专利名称：一种检测中国地方黄牛aqp9基因单核苷酸多态性的方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，涉及以黄牛的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作 为分子遗传标记，特别涉及一种检测黄牛AQP9基因的单核苷酸多态性的方法。
背景技术：
近年来肉牛产业呈超高速发展态势，已经成为各国国民经济和农业的重要产业， 我国肉用牛的发展还有着巨大的潜力。为了在国际市场获得竞争力，肉类生产者以消费者 食物需要为基础，在保证肉品安全质量的前提下尽力提高肉畜的生产性能。这对于育种工 作者来说就是如何生产出消费者欢迎的畜产品，同时获得最大效益，也就是说要培育出饲 料利用率高，产品品质好的畜禽品种(系)。饲料利用率的高低，归根结底是能量利用的高 低。同时就黄牛而言，肌间脂肪是影响其口味的重要因素，它是靠脂肪的沉积和合理分配形 成的。随着市场经济的迅速发展人民生活水平的日益提高，加快黄牛生长速度和提高肉品 质势在必行。生长发育性状是典型的、具有重要经济价值的数量性状，其遗传力低，一般 为0. 2 0. 3，用传统育种方法进行育种进展缓慢。而分子育种技术，则是从操纵数 量性状的表型逐步过渡到操纵数量性状的基因型，从由表型的选择转为标记辅助选择 (marker-assisted selection, MAS),最终可实现分子育种(molecular breeding)。随着 分子生物学和分子遗传学的发展，分子标记也在不断向前发展。在分子标记的发展历程中， 其大致可分为三类1类是以分子杂交为基础的分子标记，如RFLP和DNA指纹；II类是以 PCR为基础的分子标记，如RAPD、微卫星标记、PCR-RFLP、PCR-SSCP和PCR-RMAPD (随机扩增 微卫星引物多态DNA)标记；III类是以DNA测序为核心的分子标记，如SNP和EST。单核苷酸多态性(SNP)通常是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G) 的变化而引起的多态性，包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。根据其 在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间 SNPs(iSNPs)三类。其中对于编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接 的重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进 化的研究中也具有重要意义。目前SNP检测技术有很多，其中DNA序列测定法是最为准确 的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测 序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际 的理想SNP检测方法。而其它一些SNP检测方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条 件高，不适合一般临床实验室使用。PCR-SSCP作为检测基因突变的一种方法，经不断地改 善，其简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，更适合临床实验的需要。因此，利用PCR-SSCP 与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，既准确又实用。水通道蛋白(aquaporin，AQP)是广泛存在于原核和真核细胞膜上转运水的特异 性孔道。其中AQP3、7、9和AQPlO之间基因结构和蛋白质序列相近似，除对水分子通透外， 对甘油和尿素等中性小分子也具有通透性，成为AQP家族中的第二个亚家族，水_甘油通道(aquaglyceroporin，AQP)。AQP9是1997年Kuriyame等在进行人类脂肪组织基因序列系统 分析过程中发现的，之后在白细胞、肝脏、睾丸、脾和脑等器官也都有发现，在人体多种组织 均有表达，其分子结构和对水的通透性与其他的水通道蛋白类似，并且观察到AQP9增强了 脂肪细胞甘油通透能力，所以认为当脂肪分解在细胞膜之间形成甘油浓度梯度时，AQP9开 始转运甘油。另有研究显示，肝细胞膜表面AQP9可以完成甘油的摄入过程。脂肪细胞AQP7 将脂肪动员产生的甘油输送到血液，而甘油到达肝脏则需要AQP9完成从血液的摄取过程， 最终在肝脏以甘油为原料糖异生补充血糖，因此由AQP7和AQP9协调完成了甘油由脂肪细 胞到肝脏的运输过程。AQP9的功能异常将影响糖异生而导致低血糖的出现，并且与胰岛素 抵抗也密切相关。大量研究表明，AQP9在维持体内能量代谢与平衡，脂肪合成以及个体的 生长发育等方面都具有至关重要的作用。因此，研究哺乳动物AQP9基因遗传变异和分子遗 传特征具有重要理论和实践意义。AQPs在体内各器官组织的广泛表达具有相当重要的生物学作用。水_甘油通道 蛋白不仅对维持体内多个器官系统的正常生理功能具有重要作用，而且其调节的甘油运输 对于机体物质代谢还具有重要的生理意义。