专利名称：一种牡丹芍药远缘杂交的亲本组合方法
技术领域：
本发明涉及一种牡丹芍药远缘杂交的亲本组合方法。
背景技术：
芍药科芍药属分三个组牡丹组、芍药组和北美芍药组，而牡丹组又分革质花盘和肉质花盘两个亚组，组内的8个自然野生种全部原产中国，栽培品种也起源于中国。杂交育种为全世界牡丹芍药的繁荣做出了巨大贡献，特别是远缘杂交，是最重要的变异来源，许多优良品种均来源于此。
牡丹芍药的远缘杂交育种开始于19世纪的法国，至今已有100多年的历史，选育出的大量新品种已经成功改写了世界牡丹芍药的品种结构和面貌，对我国造成了巨大冲击。我国虽然拥有世界上最丰富的牡丹芍药种质资源，品种改良和育种工作也一直是牡丹芍药科研和生产的主要内容，但是在远缘杂交育种方面已处于远远落后的状态，这也为我国牡丹芍药生产的可持续发展与参与国际竞争潜伏下了危险。随着花卉产业发展的需要以及牡丹在全球的推广普及，牡丹杂交育种的发展势头强劲，特别是欧美等地广泛进行的远缘杂交育种前景更为诱人。始于日本、盛在欧美的组间杂交育种，即木本牡丹与草本芍药之间的远缘杂交，因其新品种花期长、花色奇、适宜性强，更显示出巨大潜力，为牡丹芍药育种开辟出了一片新天地，代表着杂交育种发展的必然方向之一。
我国从南宋时期就开始利用天然杂交的实生苗选育牡丹新品种，明、清时期及解放后实生选种的规模更大，但实生选种具有随机性和一定局限性，后期人工选育比较被动，因而解放后，牡丹人工定向杂交育种在我国逐渐发展起来，如菏泽采用单一及混合授粉等多种方式进行人工杂交；甘肃开展了多年的西北牡丹品种群与中原及江南品种群间的杂交工作；北京的景山公园、故宫等地也进行了少量的牡丹定向杂交。但是这些人工杂交多数局限在同一亚组内或同一品种群内进行，杂交中利用的种质有限，野生种质几乎不曾被利用到，而且长期的近缘杂交使得品种群内基因资源的挖掘潜力逐渐降低，因此牡丹远缘杂交育种势在必行。
牡丹芍药的远缘杂交育种在欧美等取得巨大成功的事实表明，远缘杂交极易发生杂交败育，杂交亲本的选择与配合始终是其杂交是否成功的关键。在我国整体牡丹芍药远缘杂交育种水平相对比较落后的情况下，如能充分利用我国丰富的优良种质资源、科学地使用多种育种技术和手段，大量而广泛的进行远缘杂交，以获得配合力较高的杂交组合以及亲和力强的核心种质，将为今后培育出大量优质新品种奠定基础，迅速提升我国牡丹芍药产业的生产水平。
发明内容
本发明提供一种能够充分利用牡丹芍药众多的种质资源，筛选配合力较高的杂交组合与亲和力强的杂交亲本的牡丹芍药远缘杂交的亲本组合方法，并获得远缘杂交材料，为最终选育新品种提供种质。
本发明是这样实现的 一种牡丹芍药远缘杂交的亲本组合方法，它包括亲本材料的选择、花粉采集贮藏与萌发检测、杂交配合及药剂处理技术、杂种萌发催芽与幼苗管理措施。
在亲本的选择措施中，所选亲本为 芍药实生苗1#群体、 远缘杂交牡丹品种‘金帝’、‘金阁’、‘正午’和‘Golden Era’， 紫斑牡丹品种‘书生捧墨’和紫牡丹。
在亲本的选择措施中，所选母本为芍药实生苗1#群体、远缘杂交牡丹品种‘正午’。
在亲本的选择措施中，杂交组合方式为 芍药实生苗1#群体(♀)X‘金帝’(♂)； 芍药实生苗1#群体(♀)X‘金阁’(♂)； 芍药实生苗1#群体(♀)X‘正午’(♂)； 芍药实生苗1#群体(♀)X‘Golden Era’(♂)； 芍药实生苗1#群体(♀)X紫牡丹(♂)； 芍药实生苗1#群体(♀)X‘书生捧墨’； ‘正午’(♀)X芍药实生苗1#群体(♂)； ‘正午’(♀)X‘书生捧墨’(♂)。
本发明方法适宜于多种野生及栽培牡丹芍药品种的远缘杂交育种。在杂交过程中，除利用本发明提供的8种成功的杂交组合外，还可以利用亲和力强的核心种质作亲本来调节另一杂交亲本的种类或改用其它药剂处理技术，都有可能获得杂交种子与杂种幼苗。
