专利名称：一种乙酰木聚糖酯酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种从枯草芽孢杆菌OfeciJAz1S 中获得的新型酯酶及表达载体、重组酯酶及重组酯酶在水解短链脂肪酸脂、去酰
基化反应及β -内酰胺类抗生素的重要中间体-去酰基化的7-氨基头孢烷酸及去酰基化头孢菌素C中的应用。
背景技术：
乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase,缩写ΑΧΕ)是一类可以将木聚糖或低聚木糖中的酰基化的吡喃木糖去酰基化并释放出醋酸的酯酶，分类于羧酸酯酶家族7，可以水解短链脂肪酸及各种酰基化化合物，具有广泛的底物特异性。 现今，乙酰木聚糖酯酶表现出巨大的科研价值和工业应用价值，主要体现在以下两个方面。一方面，乙酰木聚糖酯酶在半纤维素木聚糖的降解中起重要作用。该酶与内切β-1,4-木聚糖酶、β -D-木糖苷酶、a -L呋喃型阿拉伯糖苷酶及α -葡萄糖醛酸酶一起构成木聚糖降解酶系，能水解具有复杂结构的半纤维素木聚糖，使得开发和利用自然界中取之不尽的可再生资源成为可能，近些年获取高活力的乙酰基木聚糖酯酶及解析此酶的结构和功能已经成为研究的热点。另一方面，乙酰木聚糖酯酶具有良好的酰基酯酶活性，可以催化7-氨基头孢烷酸和头孢菌素C脱酰基合成β -内酰胺类抗生素母核，具有巨大的工业应用价值。β_内酰胺抗生素是抗生素中的最主要类型之一，全世界耗用量过万吨。目前使用的化学法存在成本高、三废污染严重等问题，很多制造领域已愈来愈趋向使用酶法合成。目前已知报道的生产乙酰木聚糖酯酶的芽孢类微生物有pumilus、Bacillus subtil is ATCC6633^ Baci11us subtilisl&S ^BaciIlus halodurans C—125等。其中，除subtil is ATCC6633的乙酰木聚糖酯酶被报道具有较高pNPA酶活力(1580U/mg)外，其他菌株的乙酰木糖酯酶的活力和性能仍然较差，限制了其在半纤维素降解和酶法合成β-内酰胺抗生素中广泛应用。因此，需要开发一种高活性的乙酰木聚糖酯酶，扩大其使用范围。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种新型的乙酰木聚糖酯酶的编码氨基酸序列及其对应的核苷酸序列。本发明的第二个技术目的是提供乙酰木聚糖酯酶的蛋白质结构，其中，以同源六聚体的活性最高。本发明的第三个技术目的是提供包括乙酰木聚糖酯酶的编码基因的表达载体。本发明的第四个技术目的是提供制备重组乙酰木聚糖酯酶的方法。本发明的第五个技术目的是提供重组乙酰木聚糖酯酶在水解短链脂肪酸脂、去酰基化反应、生产去酰基化的7-氨基头孢烷酸及去酰基化头孢菌素C中的应用。本发明通过以下技术方案来实现本发明利用PCR技术从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出Cah基因，将Cah基因连在表达载体pET22b多克隆位点处，得到重组质粒pET-Cah，再将重组质粒ρΕΤ-Cah转化E. coli BL21 (DE3)，得到重组的大肠杆菌，即产乙酰木聚糖酯酶的基因工程菌万.coliBL21-pET-Cah。菌株培养后用IPTG诱导表达，产生重组乙酰木聚糖酯酶，对重组乙酰木聚糖酯酶分离即可。详细的操作过程见实施例I和实施例2。按照本发明的技术方案，可以达到良好的技术效果
一、本发明的乙酰木聚糖酯酶序列与解淀粉芽孢杆菌FZB42 (GenBank: YP001419972. I)的乙酰木聚糖酯酶的序列同源性为99%，有10个碱基、2个氨基酸不同于解淀粉芽孢杆菌FZB42的乙酰基木聚糖酯酶基因氨基酸位置第240位由GCC编码的丙氨酸(A)替换为ACC、或者ACA、或者ACG编码的苏氨酸(T) ;289位氨基酸由GAA编码的谷氨酸(E)替换为CAA、或者CAG编码的谷氨酰胺(Q)。此外，本发明的乙酰木聚糖酯酶与已表征的 ifeciBiAs subtil isX^ (GenBank: NP_388200. I )> Bacillus subtil is ATCC6633·(GenBank: ZP_06875135. I ), Bacillus pumilus Cect5072 (GenBank: 2XLC_A)的乙酰木聚糖酯酶同源性分别为84%、84%、73% ;与Thermobacillus composti乙酰木聚糖酯酶(GenBank: ZP_08919340. I)同源性为沿％，与 Thermotoga maritima MSB8 乙酸木糖酯酶(GenBank: NP_227893. I)同源性 41%,与 Bacillus halodurans C-125 的头抱菌素 C 脱氧酶(GenBank: BAB07045. I)同源性 35%。对上述重组乙酰木聚糖酯酶进行了诱导表达，得到了如SEQ ID No 2所示的氨基酸序列。