专利名称：扁桃est微卫星标记的筛选方法
扁桃EST微卫星标记的筛选方法技术领域：
本发明属于分子生物学DNA标记的筛选与应用领域，具体涉及扁桃的 EST (Express Sequence iTag,表达序列标签)微卫星标记的筛选方法。背景技术：
扁桃(Amygdalus commumis)又名巴旦杏，属蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属植物，是 一种的经济价值极高的油料树种，其核仁含油量高达55-61 %。世界上扁桃有40个种，中国 有6种。其中扁桃野生资源仅哈萨克斯坦和我国新疆有天然分布，是珍贵的古地中海第三 纪中新世纪的孑遗落叶林树种，有“植物活化石”之称。为了对扁桃栽培种和野生资源进行 遗传分析、遗传图谱构建等工作，目前迫切需要相应分子标记技术的开发和应用。扁桃已开 展ISSR、RAPD、AFLP等标记研究，但其EST微卫星标记开发国内外尚无报道。
随着分子生物学技术的发展，各种分子标记技术不断出现，大大提高了科研人员 对植物进行遗传分析研究的能力，其中以微卫星SSR(Simple Sequence Repeat)，即简单重 复序列标记在植物遗传研究上应用最为广泛。SSR广泛分布于动植物基因组中，由几个(多 为1-6个)碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，如(GA)n，(AT)η, (GATA)n等重复(其 中η代表重复次数)。SSR标记可分为基因组SSR和EST-SSR，传统的基因组SSR标记开发 过程较慢，需要进行基因组文库的构建、重复序列克隆的识别和筛选、测序、引物设计等环 节，不仅费时耗力，成本也很高。近年来通过eDNA文库测序得到的表达序列标签EST发展 十分迅速，在GenBank中平均每天都有上万个EST公布，因而从EST序列中可迅速寻找到 EST-SSR标记。EST-SSR标记不仅具有基因组SSR标记的多态性高、共显性与重复性好等特 点，而且开发成本低廉，在种属间有良好的通用性。另外，由于EST-SSR标记来自于基因的 编码序列，更容易获得基因表达的信息，为功能基因的直接鉴定提供了重要依据。目前该分 子标记已被广泛应用于遗传连锁图谱的构建，种质资源多样性的分析，以及比较基因组学 等研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种扁桃EST微卫星标记的筛选方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是首先利用GeneBank公布的扁桃的ESTs 的序列，经冗余序列去除后，通过微卫星检索软件WebSat进行微卫星位点的查找，对于2-6 个碱基重复单元重复且重复单元序列长度大于等于18bp的微卫星进行数据挖掘与分析， 从而得到含有微卫星标记的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计引物， 并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进 行综合评价，得到微卫星EST-SSRs标记，其特异引物序列分别为AC-SSR14:上游引物 GCAGGACCCATTTAGTTCAATC，
下游引物GCCATAACAGAGACACAGAGGA ；
AC-SSR62 上游引物TCACCTTCCCTCTTACGTCAAT，
下游引物CTCTGATGTGTCGGATCTTCTG；。
本发明的有益效果是能将筛选获得的扁桃EST微卫星标记应用于做扁桃种质资 源和遗传多样性的分析、分子群体遗传学和种质资源鉴定、遗传图谱的构建和功能基因的 研究，进一步用于扁桃分子辅助选择育种。
图1为AC-SSR14EST-SSR标记在不同扁桃样本中的电泳分离图谱
图2为AC-SSR62EST-SSR标记在不同扁桃样本中的电泳分离图谱具体实施方式
本发明下面结合微卫星位点筛选及其多态性标记确定的具体做法予以详述
1、扁桃ESTs数据来源和微卫星序列的筛选