本发明提供了牡丹芍药远缘杂交育种成功的多个杂交组合并在结合牡丹芍药开花生物学研究和杂交育种实际的基础上，总结出一套从花粉采集、保存、去雄、套袋到授粉的基本操作程序和提高杂交亲和力的方法。
本发明实现了我国在牡丹芍药远缘杂交方面零的突破，标志着我国在该领域的研究与实践开始与国际水平同步，并奠定了持续发展和进一步深入研究的基础。美国育种家近几十年之所以能够培育出的大批牡丹芍药远缘杂交优良品种，最直接的因素之一是他们发现并应用了Paeonia lactiflora‘Martha Washington’和P.delavayi var.lutea X P.xsuffruticosa‘Golden Era’等少数几个亲和力强的亲本材料，并将其应用在多种杂交组合中得到了419粒杂交种子和10株远缘杂种苗，为今后最终选育质新品种奠定了基础。相信牡丹芍药远缘杂交育种技术及成功组合在我国的推广应用，以及进一步对核心种质的开发利用，将是我国牡丹芍药产业在未来保持世界领先水平的重要依靠。该方法也可以适用于多种牡丹芍药品种或野生种，可进行大量而广泛的杂交，以获得杂种幼苗，为今后选育新品种提供种质。
图1为本发明的杂交套袋、杂交种子及杂种苗实物照片。
图中1.杂交套袋； 2～8.采收到的杂交种子，其中 2.‘正午’ב书生捧墨’，3.实生苗1#ב金帝’， 4.实生苗1#בGolden Era’， 5.实生苗1#ב金阁’， 6.实生苗1#ב正午’，7.实生苗1#ב书生捧墨’， 8.实生苗1#×紫牡丹)； 9.GA3(0.005％)+硼酸(0.01％)溶液涂抹柱头后25天的杂交心皮(a.‘凤丹白’未涂抹，b.‘凤丹白’涂抹，c.‘书生捧墨’涂抹)； 10.杂交种子(正午’×实生苗1#)； 11～12.2005年5月30号2年生的杂种苗，其中 11.实生苗1#ב金帝’， 12.实生苗1#ב书生捧墨’。
具体实施例方式 本发明是利用现有优良牡丹芍药种质资源和远缘杂交育种技术筛选配合力高的杂交组合与亲和力强的亲本材料。该方法包括亲本材料的选择与组合、花粉采集贮藏与萌发检测、杂交与药剂处理、种子萌发与幼苗管理等环节。该方法可以适用于多种牡丹芍药品种或野生种，可进行大量而广泛的杂交，以获得杂种幼苗，为今后选育新品种提供种质。
(1)外植体材料 使用本发明的方法可进行多种牡丹芍药的杂交育种，如实生苗1#、紫斑牡丹、紫牡丹、黄牡丹的远缘杂交后代品种、各种野生牡丹、芍药或其它园艺栽培品种等。
(2)远缘杂交的种子和杂种幼苗 本发明方法可用于牡丹芍药远缘杂交育种，或进行与育种相关的生物学、遗传学研究。通过本方法获得的杂交种子和杂种幼苗适用于多种目的和应用，包括但不限于繁殖、组培增殖、作为育种中间材料进行选育、直接观赏栽培、进行诱变选种、突变体筛选或为进一步的分子生物学研究提供受体材料等。
(3)实施例材料及方法 材料杂交亲本材料为1个芍药实生苗群体和18种牡丹芍药与，包括远缘杂交牡丹品种‘正午’、‘金帝’、‘金阁’、‘Golden Era’，杨山牡丹品种‘凤丹白’、紫斑牡丹品种‘书生捧墨’及黄牡丹和紫牡丹。
方法摘取即将开放的花蕾回室内，去掉花瓣，晾干24h后轻拍至花粉完全散出、收集、装入干净的称量瓶，置冰箱内-7或-18℃贮藏备用。授粉前用悬滴培养法检测花粉萌发率培养温度25℃，培养液10％蔗糖+100或1000ppm硼酸，培养8h后每处理观测3个视野，萌发率取平均值。开花前1～2天去雄套袋，柱头大量分泌粘液时，选无风的上午连续3天授粉3次，15天后去袋。部分组合用药剂分组每授粉前喷施(10朵/组)柱头。7月底至8月中、下旬种子陆续成熟，当心皮蟹黄微裂时摘下，剥出种子，统计结实率。种子用2％NaClO液浸15～20min，蒸馏水洗3次后100ppmGA3浸5h，稍晾干后湿沙储藏于人工气候室，保持温度约15℃2～3个月，待生根后随即播种于大田。翌年出苗后常规管理。