在本发明中，该氨基酸序列对应的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示。但是，根据本领域技术人员的公知常识可知，可以编码一个氨基酸残基的核苷酸密码子的编码可能有至少一种，或者两种及以上，因此，本发明所述乙酰木聚糖酯酶的保护范围应该首先基于SEQID No :2所示的氨基酸序列为准，其扩展保护范围是可以编码出SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的任何核苷酸序列，而不限于SEQ ID No :1所示的核苷酸序列所示的序列。二、本发明所述的乙酰木聚糖酯酶(AXE)，其蛋白质结构为同源六聚体，可解聚为同源三聚体，且同源三聚体具有一定的活性。本发明的重组乙酰木聚糖酯酶单体分子量为36 kDa,而三聚体分子量为107kDa，六聚体分子量为216 kDa。自然状态下乙酰木聚糖酯酶为同源六聚体，在1%的SDS作用下，可以解聚为同源三聚体，无SDS存在时，三聚体迅速自聚合为六聚体，且恢复六聚体的高活性。现有技术报道的subtiIisVi^及短小芽孢杆菌乙酰木聚糖酯酶自然状态下亦为同源六聚体，分子量分别为220 kDa和190 kDa，但其三聚体存在形式未见报道。(Multifunctional Xylooligosaccharide/Cephalosporin C DeacetylaseRevealed by the Hexameric Structure of the Bacillus subtilis Enzyme at I. 9 AResolution. Florence Vincent, Simon J et al. 2003. J. Mol. Biol. (2003) 330,593—606;The crystal structure of the cephalosporin deacetylating enzyme acetylxylan esterase bound to paraoxon explains the low sensitivity of this serinehydrolase to organophosphate inactivation. Silvia Montoro-Garcia, FernandoGil-Ortiz et al. 2011. Biochem. J 436, 321-330)D Bacillus subtilis ATCC6633的乙酸木聚糖酯酶为单聚体，分子量为37 kDa (YesT: A new rhamnogalacturonanacetyl esterase from Bacillus subtilis. Irene Martinez-Martinez, JoseNavarro-Fernandez et al. Proteins 2008; 71:379 - 388. X Bacillus haloduransC-125的头抱菌素C脱氧酶为单聚体,分子量为45kDa(Characterization of a New C-125Rhamnogalacturonan Acetyl Esterase from Bacillus halodurans with a New PutativeCarbohydrate Binding Domain. Jose Navarro-Fernandez, Irene Martinez-Martinez etal. J. Bacteriol. 2008, 190 (4) : 1375.)。本发明的来源于枯草芽孢杆菌的DNA序列在大肠杆菌体系中高效可溶的表达重组乙酰木聚糖酯酶具有广泛的底物谱，可以水解短链脂肪酸脂及多种酰基化化合物。本发明的重组乙酰木聚糖酯酶破胞后原始PNPA酶活力为383. 3 U/mL ;部分纯化后pNPA比活力达到2950U/mg，头孢菌素C的活力达到640 U/mg,均为芽孢杆菌属已知报道的最高活性，见表I。本发明的重组乙酰木聚糖酯酶对C2的脂肪酸脂有非常强的链长专一性，链长增加为C4时活性已降低至0. 09%,鲜见报道。与已知报道的Thermobinda fusca的乙酰木聚 糖酯酶的比较见表2。表2.重组乙酰木聚糖酯酶对脂肪酸脂的链长专一性
—|C-2 |C-4 |C-6 |C-8 IC-10 Icl6~
笨发明 ΑΧΕ~705. 3 0 65 0 0一 O
KJEfromThermobi fidafuscaa228 -- 4 -- 2
[a]，Yang，C. -H. , & Liuj W. -H. (2008). Purification and properties of anacetylxylan esterase from Thermobifida fusca. Enzyme and Microbial Technology,42(2)，181-186.
