专利名称：一种鸡皮肤颜色相关的分子标记及其鉴别方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鸡标记辅助选择技术领域，具体地说，是涉及一种用于鸡标记辅助选 择的鸡皮肤颜色相关的分子标记及其鉴别方法和应用。
背景技术：
皮肤颜色是用于评价禽类产品经济价值的重要指标之一，鸡皮肤的黄色主要是由 于类胡萝卜素和叶黄素等黄色素沉积的结果，这种沉积能力受遗传、饲料营养、饲料添加 齐U、饲养环境、健康状况等方面的影响。鸡皮肤表皮层中叶黄素的表现主要是由W+、W这个 基因座所决定的，此基因位于第一号染色体上，属于第三连锁群。野生型的显性基因会阻碍 黄色素在皮肤、脚胫、喙与脂肪等部位上的沉积，使得皮肤、脚胫颜色呈现白色；相对的突变 型的隐性基因则允许黄色素在皮肤、脚胫、喙与脂肪等部位沉积，使这些部位呈现黄色。目 前研究已发现,编码β-胡萝卜素双加氧酶2的BCD02 (beta-carotene dioxygenase 2)基 因的主要功能是将有颜色的类胡萝卜素分解成为无色的物质，从而使鸡皮肤没有黄色素沉 积，而成为白皮肤。研究也已证明，该基因上的突变与鸡皮肤颜色有关，但目前从遗传的角 度来说，还没有建立起一种有效的区分鸡是黄皮肤还是白皮肤，以及白皮肤是杂合子还是 纯合子的方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种鸡皮肤颜色相关的分子标记。该分子标记位于鸡皮 肤颜色相关基因B⑶02的外显子上。具体来说，该分子标记位于SEQ ID NO :1所示序列中 的第259位碱基处A/G碱基突变。当该处碱基为A时，则鸡皮肤颜色为白色，当该处碱基为 G时，则鸡皮肤颜色为黄色。本发明以与鸡皮肤颜色相关基因BCD02的DNA全长序列为基础，寻找该基因上影 响皮肤颜色的突变位点以及相应的多态性检测方法，通过在多个群体中的验证，为鸡育种 提供一种关于其皮肤颜色的分子鉴别方法。以下是具体的技术方案以鸡B⑶02基因的DNA序列(参考序列GeneBank登录号为NC 006111. 2)为模板， 设计引物扩增该基因部分序列，所用的引物为正向引物5，-TCCTCTGATTGCTTTACTGACTTG-3，，反向引物5，-GGGAAGGAGGTATCATTGGAGA-3，所扩增得到的序列包括完整的第6外显子和部分第5内含子、部分第6内含子，如 序列表SEQ ID NO 1所述，该序列全长为444bp。本发明通过对上述所获得的DNA片段进行鸡品种间(包括白皮肤鸡和黄皮肤鸡) 的多序列比对分析，获得的序列如图2所示。比对结果发现一种可作为鸡标记辅助选择应 用的分子标记，该标记与鸡的皮肤颜色有关，在该序列的第259位碱基处存在A/G突变，导 致Sdu I-RFLP多态性。本发明的第二个目的是提供了该分子标记的鉴别方法，以鸡B⑶02基因的DNA序列为模板，选择如下引物进行扩增正向引物5，-TCCTCTGATTGCTTTACTGACTTG-3，，反向引物5，-G GGAAGGAGGTATCATTGGAGA-3，；将PCR扩增所得到的产物利用Sdu I内切酶进行酶切反应，琼脂糖凝胶电泳检测 酶切产物，如果只有一条444bp的条带，则DNA双链在该突变位点处均为A碱基，判断为AA 基因型，表现为白皮肤；若有2条分别为263bp和ISlbp的条带，则说明DNA双链在该突变位 点处均为G碱基，判断为GG基因型，表现为黄皮肤；若有3条分别为444bp、263bp和ISlbp 的条带，则说明DNA双链在该突变位点处一条链为A碱基，另一条链为G碱基，判断为AG基 因型，因为A等位基因是显性，所以表现为白皮肤。本发明的第三个目的是提供该分子标记在鸡分子标记辅助选择中的应用，特别是 鸡皮肤颜色选择育种中的应用。通过本发明所提供的技术方案，还可以制备成该分子标记的鉴别试剂盒。本发明的有益效果是，通过对上述A/G突变位点的检测，能知道目标鸡群皮肤颜 色这一性状的基因型，从而能有目的对鸡群进行选择，提高其后代鸡群皮肤及胫色的一致 性。另外，本发明所使用的检测方法准确性高、成本低、效率高。
