1和NP2为引物进行PCR扩增，得到长度为425bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至PMD18-T载体，得到牛副流感3型病毒阳性对照质粒；
P7:5’-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3’ ，`
P8:5’-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3’ ； 得到的牛副流感3型病毒阳性对照质粒的序列为:
ATGCAGTGAATGATTACGATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTTTGGACAACGAAAAGCAACATGCACAACGAGCCGGATTTCTAGTCTCTCTGTTATCAATGGCCTATGCCAAC
【文档编号】C12Q1/70GK103498009SQ201310470178
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】郭利, 王炜, 杨艳玲, 武华, 张淑琴, 李光玉, 陈立志, 程世鹏, 杨福合, 李春义, 温永俊, 王凤雪, 孙娜, 王建科, 易立 申请人:中国农业科学院特产研究所, 华威特（北京）生物科技有限公司