三、本发明还要求保护包括本发明所述乙酰木聚糖酯酶的编码基因的表达载体。根据本领域技术人员的公知常识，所述的表达载体应当包括但不限于重组载体、重组菌、转基因细胞系、表达盒或重组病毒；在本发明的实施例中，所述的具体的表达载体是为将本发明的乙酰木聚糖酯酶的编码基因插入载体pET22b的多克隆位点得到的重组载体。四、一种制备本发明所述的乙酰木聚糖酯酶的方法，其特征在于用本发明所述的表达载体转化宿主菌，诱导表达获得重组乙酰木聚糖酯酶。五、本发明所述的乙酰木聚糖酯酶在水解短链脂肪酸脂、去酰基化反应、生产去酰基化的7-氨基头孢烷酸及去酰基化头孢菌素C中的应用。本发明的应用表现为对目前7-氨基头孢烷酸和尤其是头孢菌素C的高酶活。Montoro-Garcia已尝试对B. pumilus的乙酰木糖酯酶进行固定化,来催化合成7-ADCA和头抱菌素C,催化反应IOOmin后转化率达到100% (A colorimetric assay for thedetermination of acetyl xylan esterase or cephalosporin C acetyl esteraseactivities using 7-amino phalosporanic acid, cephalosporin C, or acetylatedxylan as substrate. Silvia Montoro-Garcia, Fernando Gil-Ortiz et al. 2010.Bioresource Technology 101 331-336)。而本发明的重组乙酰木聚糖酯酶对7_氨基头孢烷酸和头孢菌素C的活性远远高于汉pumilus乙酰木聚糖酯酶，这显示出本发明乙酰木聚糖酯酶在内酰胺抗生素中间体的工业合成中具有巨大的应用潜力。
图I 为扩增出的 Cah 基因片段。其中，M: DNA Marker DL5000 ;1，2: Cah。图 2 为 Cah 和 pET22b 连接結果。其中，M: DNA Marker DL5000 ；1: pDK7_Nox。图3为基因工程菌表达的こ酰木聚糖酯酶的SDS-PAGE凝胶(考马斯亮蓝染色);其中，M :宽分子量maker (TaKaRa)，1-3纯化的こ酰基木聚糖酯酶。图4为牛血清蛋白(BSA)浓度-0D595吸光值标准曲线。图5为对硝基苯酚(p-NP)浓度-0D405吸光值标准曲线。图6为醋酸浓度-0D210吸光值标准曲线。
图7为纯化的こ酰木聚糖酯酶最适反应温度、pH及温度pH稳定性实验結果。图8为非解聚与解聚的こ酰木聚糖酯酶的SDS-PAGE凝胶电泳(考马斯亮蓝染色)；其中，M :宽分子量maker (TaKaRa)，1、2分别为纯化的非解聚与解聚的こ酰基木聚糖酯酶。图9为4-甲基伞形酮浓度-0D354的标准曲线。图10为凝胶过滤分子量标准曲线。其中，Ve为样品洗脱体积，Vo为外水体积。图11为SDS对こ酰木聚糖酯酶的影响。其中，泳道I为添加0. 5%的SDS酶液，泳道2为不添加SDS的酶液；
图12为确定三聚体的活性及其与六聚体的变换关系。本发明的こ酰木聚糖酯酶基因工程菌株，其分类命名为大肠杆菌co7i)BL21 -pET-Cah ;其保藏机构全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为中国.武汉.武汉大学；保藏日期为2012年10月17日，保藏号编号为CCTCC NO :M2012408。
具体实施例方式本发明所使用的菌种来源
I、表达菌^ coli BL21 (DE3)购买自TaKaRa公司。2、枯草芽孢杆菌UaciBtts subtil is) CICC 20034的こ酰木聚糖酯酶的基因Cah来源以Genebank公布的解淀粉芽孢杆菌FZB42中Cah基因(GenBank: ZP_10041520. I)为模板，自行设计引物，PCR扩增后得到。3、所涉及引物为自行设计，并委托南京金斯瑞公司合成。下面结合附图对本发明的技术方案做进ー步的说明，但不应理解为对本发明的限制