图1是实施例1中鸡B⑶02基因上的部分DNA序列，用来寻找分子标记的片段的 电泳图片；图2是实施例1中应用本发明的方法对2只白皮肤鸡和2只黄皮肤鸡的BCD02基 因上的该片段进行比对的结果；图3是实施例1中鸡B⑶02基因外显子6上的Sdu I-RFLP的三种基因型(AA，AG 和GG)电泳图谱(琼脂糖胶浓度为1. 5% )。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1 鸡皮肤颜色分子检测方法的建立(一)引物以鸡BCD02基因的DNA序列(参考序列GeneBank登录号为NC 006111. 2)为模 板，设计一对引物YSD-F/YSD-R克隆得到如序列SEQ ID NO=I所示的DNA序列(包括完整 的第6外显子和部分第5内含子、部分第6内含子)，该序列全长为444bp。所用到的引物 序列分别如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示，具体如下YSD-F 5' -TCCTCTGATTGCTTTACTGACTTG-3‘，YSD-R 5' -GGGAAGGAGGTATCATTGGAGA-3‘。(二)PCR 扩增条件总体积为25yL的PCR反应体系中加入DNA模板1 μ L，2 XPCR反应混合物 12. 5 μ L，IOmM引物前后各1 μ L，Taq DNA聚合酶0. 625U，双蒸水8. 25 μ L，PCR反应条件为 94°C预变性3min ；94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，共33个循环；最后72°C延伸10min，4°C 保存(三)寻找分子标记选取2只白皮肤鸡和2只黄皮肤鸡的血液DNA做模板，进行PCR扩增，PCR产物经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示。图1是鸡B⑶02基因上的部分DNA序列，用来寻 找分子标记的片段的电泳图片，片段大小为444bp(琼脂糖胶浓度为1.5% )，其中，M泳道 为DNA分子量标准(DL2000)，B1、B2代表白皮肤鸡BCD02基因PCR扩增片段，H1、H2代表黄 皮肤鸡BCD02基因PCR扩增片段。将PCR产物回收、克隆、测序，其测序序列如图2中HI、 H2、B1、B2所示的核苷酸序列。通过Cluster W比对发现存在8处SNP，1处缺失突变，与白 皮肤鸡比对发现黄皮肤鸡在259处发生了碱基突变，由A突变为G，该突变位点在BCD02基 因组序列(GeneBank登录号为NC 006111. 2)上的位置是14253处。具体见图2，图2是对 2只白皮肤鸡和2只黄皮肤鸡的B⑶02基因上的该片段进行比对的结果。图中B1、B2代表 白皮肤鸡，H1、H2代表黄皮肤鸡，图中方框所示的为该序列在259位碱基处存在的A/G突变 位点，下划线所示的序列是本发明设计的引物序列。实验具体操作步骤如下1、PCR产物的纯化在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝 胶，放入1. 5mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化 PCR产物，按照该试剂盒说明书操作。2、连接反应将纯化的PCR产物与pMD18-T Vector(购自TaKaRa公司)连接，连 接反应总体积是 ο μ L，其中包括2 X快速连接缓冲液，2. 5 μ L ；载体(50ng)，0. 5 μ L ；回收 DNA, 7-8 μ L0稍微弹打混合均勻，于16°C连接Ih以上或者4°C连接过夜。3、感受态细胞的制备从37°C培养箱中培养了 16_20h的新鲜平板上挑取一个 DH5 α单菌落接种于2mL LB中，于37°C摇床振荡培养3h，转接ImL菌液于含有300mL LB的 盐水瓶中，继续在37°C摇床振荡培养约4h，待0D600达到0. 3-0. 4时将盐水瓶从摇床取出 置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4°C 4，OOOg离心IOmin以收集细胞，将 离心管倒置以弃净培养液，用IOmL冰预冷的0. lmol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复 40C 4，OOOg离心IOmin —次，用4ml冰预冷的0. lmol/L的CaCl2重悬沉淀，置4°C保存备用。4、转化在灭菌的1. 