这些材料和方法是下面的实施例所共同使用的。
实施例1 (1)在实生苗1#开花前1～2天将要杂交的花朵去雄套袋。
(2)摘取‘金帝’即将开放的花蕾回室内，去掉花瓣，晾干24h后轻拍至花粉完全散出、收集、装入干净的称量瓶，置冰箱内-7或-18℃贮藏备用。授粉前用悬滴培养法检测花粉萌发率。
(3)实生苗1#将要杂交的花朵的柱头大量分泌粘液时，选无风的上午连续3天授‘金帝’的花粉3次。15天后去袋。
(4)7月底至8月中旬种子陆续成熟，当心皮蟹黄微裂时摘下剥出种子，统计结实率。
(5)种子用2％NaClO液浸15～20min，蒸馏水洗3次后再用0.01％的GA3溶液浸种5h，稍晾干后，用湿沙储藏于人工气候室，保持温度约15℃，2～3个月，待生根后随即播种于大田。翌年出苗后常规管理。
实施例2 (1)在实生苗1#开花前1～2天将要杂交的花朵去雄套袋。
(2)摘取‘书生捧墨’即将开放的花蕾回室内，去掉花瓣，晾干24h后轻拍至花粉完全散出、收集、装入干净的称量瓶，置冰箱内-7或-18℃贮藏备用。授粉前用悬滴培养法检测花粉萌发率。
(3)实生苗1#将要杂交的花朵的柱头大量分泌粘液时，选无风的上午连续3天授‘书生捧墨’的花粉3次。15天后去袋。
(4)7月底至8月中旬种子陆续成熟，当心皮蟹黄微裂时摘下剥出种子，统计结实率。
(5)种子用2％NaClO液浸15～20min，蒸馏水洗3次后再用0.01％的GA3溶液浸种5h，稍晾干后，用湿沙储藏于人工气候室，保持温度约15℃，2～3个月，待生根后随即播种于大田。翌年出苗后常规管理。
实施例3 (1)在实生苗1#开花前1～2天将要杂交的花朵去雄套袋。
(2)摘取‘Golden Era’即将开放的花蕾回室内，去掉花瓣，晾干24h后轻拍至花粉完全散出、收集、装入干净的称量瓶，置冰箱内-7或-18℃贮藏备用。
(3)实生苗1#将要杂交的花朵的柱头大量分泌粘液时，选无风的上午连续3天授‘Golden Era’的花粉3次。15天后去袋。
(4)7月底至8月中旬种子陆续成熟，当心皮蟹黄微裂时摘下，剥出种子，统计结实率。
(5)种子用用0.01％的GA3溶液浸种5h，稍晾干后播种于大田。翌年出苗后常规管理。
实施例4 (1)在‘正午’开花前1～2天将要杂交的花朵去雄套袋或不去雄直接套袋。
(2)摘取实生苗1#即将开放的花蕾回室内，去掉花瓣，晾干24h后轻拍至花粉完全散出、收集、装入干净的称量瓶，置冰箱内-7或-18℃贮藏备用。授粉前用悬滴培养法检测花粉萌发率。
(3)‘正午’将要杂交的花朵的柱头大量分泌粘液时，选无风的上午连续3天授实生苗1#的花粉3次。15天后去袋。
(4)7月底至8月中旬种子陆续成熟，当心皮蟹黄微裂时摘下剥出种子，统计结实率。
(5)种子用2％NaClO液浸15～20min，蒸馏水洗3次后再用0.01％的GA3溶液浸种5h，稍晾干后，用湿沙储藏于人工气候室，保持温度约15℃，2～3个月，待生根后随即播种于大田。翌年出苗后常规管理。
实施例5 (1)在‘正午’开花前1～2天将要杂交的花朵去雄套袋或不去雄直接套袋。。
(2)摘取‘书生捧墨’即将开放的花蕾回室内，去掉花瓣，晾干24h后轻拍至花粉完全散出、收集、装入干净的称量瓶，置冰箱内-7或-18℃贮藏备用。授粉前用悬滴培养法检测花粉萌发率。
(3)‘正午’将要杂交的花朵的柱头大量分泌粘液时，选无风的上午连续3天授‘书生捧墨’的花粉3次。15天后去袋。