实施例I
本实施例说明产こ酰木聚糖酯酶的基因工程菌大肠杆菌iEscherichia coli )BL21-pET-Cah 的构建。本实施例所述的产こ酰木聚糖酯酶的基因工程菌大肠杆菌coli)BL21-pET-Cah，它是将枯草芽孢杆菌(ガsubtil is) CICC 20034的こ酰木聚糖酯酶的基因Cah通过表达载体pET22b转化万.coli BL21 (DE3)得到的基因工程菌。上述基因工程菌的构建方法为利用PCR技术从质粒载体枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出Cah基因，将Cah基因连在表达载体pET22b多克隆位点处，得到重组质粒pET-Cah，再将重组质粒pET-Cah转化万.coli BL21 (DE3)，得到重组的大肠杆菌，即产こ酰木聚糖酯酶的基因工程菌万.coli BL21-pET-Cah。
上述构建方法，具体包括以下步骤
(I) 基因Cah的克隆
根据Genebank 公布的解淀粉芽孢杆菌FZB42中Cah基因(GenBank: ZP_10041520. I),序列设计合引物
Pl :5’ TATACATATG OWeI)CAATTATACGACTTGC 3’(SEQ ID NO :3)。P2:5’ GGAATTC (.EcoRl) CTCAGCCTTTCAGATGCGCT 3，(SEQ ID NO :4)。引物两端分别引入限制性酶切位点和及^ I，依照基因组提取试剂盒(OMEGA公司)的说明提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板完成PCR反应；
PCR 的 8 管反应体系是=Buffer 22. 5 u L, ddH20 141. 3 u L, MgCl2 13. 5 u L, dNTP-mix18iiL，引物Pl 4. 5iiL，引物P2 4. 5uL, Taq酶2. 7 ii L ;混合均匀后，分成8管，再向每管加入2 ii L模板DNA ;PCR反应条件94で预变性4 min ;进行30个循环反应94で变性45S，54. Iで退火30 S，72で延伸60 s ;最后72で保温10 min，反应结束后4で保存，反应終止后，0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图I所示；经PCR纯化试剂盒(TaKaRa公司)纯化后，与pMD-T Vector载体连接,进行序列测定,UeI和酶切重组pMD_T Vector载体，回收957 bp片段，Ndel和^bo/PI酶切pET22b载体，回收大片段产物，将双酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接获得重组质粒pET-Cah。(2)重组基因工程菌的获得
将重组质粒pET-Cah转化万.coli BL21 (DE3)，涂布含40 l^g/mL的氯霉素平板，挑取阳性转化子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组万.coli,命名为E. coli BL2 IpET-Cah,提取E. coli BL2 IpET-Cah的重组质粒，进行Nde I和EcoRl双酶切验证(如图2 )。实施例2
本实施例说明こ酰木聚糖酯酶的诱导表达方法。利用实施例I的基因工程菌诱导表达こ酰木聚糖酯酶的具体方案如下
(1)出发菌株大肠杆菌CfocAericAia coli ) BL21-pET-Cah ；
(2)种子培养