5mL离心管中加入100 μ L感受态细胞，于冰上加入连接产物 5 μ L，用移液枪吹打均勻，冰浴30min ；将离心管置于42°C的循环水浴中(勿震动)，热激 90s后，迅速冰浴2min ；再在离心管中加入400 μ L LB培养液，在37°C摇床(200rpm/min)温 浴复苏45-60min ；离心，去除部分上清液，取100 μ L复苏后的菌液布于含Amp的平板上，涂 勻；待液体充分吸收后，倒置平皿，于37°C培养14-16小时，观察有无菌落长出。5、阳性克隆子的鉴定及测序从平板上挑取转化好的菌斑接入含400 μ L LB的 1. 5mL离心管中并于37°C摇床振摇培养约8h左右。以此菌液为模板，选用原引物或测序 的通用引物M13(北京六合华大基因科技股份有限公司提供)进行PCR扩增(退火温度 58-60°C)。电泳检测，挑取阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由上北京六合华大基因科 技股份有限公司完成。在本实施方例中，PCR扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异 的PCR产物(图1)，图1是实施例1中鸡BCD02基因上的部分DNA序列，用来寻找分子标记 的片段的电泳图片，片段大小为444bp (琼脂糖胶浓度为1. 5% )，其中，M泳道为DNA分子 量标准(DL2000)。将PCR产物回收、纯化后克隆，测序(所测得的序列的比对图见图2)，图2是应用本发明的方法对2只白皮肤鸡和2只黄皮肤鸡的BCD02基因上的该片段进行比对 的结果，其中Bi、B2代表白皮肤鸡比对序列，HI、H2代表黄皮肤鸡比对序列，方框所示为该 序列在259位碱基处存在的A/G突变位点。结果显示所得到的DNA序列长度为444bp，包 括完整的第6外显子，以及部分第5内含子和部分第6内含子序列(如序列表SEQ ID NO 1所示)；测序结果表明在该DNA序列的259处存在A/G碱基突变。(四)PCR-RFLP检测方法建立该片段259处的A/G碱基突变，恰好可以被内切酶Sdu I识别，将上述PCR产物 6 μ L，IOX缓冲液1 μ L，限制性内切酶Sdu I 0. 2 μ L(2U)，加双蒸水补至10 μ L，将样品混 勻后离心，37°C培养箱放置6h，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，成像系统观察酶切结果，记 录基因型。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中A是没有形成酶切位点的等位基因， G是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型，其中AA型为未发生酶 切的纯合型(电泳检测时只有444bp—条DNA带)，GG型为发生酶切的纯合型(电泳检测时 出现263bp和181bp两条DNA带)，AG为杂合型(电泳检测时出现444bp、263bp和181bp三 条DNA带)，详见图3。图3是本发明中鸡B⑶02基因外显子6上的Sdu I-RFLP的三种基因 型(AA，AG和GG)电泳图谱(琼脂糖胶浓度为1.5%)，M泳道为DNA分子量标准(DL2000)实施例2 =PCR-Sdu I-RFLP多态性在各鸡品系中分布情况的检测及应用本例中收集了不同胫色及皮肤色共3个品系的鸡血液DNA，分别是B、Z、H共3个 品系，样本均来自广东智威农业科技股份有限责任公司。按照实施例1所述的方法对以上 鸡种进行了 PCR-Sdu I-RFLP检测，以验证本发明所述的该种关于鸡皮肤颜色的分子诊断方 法。检测结果如表1所示。表1是BCD02基因Sdu I-RFLP多态性在鸡群中的分布检测结^ ο表 1
基因型
品系 皮肤颜色 个数 ______________________________
AA AG GG
B 白色4130
白色7874 40
Z
黄色520 052