(4)7月底至8月中旬种子陆续成熟，当心皮蟹黄微裂时摘下，剥出种子，统计结实率。
(5)种子用2％NaClO液浸15～20min，蒸馏水洗3次后再用0.01％的GA3溶液浸种5h，稍晾干后，用湿沙储藏于人工气候室，保持温度约15℃，2～3个月，待生根后随即播种于大田。翌年出苗后常规管理。
具体试验过程如下 摘取即将开放的花蕾回室内，去掉花瓣，晾干24h后轻拍至花粉完全散出、收集、装入干净的称量瓶，置冰箱内-7或-18℃贮藏备用。授粉前用悬滴培养法检测花粉萌发率培养温度25℃，培养液10％蔗糖+100或1000ppm硼酸，培养8h后每处理观测3个视野，萌发率取平均值。开花前1～2天去雄套袋，柱头大量分泌粘液时，选无风的上午连续3天授粉3次，15天后去袋。部分组合用药剂分组处理(10朵/组)柱头CK(对照不作处理，下同)、GA3(50ppm)、GA3+蔗糖(10％)、GA3′(100ppm)、GA3′+蔗糖(10％)，GA3(50ppm)+硼酸(100ppm)、GA3′(100ppm)+硼酸(100ppm)，每次授粉前喷施。
7月底至8月中、下旬种子陆续成熟，当心皮蟹黄微裂时摘下，剥出种子，统计结实率。种子用2％NaClO液浸15～20min，蒸馏水洗3次后100ppmGA3浸5h，稍晾干后湿沙储藏于人工气候室，保持温度约15℃2～3个月，待生根后随即播种于大田。翌年出苗后常规管理。
试验结果与分析 连续4年的杂交试验共做了31种杂交组合、787朵花，如图1中“1”。从中筛选出结实率较高的8种组合(表1)。表2所示，在这8种组合中，父本‘书生捧墨’的花粉萌发率高，较耐贮藏，-18℃贮藏23天后萌发率仍大于50％，因此杂交中可进行异地采粉并适当贮藏一段时间；实生苗1#及紫牡丹与黄牡丹的混合花粉的萌发率在30～40％之间，应能满足杂交所需；而‘金帝’与‘金阁’的极低，‘正午’的花粉在各种营养液中都没萌发。因花粉活力随贮藏天数的延长而逐渐降低，故杂交时应随采随用，若用贮藏花粉，则应增加授粉量与授粉次数。
表1 杂交组合与结实情况(2003～2005) 表2 花粉萌发率的测定
表3所示，在这8种组合中，2种母本材料‘正午’与实生苗1#自花不结实，天然授粉却可得到少量种子，可以作为杂交母本，且无自身花粉污染，但要选择与之亲和力较高的父本才可能获得种子。
表3 母本自花与天然授粉的结实情况(2002-2004) 表1所示，筛选出的结实率较高的8种杂交组合可分为3种类型①牡丹×牡丹，如组合4中，以黄牡丹远缘杂交的F1代品种‘正午’为母本同紫斑牡丹‘书生捧墨’杂交可以获得0.09(粒/朵)的结实率，如图1中“2”。②芍药×牡丹，如组合1、2、3、6、7、8，其中组合1、7的结实率较高，分别为9.38与8.14，如图1中“3-4”；组合3、6的结实率分别为1.52与2.36，如图1中“5-6”，而已测组合1、3、6中父本‘金帝’、‘金阁’与‘正午’的花粉萌发率极低，说明这3种组合的亲和力较高，可进行持续育种以观察后代表现；组合2、8中，父本‘书生捧墨’及紫牡丹的花粉萌发率较高，但与实生苗1#杂交的结实率较低，如图1中“7-8”，说明这2种组合亲本间的亲和力不强。③牡丹×芍药，如组合中5，其结实率为0.17，如图1中“9”，但这些种子多数都略有皱缩，沙藏不萌发，这也与欧美的经验相似。此外，相同组合的结实率在不同年份或正反交中出现差异，如组合1是较优的杂交组合，但以2005年的结实率最高，2004年的最低；而芍药与牡丹正交的结实率远高于反交的，如组合6的结实率2.36远高于组合5的0.17。在4年(2002～2005)杂交试验筛选出的8种结实率较高的组合中，6种是以实生苗1#为亲本的组间杂交，说明实生苗1#与这几种亲本都具亲和力，是进行组间杂交的良好亲本材料。