以扁学名从美国国家生物技术中心(National Center forBiotechnology Information, NCBI)的数据库搜索并下载扁桃EST序列(格式FASTA)，利用R印eat Masker (http //www. repeatmasker. org)去除重复·歹[J，以 Phrap (http //www. phrap. org)进行核苷酸序列重叠群分析和聚类去除冗余核苷酸序列后应用WebsatQittp:// wsmartins.net/websat/)在线程序搜索SSR。搜索的标准为二核苷酸、三核苷酸、四核苷 酸、五核苷酸和六核苷酸重复序列的重复次数分别大于或等于9、6、5、4和3。
2、微卫星标记引物设计
通过^febsat找到含微卫星SSR位点的扁桃ESI1s序列共1 条，采用I^rimer Premier 3. 0软件设计引物，其设计引物参数为引物长18_27bp，最适为22bp ；引物退火温 度Tm值57-60°C，上游与下游引物的退火温度Tm值相差士 1°C ；PCR预期产物长100_400bp ； 尽量避免引物二聚体，发夹结构和错配。
3、PCR扩增体系优化及引物筛选
由于所设计的上下游引物Tm值相差不大，利用梯度PCR仪筛选引物的退火温度。 PCR反应总体积25 μ 1，其中含有正反向引物0.2μΜ，0.2πιΜ dNTP(四种脱氧核昔酸的混 合物)、10X PCRbuffer 2. 5 μ L, 3mM 的 Mg2+、Taq 酶 IU，模板量 50_100ng. PCR 反应程序为 94 V预变性5分钟，94 V变性30秒，48-60 °C梯度退火40秒，72 °C延伸50秒，35个循环，72 °C 终延伸7分钟，4 °C保存。
10X PCR buffer 含有 IOOmM Tri s_HCL(三轻基甲基氨基甲烷一盐酸 pH9. 0)， 500mM KCL (氯化钾 pH9. 0),1% TritonX-100 (曲拉通 X-100)。
4、EST微卫星位点的确认
根据梯度PCR确认的退火温度，进行微卫星标记多态性检测。微卫星PCR扩增体 系为总体积25μ 1，其中含有正反向引物0.2yM，0.2mM dNTP(四种脱氧核昔酸的混合 物)、IX PCR buffer, 3mM 的 Mg2+、Taq 酶 IU，模板量 50_100ng. PCR 反应程序为94°C预变 性5分钟，94°C变性30秒，51 °C退火40秒，72°C延伸50秒，35个循环，72°C终延伸7分钟， 4°C保存。PCR产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，200V电压电泳Ih后，采用 银染法染色，BIO-RAD Gel Doc2000凝胶成像系统中成像。分析确定多态性，最后筛选出11 个位点作为扁桃微卫星标记，这些标记及其特异性扩增引物的相关信息见表1。
扁桃微卫星标记及其特异性引物相关信息表(表1)
权利要求
1. 一种扁桃EST微卫星标记的筛选方法，首先利用GeneBank公布的扁桃的ESTs的序 列，经冗余序列去除后，通过微卫星检索软件WebSat进行微卫星位点的查找，对于2-6个 碱基重复单元重复且重复单元序列长度大于等于18bp的微卫星进行数据挖掘与分析，从 而得到含有微卫星标记的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计引物，并 进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行 综合评价，得到微卫星EST-SSRs标记；其特征在于所筛选到的微卫星标记的特异引物分别 为AC-SSR14 上游引物GCAGGACCCATTTAGTTCAATC，下游引物 GCCATAACAGAGACACAGAGGA ； AC-SSR62 上游弓I 物:TCACCTTCCCTCTTACGTCAAT,下游弓| 物 CTCTGATGTGTCGGATCTTCTG。
全文摘要
本发明涉及一种扁桃EST微卫星标记的筛选方法。针对GeneBank已公布的扁桃的ESTs的序列，利用微卫星检索软件WebSat挖掘EST微卫星分子标记，并筛选出2对多态性丰富的扁桃微卫星引物序列。本发明的扁桃微卫星DNA标记用于扁桃种质资源评价、鉴定、遗传多样性的分析，遗传图谱的构建、分子辅助选择育种等研究，是一种可靠有效的分子标记。
文档编号C12Q1/68GK102031251SQ201010532509
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日 公开号201010532509.发明者吕志江, 张智俊, 李亚玲, 罗淑萍 申请人:浙江农林大学