H Hfe200 020由表1可知，所检测的个体的基因型均与其皮肤颜色是相符的，说明本发明所述 的方法可靠、有效。本发明所述的分子标记可应用在鸡皮肤颜色选择育种中。如表1所检测的Z品系 鸡，其外貌特征是皮肤颜色为白色，胫色为黑色，而在我们检测过程中发现其群体中一些白 皮肤个体为AG杂合基因型，那么如果AG杂合基因型的个体交配，其后代群体中就会出现GG 基因型，表现为黄皮肤的个体，而黄皮肤是不符合Z这个品系的外貌特征的。所以应用本发 明所述的分子标记可以将该品系父、母代中为AG杂合基因型的个体剔除掉，以保证其后代 鸡群中没有黄皮肤个体的出现，使群体在皮肤颜色这一外貌特征方面一致。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。序列表<120> 一种鸡皮肤颜色相关的分子标记及其鉴别方法和应用<160>3<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211 >444<212>DNA<213>chicken<222>(1). . . (444)<400>1tcctctgatt gctttactga cttgataact gtttctttat tctttttttt tctgcccagt 60tatgtaacta ctgtatttct acctacacta aggaaataga aaagcactga gcctgacttt 120atctttgtga atctgggcag cttcacatct cagtggtgct gaaccccctt ttttctttcc 180agggactaca tataatataa ttgaggtccc tccacaaaag tcgaactgca atgagacctt 240agagggagca aaagtgctat gctccattgc tccaacagat aacatgaaac cctcctacta 300tcacagcttt ggtaagaatg cttcctgtct catactccat ggatttagcc tcctgtgcag 360cacaaggggc tgttaactgc cctctgtttc aatttttttt gttgttgttt catttgccaa 420gttctccaat gatacctcct tccc444<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<222>(1). . . (24)<400>2tcctctgatt gctttactga cttg24<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<222>(1). . . (22)<400>3gggaaggagg tatcattgga ga2权利要求
一种鸡皮肤颜色相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为如SEQID NO1所示序列中的第259位碱基处A/G碱基突变。
2.一种鉴别权利要求1所述的分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤以鸡 BCD02基因的DNA序列为模板，选择如下引物扩增正向5，-TCCTCTGATTGCTTTACTGACTTG-3，， 反向5’ -GGGAAGGAGGTATCATTGGAGA-3’ ； 将所得扩增产物用限制性内切酶Sdu I酶切， 若只有一条带，则该突变位点处均为A碱基； 若有二条带，则突变位点处均为G碱基；若有三条带，则说明该突变位点处一条链为A碱基，另一条链为G碱基。
3.权利要求1所述的分子标记在鸡皮肤颜色性状方面的分子标记辅助选择中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括鸡皮肤颜色选择育种中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种鸡皮肤颜色相关的分子标记，该分子标记是位于SEQ IDNO1所示序列中的第259位碱基处的A/G碱基突变。本发明还提供了该分子标记的鉴别方法及其在鸡皮肤颜色性状方面的分子标记辅助选择中的应用。该分子标记是以鸡BCDO2基因的DNA序列为模板，选择SEQ ID NO2和SEQ IDNO3所示的引物进行扩增。本发明所使用的检测方法准确性高、成本低。通过对上述A/G突变位点的检测，能知道目标鸡群皮肤颜色这一性状的基因型，从而能有目的对鸡群进行选择，提高其后代鸡群皮肤颜色及胫色的一致性。
文档编号C12N15/11GK101967480SQ201010531819
公开日2011年2月9日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者李春雨, 王艳, 瞿浩, 罗成龙, 舒鼎铭, 邓科源, 马杰 申请人:广东智威农业科技股份有限公司