培养基LB培养基酵母粉5g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L ；
培养条件250 mL三角瓶，装液量50 mL，培养温度37で，摇床转速200 r/min，培养12
h ；
(3)发酵培养
培养基组成LB培养基酵母粉5g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L ；
培养条件接种量1.5% (v/v)，发酵温度37で，当OD达到0.6、. 8时加异丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，IPTG的终浓度1.0 mmol/L，摇床转速180 250r/min,发酵 2_10 h。(4)粗酶液的获取
取出发酵液，置于50mL离心管中，4°C，10000转离心lOmin，弃去上清，加入50mLpH7. 4的Tris-HCl缓冲液，对菌体进行超声破碎，破碎条件如下3s工作，3s间歇，550w15min。破碎后4°C, 10000转离心30min。上清即为粗酶液。(5)酶活力的測定使用PNPA为底物，I个酶活単位(U)定义为在一定反应条件下，每分钟释放I UL p-NP所需的酶量。标准曲线制作A溶液的配制50 mmol/L的磷酸缓冲(pH7.0)，其中含有0.6%Triton X-100和0. 1%的阿拉伯树胶；B溶液的配制准确称取0. 0139 g pNP标准物质，用A溶液溶解，容量瓶定容至250 mL,配成标准物质浓度为I U mol/mL的B溶液。采用A溶液对B溶液进行梯度稀释，配成不同浓度的pNP溶液。在酶标板中加入10 ii L缓冲液，然后依次加入不同浓度的PNP标准溶液各240 UL，对照中加入A溶液。用酶标仪測定405 nm波长处吸光值。以PNP的浓度作为横坐标，以吸光值作为纵坐标，作标准曲线(图5)。测定步骤如下在反应体系中加入240 U L底物溶液(A溶液与B溶液按9:1混合)，10 UL适当稀释的酶液，置于水浴锅中，温度为40で，反应时间10 min;使用酶标仪在410 nm处测定吸光值。实验设三个平行，取平均值，并使用10 uL蒸馏水最为对照组。P-NP标准曲线及方程如图5。 测定结果显示100倍稀释的酶液，A410nm下吸光值分别为I. 449、I. 482、I. 509，通过标准曲线(图5)计算，对应活性为224. 96U/mL。(6)蛋白量的测定
使用Brandford法测定蛋白量。蛋白标曲的制作配制考马斯亮蓝溶液100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95%こ醇中，再加入100 mL 85 %(v/v) H3PO4,最后用蒸懼水稀释至I I,滤纸过滤后可使用；配制0.1 g/1 BSA:称取0.01 g BSA，溶于10 mL蒸馏水中，使用前用生理盐水配制成0. 01、
0.02、0. 03、0. 04、0. 06、0. 08 mg/mL;取 7 个 2 mL 离心管，编好号(0，1，2，3，4，5，6)，在 I 6号离心管中分别加入上述稀释后各浓度BSA溶液0. 3 mL，最后在每支离心管中加入I. 2 mL考马斯亮蓝溶液。在0号离心管中1.2 mL考马斯亮蓝溶液和0.3 mL生理盐水。各管混合后后，以0号管为对照測定A595。测得的标准曲线如图4。蛋白的检测具体步骤如下首先以牛血清蛋白(BSA)标样的浓度对0D595吸光值作标准曲线方程，如图4。然后去适当稀释的酶液300 ii L，加入I. 2mL考马斯亮蓝工作液，混匀，室温放置15min，与595nm下測定吸光值。每组做两个平行样，以蒸馏水为空白。测定结果显示稀释5倍的酶液反应后的0D595吸光值为，0. 252、0. 277。按照图4的标准曲线计算后，蛋白浓度为0.16 mg/uL。因此，工程菌发酵液的こ酰基木聚糖酯酶粗酶液的比酶活力为1406 U/mg。实施例3