随着分子生物学及基因工程技术的迅速发展， AQPs基因在机体中组织器官的特异性分布情况及在蛋白分子生物学遗传、结构方面的研究 也日渐深入，已成为众多学者关注的焦点，在临床也有了较广泛的应用。AQP9参与体内甘 油的转运，与脂肪代谢、脂类在组织中的沉积有很大关系，所以AQP9对机体内脂肪含量以 及个体生长发育性状产生重要影响。已有资料显示AQP7基因的多态性与猪脂肪沉积性状 存在关系，发现该基因对猪的生长发育具有显著的影响，是一个较理想的标记位点。目前， 国内外未见关于动物AQP9基因遗传变异的研究。中国黄牛AQP9基因遗传变异领域的研究 未见报道，该基因位点的功能研究及其遗传变异与生长性状(如体重、体高、胸围等性状) 关联的研究仍是空白。由于AQP9基因功能涉及动物的生长性状，本发明提供的检测方法为 AQP9基因的SNPs与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记 辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
发明内容
本发明解决的问题在于利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测黄牛AQP9基因的单 核苷酸多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅 助选择的分子标记，为中国黄牛遗传育种领域标记辅助选择(MAS)在生长前期的选育提供 了宝贵资料，从而加快良种选育速度和提高种群品质。本发明是通过以下技术方案来实现黄牛AQP9基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括黄牛AQP9基因第47575位为C或T的单核苷酸多态性，第47615位为C或T的单 核苷酸多态性，第47690位为A或G的单核苷酸多态性。上述检测中国地方黄牛水-甘油通道蛋白9(AQP9)基因的单核苷酸多态性(SNP) 的方法为以中国地方黄牛基因组DNA或包含AQP9基因序列为模板，利用特异性引物PCR扩 增黄牛AQP9基因，然后利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测产物单链构象并进行测序分 析，即可准确鉴定中国地方黄牛品种AQP9基因的单核苷酸多态性。
所述的引物对为P6 上游引物5' -AAGGAAGACCAAGCGATGT-3‘ 19bp ；P6 下游引物5' -GTGTGTGAAGATGCTTTGTGA-3‘ 21bp。所述的PCR扩增的条件是25μ L 反应体系，包括 1. 0μ UlU/μ L)Taq DNA 聚合酶，10XBuffer 2.5yL(含 Mg2+)，2. O μ L (2. 5mmol/L) dNTPs, l.OyL (50. Ong/ μ L)黄牛基因组 DNA 或包含 AQP9 基因序 列的DNA样品，10 μ mol/L上、下游引物各0. 5 μ L和灭菌超纯水17. 5 μ L。所述的PCR扩增反应程序为94°C 预变性 4min ；30 35 个循环 94°C 变性 30s，61 °C 退火 45s，72 °C 延伸 45s ； 72°C延伸 IOmin0所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。所述根据非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳带型及多态产物测序结果鉴定黄牛AQP9基 因的单核苷酸多态性为AA基因型对应的SNPs为NC_007308 :g. 47575C，47615C，47690A ； AB 基因型对应的 SNPs 为 NC_007308 :g. 47575C/T, 47615C/T, 47690A/G ；BB 基因型对应的 SNPs 为 NC_007308 :g.47575T，47615T，47690G。本发明利用PCR-SSCP与DNA测序结合法对黄牛AQP9基因第47575和第47615位 点上的错义突变产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，当第47575位点 由C突变为T时，三联密码⑶C改变为UUC，在转录过程相应位置的蛋白质编码氨基酸发生 改变，肽链260位的亮氨酸变为苯丙氨酸(Leu260Phe)，当第47615位点由C突变为T时，三 联密码CCG改变为CUG，在转录过程相应位置的蛋白质编码氨基酸发生改变，肽链273位的 脯氨酸变为亮氨酸(Pro273Leu)，这使得广泛分布于细胞膜上具有重要生理功能的水-甘 油通道蛋白9基因所编码蛋白的空间构型可能发生变化，以至影响蛋白的生物学功能。本发明公开了与黄牛生长性状相关的功能基因AQP9的核苷酸多态性，对AQP9基 因的SNPs进行了基因分型和基因频率分析，以及与郏县红牛生长性状之间进行了关联分 析；结果显示AQP9基因的核苷酸多态位点能够成为分子遗传辅助育种的标记。针对上述黄牛AQP9基因核苷酸多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过 PCR-SSCP与DNA测序结合法，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。 由于AQP9基因功能主要涉及体重、体高、胸围等生长发育性状，本发明提供的检测方法为 AQP9基因的SNPs与生长性状关系的建立奠定了基础，以便推广应用于中国地方黄牛品种 生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