本试验中用药剂喷施柱头只能促进心皮增大，如图1中“10”，而没能提高杂交组合的结实率。2003年组合1获种子26粒，其中7粒种皮破裂(26.9％)，沙藏种植后已获8株F1杂种苗，其叶形、叶质地都相似于牡丹，如图1中“11”，这与伊藤杂种的总体表现相似。而组合2的两株幼苗则明显似芍药，如图1中“12”，与紫斑牡丹以往的杂交经验也相符。
对于文中的特殊名词及符号说明如下 远缘杂交牡丹P.delavayi var.lutea×P.×suffruticasa； 正午High Noon； 金帝L’Espérance’； 金阁Souvenir de Maxime Cornu； 杨山牡丹‘凤丹白’P.ostii‘Feng Dan Bai’； 紫斑牡丹P.rockii； 芍药Paeonia lactiflora； ♀母本； ♂父本。
权利要求
1、一种牡丹芍药远缘杂交的亲本组合方法，其特征在于，它包括亲本材料的选择、花粉采集贮藏与萌发检测、杂交配合及药剂处理技术、杂种萌发催芽与幼苗管理措施。
2、根据权利要求1所述的牡丹芍药远缘杂交的亲本组合方法，其特征在于，在亲本的选择措施中，所选亲本为
芍药实生苗1#群体、
远缘杂交牡丹品种‘金帝’、‘金阁’、‘正午’和‘Golden Era’，
紫斑牡丹品种‘书生捧墨’和紫牡丹。
3、根据权利要求1所述的牡丹芍药远缘杂交的亲本组合方法，其特征在于，在亲本的选择措施中，所选母本为芍药实生苗1#群体、远缘杂交牡丹品种‘正午’。
4、根据权利要求2或3所述的牡丹芍药远缘杂交的亲本组合方法，其特征在于，在亲本的选择措施中，杂交组合方式为
芍药实生苗1#群体(♀)X‘金帝’(♂)；
芍药实生苗1#群体(♀)X‘金阁’(♂)；
芍药实生苗1#群体(♀)X‘正午’(♂)；
芍药实生苗1#群体(♀)X‘Golden Era’(♂)；
芍药实生苗1#群体(♀)X紫牡丹(♂)；
芍药实生苗1#群体(♀)X‘书生捧墨’；
‘正午’(♀)X芍药实生苗1#群体(♂)；
‘正午’(♀)X 书生捧墨’(♂)。
全文摘要
本发明涉及一种牡丹芍药远缘杂交的亲本组合方法。它包括亲本材料的选择与杂交组合，以及在此基础上进行花粉采集贮藏与萌发检测、杂交配合及药剂处理、杂种萌发催芽与幼苗管理的配套技术。其在亲本的选择措施中，所选亲本可以为芍药(Paeonialactiflora)实生苗1#群体、远缘杂交牡丹(P.delavayi var.lutea×P.suffruticasa)品种“金帝”(“L”Espérance’)、‘金阁’(‘Souvenir de Maxime Cornu’)、“正午’(‘High Noon’)和‘Golden Era’，紫斑牡丹(P.rockii)品种‘书生捧墨’和紫牡丹(P.delavayi)。所选母本可以为芍药实生苗1#群体和远缘杂交牡丹‘正午’，杂交组合方式可以为芍药实生苗1#群体(♀)X‘金帝’(♂)；芍药实生苗1#群体(♀)X‘金阁’(♂)；芍药实生苗1#群体(♀)X‘正午’(♂)；芍药实生苗1#群体(♀)X‘Golden Era’(♂)；芍药实生苗1#群体(♀)X紫牡丹(♂)；芍药实生苗1#群体(♀)X‘书生捧墨’；‘正午’(♀)X芍药实生苗1#群体(♂)；‘正午’(♀)X‘书生捧墨’(♂)。通过上述亲本组合杂交，得到了419粒杂交种子和10株远缘杂种苗，实现了我国在牡丹芍药远缘杂交领域零的突破。
文档编号A01C1/00GK1947496SQ200510112550
公开日2007年4月18日 申请日期2005年10月10日 优先权日2005年10月10日
发明者成仿云, 何贵梅 申请人:北京林业大学