本实施例说明こ酰木聚糖酯酶的纯化、分子量及其多聚体形式。I.こ酰木聚糖酯酶的纯化
通过50%-80% (w/v)硫酸铵分级沉淀和超滤こ酰木聚糖酯酶进行浓缩和纯化。纯化步骤如下
(I) 50%-80%硫酸铵分级沉淀取破碎好的溶液，12000g, 30min离心；转移50mL上清至IOOmL烧杯中，边搅拌边慢慢加入50mL的SAS溶液(饱和硫酸铵溶液)，将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时后，放置于4度冰箱过夜充分沉淀。蛋白质溶液IOOOOg离心30min。将50mL上清转移至新的烧杯，边搅拌边慢慢加入75mL的SAS溶液，使终浓度为80%的硫酸铵溶液，将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时后，放置于4度冰箱过夜充分沉淀。蛋白质溶液IOOOOg离心30min后，弃滤液，将沉淀用5mL pH7. 0的磷酸缓冲溶液溶解，重新溶解后的溶液转移至透析袋中12h (4°C)后，置于500mL的透析缓冲中，每3h换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸铵。测定纯化后的蛋白质含量及酶活力。(2)凝胶过滤采用凝胶过滤对浓缩后的こ酰木聚糖酯酶进行进ー步纯化，使用 HiLoad 16/60 Superdex 200 凝胶色谱柱(Healthcare Bio-Sciences 公司)，50 mMTris-HCl (包含 100 mM KCl，pH 7.5)作为流动相，上样量 100 yL，流速 0.1 mL/min,280nm检测。使用自动馏分收集器收集洗脱液，对有紫外吸收峰值的洗脱液进行酶活力测定，将有活力的部分合并，超滤浓缩后，即为纯酶液。测定纯化后的蛋白质含量及酶活力。纯化效果如表3所示，纯化后的こ酰木聚糖酯酶显示出单一条带，如图3。经纯化后的こ酰基木糖酯酶经SDS电泳得到単一蛋白条带。这表明，SEQ ID NO. I所述核苷酸序列所编码的多肽在大肠杆菌万.coli BL21 (DE3)中得到高效表达，且所有的重组蛋白均是可溶的，无包涵体形成。·
2.こ酰木聚糖酯酶分子量及其多聚体形式
采用凝胶过滤确定こ酰木聚糖酯酶自然状态下的分子量，操作流程如凝胶过滤的纯化流程。凝胶过滤蛋白标准(购自SIGMA，货号MWGF 1000)，标曲的制作按照蛋白标准说明书，标曲见表图10。凝胶过滤结果显示，V。为43. 49 mL，Ve为61. 76 mL (Ve为紫外吸收峰出现时使用的流动相体积)，未检测到其他紫外吸收峰。依照标曲计算得到こ酰木聚糖酯酶自然状态下的分子量为216 kDa。采用SDS-PAGE电泳(12%)こ酰木聚糖酯酶单亚基的分子量，SDS-PAGE凝胶的配制如表4，使用Bio-Rad电泳仪，电泳条件为80V 45 min; 120V45min。电泳样品经SDS-PAGE上样缓冲处理后煮沸，蛋白亚基彻底解聚。结果显示其分子量为36 kDa，如图8，泳道2。这表明こ酰木聚糖酯酶天然状态下为六聚体形式。3.こ酰木聚糖酯酶的三聚体
采用SDS-PAGE电泳(12%)对未解聚的こ酰木聚糖酯酶(酶液经SDS-PAGE上样缓冲处理后40で温浴5 min，蛋白分子未解聚)进行分析，其他操作步骤如上述SDS-PAGE电泳。结果显示，こ酰木聚糖酯酶分子量为107 kDa (如图8,泳道I)。这表明こ酰木聚糖酯酶电泳后以三聚体形式存在，可能电泳过程中某些条件或电泳溶液中的某个物质使六聚体解聚为三聚体。SDS是ー种螯合剂，可以引起蛋白质变性，可能会引起六聚体的解聚。因此，为验证是否因电泳液中的SDS使天然六聚体解聚为三聚体，采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和酯酶染色进行检測。实施过程如下
