专利名称：鲑亚科鱼类特异性鉴定方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及鲑亚科鱼类特异性鉴定方法及其试剂盒。
背景技术：
鲑科(Salmonidae)鱼类属典型冷水鱼类，隶属于硬骨鱼纲，鲑形目，是世界三大养殖鱼类之一。鲑科鱼含有丰富的蛋白质、脂肪和维生素，胆固醇含量很低，而且含有ω3脂肪酸(EPA、DHA和DPA)，肉质鲜美，营养价值极高，深受消费者青睐。一般将鲑科分为三个亚科，包括娃亚科(Salmoniae),白娃亚科(Coregoninae)和茵鱼亚科(Thymallidae)。其中鲑亚科鱼类有5属，即大马哈鱼属(Oncorhynchus)、红点鲑属(Salvelinus)、哲罗鲑属(Hucho taimen)、细鳞鲑属(Brachymystax)和鲑属(Salmo),囊括了鲑科中多数的食用性鱼类，因此需求最大，经济价值最高，市场上常见的以“三文鱼”为商品名的鲑鳟鱼类，如大 西洋鲑、虹鳟、大麻哈鱼，以及哲罗鲑、红点鲑、细鳞大麻哈鱼等均属于鲑亚科鱼类。至2009年世界三文鱼产量达到366. 4万吨，我国三文鱼进口量达到了 22万吨，消费需求日益增长。但是目前国内外市场上“三文鱼”商品名称混乱，尤其是很多国家食品监管部门在市场上发现近缘鱼种假冒替代现象时有发生，仅美国在2002年就有34%水产品乱贴标签或假冒其它种类产品。为保证保费者权益，规范三文鱼销售市场，使产品“名副其实”，建立一种鲑亚科鱼类的鉴定方法尤为重要。由于经济利益驱动，一些不法商在食品的加工过程中，常常以价格低廉的原料替代或掺入高价格的原料，或者根本就不添加标注的原料成分。在加工产品的造假掺假过程中，经常会使用有毒有害物质(如染色馒头等)，危害人民身体健康。本发明旨在开发出方便快捷地检测食品、饲料及鱼类加工制品中鲑亚科鱼成分的方法，确保食品质量安全。
发明内容
本发明的目的在于提供鲑亚科鱼类特异性鉴定方法及其试剂盒。在本发明的第一方面，提供一种鉴定鲑亚科鱼类的方法，所述方法包括以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鲑亚科鱼类。在一个优选例中，以SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示的引物以及SEQID NO: 3所示的突光探针(如Taqman探针)进行实时突光PCR检测。在另一优选例中，所述的待测样品是食品或饲料。在另一优选例中，所述方法的检测灵敏度为O. 01%。在本发明的第一方面，提供一种引物，所述弓I物是弓I物对，其序列如SEQID NO: I和SEQ ID NO:2 所示。在本发明的第一方面，提供一种荧光探针，所述的探针序列如SEQ ID N0:3所示。在本发明的第一方面，提供所述的引物或所述的荧光探针的用途，用于从待测样品中鉴定娃亚科鱼类。在本发明的第一方面，提供一种鉴定鲑亚科鱼类的试剂盒，其中包括所述的引物；和/或所述的荧光探针。在一个优选例中，所述试剂盒中还包括含有鲑亚科鱼类的DNA的检测标准品。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定鲑亚科鱼类的方法的使用说明书。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图I、应用实时荧光PCR检测方法来进行特异性实验的荧光PCR检测图谱。 图2、鲑亚科鱼的PCR扩增结果以及标准曲线。其中，A为虹鳟(Oncorhynchusmykiss), B 为白点鲑(Salvelinus leucomaenis), C 为尖吻细鱗鲑(Brachymystax Ienok),D为大西洋鲑(Salmo salar)。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种可特异性鉴定鲑亚科鱼类的引物，所述引物对含有鲑亚科鱼类DNA的样品可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有鲑亚科鱼类DNA的样品不发生特异性扩增(获得阴性结果)。为了简化PCR扩增方法，本发明人还设计了配合所述引物的、用于进行实时荧光PCR的荧光探针。采用所述的引物配合荧光探针，可良好地应用于鉴定鲑亚科鱼类，并且具有良好的再现性、灵敏度。目前开发有效的鉴定各种鱼类成分的方法的难点在于这些成分通常在外观、品质上非常相近，导致人们难分真伪。即使采用一些基因或蛋白水平上的技术，也由于许多鱼类在亲缘关系上较近，难以找到符合标准的、检测准确性高、实用性强的检测靶标。为此，本发明人经过深入的研究和大量的筛选，找到了合适的检测靶标，基于此开发了实时荧光PCR检测鲑亚科鱼类的方法。本发明人通过对引物的筛选，获得一类可特异性鉴定鲑亚科鱼类的引物，其对于鲑亚科鱼类的DNA发生特异性扩增，而对没有鲑亚科鱼类的DNA不发生特异性扩增。因此，本发明提供一种引物，所述的引物具SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。本发明的这些弓I物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。本发明还提供一种探针，所述的探针具SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是荧光探针，从而便于实时荧光检测。利用本发明的引物及探针，只需进行常规的PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有鲑亚科鱼类，而且所需的样品量很少。基于本发明所提供的适用于鉴定鲑亚科鱼类的特异性引物及探针，本发明还提供了一种鉴定鲑亚科鱼类的方法，所述方法包括以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO: I和SEQ ID N0:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鲑亚科鱼类。聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。作为本发明的优选方式，利用所述引物，采用实时荧光PCR方法来进行鲑亚科鱼类的鉴定。TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3' —5'外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。TaqMan探针根据其3'端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种普通的TaqMan探针和荧光探针。荧光探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher),本身不产生突光,可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有荧光修饰基团。获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的
酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。本发明还涉及一种用于鉴定鲑亚科鱼类的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQID NO: I和SEQ ID NO:2所示的引物；更佳地，所述的试剂盒中还含有SEQ IDN0:3所示的探针。此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定鲑亚科鱼类的试剂，如(但不限于)(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于酹、氯仿、异戊醇、NaCl等；或(C)提取DNA的试剂盒。此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定鲑亚科鱼类的使用说明书和/或标准操作程序。本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测鲑亚科鱼类的目的。本发明的主要优点在于(I)首次揭示一种可特异性鉴定鲑亚科鱼类的引物，所述的引物特异性良好，对于鲑亚科鱼类能够实现特异性扩增，而对于鲑亚科鱼类以外的其它通常用作仿制鲑亚科鱼类的物质则不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测鲑亚科鱼类，从待测样品中快速准确地区分真假鲑亚科鱼类，并且所需样品量少，操作简单。(3)较佳地，本发明应用荧光实时荧光PCR技术，可快速实现食品中鲑亚科鱼类源性成分的准确鉴定。(4)本发明的方法的推广应用对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
I.材料与方法鱼类或样品材料的获得鲑科鱼类包括鲑亚科，白鲑亚科和茴鱼亚科的共七个属鱼类。鱼样收集购买自中国鲑鱼产区及世界范围内的三文鱼产区，如表I。
表I、鲑科鱼样的收集
权利要求
1.一种鉴定鲑亚科鱼类的方法，其特征在于，所述方法包括 以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO: I和SEQ ID N0:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鲑亚科鱼类。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，以SEQID NO: I和SEQ ID N0:2所示的引物以及SEQ ID NO: 3所示的荧光探针进行实时荧光PCR检测。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的待测样品是食品或饲料。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法的检测灵敏度为O.01%。
5.一种引物，其特征在于，所述引物是引物对，其序列如SEQ ID ΝΟ:1和SEQ ID NO:2所示。
6.一种荧光探针，其特征在于，所述的探针序列如SEQ ID NO:3所示。
7.权利要求5所述的引物或权利要求6所述的荧光探针的用途，用于从待测样品中鉴定鲑亚科鱼类。
8.一种鉴定鲑亚科鱼类的试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求5所述的引物；和/或权利要求6所述的荧光探针。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括含有鲑亚科鱼类的DNA的检测标准品。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定鲑亚科鱼类的方法的使用说明书。
全文摘要
本发明涉及鲑亚科鱼类特异性鉴定方法及其试剂盒。本发明首次揭示一种可特异性鉴定鲑亚科鱼类成分的引物及探针，所述引物及探针针对含有鲑亚科鱼类DNA的样品可发生特异性扩增，而对没有鲑亚科鱼类DNA的样品不发生特异性扩增。因而，所述引物可良好地应用于鉴定鲑亚科鱼类，并且具有良好的再现性、灵敏度。
文档编号C12N15/11GK102876802SQ20121040328
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者李想, 樊祥, 李进波, 韩丽, 潘良文, 李辉 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局