图1为黄牛AQP9基因P6位点的PCR产物电泳图谱。图2为黄牛AQP9基因P6位点的PCR-SSCP电泳图谱。图3为黄牛AQP9基因SNPs的不同基因型测序图。图4为黄牛AQP9基因P6位点野生型与突变型的核苷酸及氨基酸序列的比对分析。
具体实施例方式本发明以AQP9基因保守序列设计引物扩增AQP9基因外显子6区域及3’ UTR的
572bp片段，分别以郏县红牛、鲁西牛、秦川牛3个品种的基因组为模板，进行PCR扩增，然后 利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测产物单链构象多态性，多态产物经测序后寻找该扩增 片段的单核苷酸多态；针对发现的单核苷酸多态进行性状关联性分析，并提供其检测方法， 使得AQP9基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗传标记，为加快建立 具有优质经济性状的黄牛种群提供依据。 下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
a、PCR-SSCP与DNA测序结合法对黄牛AQP9基因SNPs的检测1、黄牛样本的采集本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1。表1黄牛样本的采集
权利要求
一种检测中国地方黄牛AQP9基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以中国地方黄牛基因组DNA或包含AQP9基因序列为模板，利用特异性引物对PCR扩增黄牛AQP9基因，然后利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测产物单链构象多态性，多态产物经测序后即可准确鉴定中国地方黄牛品种AQP9基因的单核苷酸多态性；所述的引物对为上游引物5′ AAGGAAGACCAAGCGATGT 3′ 19bp；下游引物5′ GTGTGTGAAGATGCTTTGTGA 3′21bp。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黄牛AQP9基因单核苷酸多态性位点 为该基因的g. 47575C > T，47615C > T，47690A > G 变异位点。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的条件是25μ L反应体 系，包括 1. OyL Taq DNA 聚合酶，10 XBuffer 2. 5 μ L，含 Mg2+，2. 5mmol/LdNTPs2. 0 μ L， 50. Ong/μ L黄牛基因组DNA或包含AQP9基因序列的DNA样品1. 0μ L，IOpmol/μ L上、下游 引物各0. 5 μ L和灭菌超纯水17. 5 μ L ；所述的PCR扩增反应程序为94°C预变性4min ；30 35个循环94°C变性30s，61°C退 火 45s, 72°C延伸 45s ；72°C延伸 IOmin0
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为10%聚丙烯 酰胺凝胶电泳。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，根据非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳带型及多 态产物测序结果鉴定黄牛AQP9基因的单核苷酸多态性为与GenBank acc. No. :NC_007308 序列比较，AA基因型对应的SNPs为g. 47575C，47615C，47690A ；AB基因型对应的SNPs为 g. 47575C/T, 47615C/T, 47690A/G ；BB 基因型对应的 SNPs 为g. 47575T，47615T，47690G。
全文摘要
本发明公开了一种检测黄牛AQP9基因单核苷酸多态性的方法，以包含AQP9基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以特异性引物对P6为引物，PCR扩增黄牛AQP9基因的外显子6区；再对扩增产物片段进行SSCP多态性检测并对产物进行测序分析。由于AQP9基因的功能涉及体重、体高、体长、胸围等生长性状，该发明是一种在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的分子遗传标记，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
文档编号C12Q1/68GK101985656SQ20101053153
公开日2011年3月16日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者张婧敏, 张春雷, 房兴堂, 陈宏 申请人:徐州师范大学