溶液的配制凝胶的配制如表4 (不添加SDS) ；Tris -甘氨酸电泳缓冲液25 mmol/LTris ；250 mmol/L 甘氨酸(pH 8.3);样品缓冲液(0. I mol/L Tris-Hcl，pH 6. 8) 2* 的上样缓冲:0. 5 mL I mol/L的Tris缓冲(PH 6. 8)中加入I mL甘油和0. 0001 g溴酚蓝，灭菌的双蒸水稀释至10 mL。处理样品后，加入SDS，使其终浓度为0.5 %，40°C温浴2 h后进行电泳，以不加SDS的酶液样品为空白。使用Bio-Rad垂直电泳仪80 V电泳45 min、120 V电泳45 min ;之后进行酯酶活性染色。活性染色的具体步骤如下准确称取100 mga-醋酸萘酯和100 mg ￠-醋酸萘酯，在2 mL丙酮中完全溶解，加入100 mg坚牢蓝，混合均匀。用0. I mol/L pH 7. 0磷酸缓冲液定容至100 mL ;将凝胶放进染色液中，置于摇床上缓慢摇动，37で，55转，染色2 min。结果如图11所示，未经SDS处理的空白样品为一条酷酶条带，而加入SDS的こ酰木聚糖酯酶在正常酷酶条带下方出现另外一条酯酶条帯。这说明是SDS使こ酰木聚糖酯酶由天然的六聚体解聚成为三聚体，且0. 5%的SDS不足以使六聚体完全解聚。加大SDS的浓度为1%，处理酶液2 h，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和酯酶染色，结果如图12，1%的SDS作用2 h可以使六聚体基本完全解聚为三聚体(如图12，泳道I)。为确定三聚体的活性及其与六聚体的变换关系，在酯酶染色液中加入1%的SDS进行染色，以保证酯酶染色过程中，こ酰木聚糖酯酶始終以三聚体存在，从而确定三聚体的酯酶活性。结果显示，こ酰木聚糖酯酶的三聚体具有一定的活性,但低于六聚体(如图12，泳道2)。将凝胶转移至不含SDS的染色液中进行染色，结果显示こ酰木聚糖酯酶短时间内(Imin)恢复为高活性，如图12，泳道3。这表明，SDS可以使こ酰木聚糖酯酶解聚暂时为三聚体，洗去SDS后，こ酰木糖酯酶在短时间内迅速自聚合为六聚体。表4. Native聚丙烯酰胺电泳凝胶的配制
权利要求
1.一种乙酰木聚糖酯酶，其特征在于其具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述的乙酰木聚糖酯酶，其特征在于其蛋白质结构为同源六聚体或同源三聚体。
3.包括权利要求I所述乙酰木聚糖酯酶的编码基因的表达载体。
4.一种制备权利要求I所述的乙酰木聚糖酯酶的方法，其特征在于用权利要求3所述的表达载体转化宿主菌，诱导表达获得重组乙酰木聚糖酯酶。
5.权利要求I所述的乙酰木聚糖酯酶在水解短链脂肪酸脂、去酰基化反应、生产去酰基化的7-氨基头孢烷酸及去酰基化头孢菌素C中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新型乙酰木聚糖酯酶的DNA，它的核苷酸序列如SEQAXENO.1所示。它的氨基酸序列如SEQAXENO.2所示。蛋白结构为同源三聚体时活性最高。本发明还公开了含上述新型乙酰木聚糖酯酶DNA的克隆载体和克隆技术，及重组酯酶对短链脂肪酸脂及酰基糖类的水解应用及其在生产β-内酰胺类抗生素的重要中间体-去酰基化的7-氨基头孢烷酸及去酰基化头孢菌素C中的应用，具有重要的工业应用价值。
文档编号C12N9/18GK102952787SQ20121040366
公开日2013年3月6日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者黄和, 李霜, 田倩倩, 宋萍, 徐晴 申请人:南京工业大学