专利名称：一种检测黄牛tas1r3基因单核苷酸多态性的方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及 一种检测黄牛TAS1R3基因第2663位单核苷酸多态性的方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替 换而引起的多态性。因此，通常所说的SNPs包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝 数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转 换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱 去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在 基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs (cSNPs)、基因周边SNPs (pSNPs)和基因间 SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的 1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响， cSNPs又可分为两种一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的 蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱 基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋 白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要 影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研 究中也具有重要意义。由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs 可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见， 故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现 SNPs 即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核 苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法， 但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非 常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检 测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是， PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非 理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具 有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时， 检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷 酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测 平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术， 发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方 法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检 测的序列位点无特殊性要求。味觉提供有关食物性质和质量的信号，促使给个体对其识别和选择性摄取，消化 吸收，起到控制食欲，调节摄食量作用。TlRs受体之间形成异二聚体，不同的TlR系列组合 识别不同的味质，TAS1R3与TASlRl形成异二聚体识别绝大部分L-型氨基酸，而L型氨基 酸是所用蛋白质的必须成分，蛋白质作为生物合成、催化、生化反应必须的，是作为新陈代 谢的动力，作为酶类或是激素类，肽类在新陈代谢中的至关重要作用不言而喻。当与TAS1R2 形成的异二聚体识别甜味觉，TAS1R3本身是在基因扫描人类的GPCR时候发现其对应位于 在小鼠的Sac位点。Sac位点是控制小鼠对糖精，蔗糖和其他甜味成分的敏感度的基因目前，对于TAS1R3基因的研究多在小鼠和人类上，具体在该基因功能方面的研 究，以及该基因的单核苷酸突变影响影响动物味阈改变，影响动物的采食行为。国内未见关 于动物TAS1R3基因遗传变异的研究。中国黄牛TAS1R3基因遗传变异领域的研究匮乏，该 基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如初生重、日增重、体重等性状)关联的 研究仍是空白。由于TAS1R3基因功能涉及增重、体重生长性状，本发明提供的检测方法为 TAS1R3基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记 辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
发明内容
本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛TAS1R3基因的多态性，并将 其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记， 从而加快良种选育速度。本发明是通过以下技术方案来实现一种检测黄牛TAS1R3基因单核苷酸多态性的方法，以包含TAS1R3基因的待测黄 牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛TAS1R3基因；用限制性内切酶 HindIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚 丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛TAS1R3基因第2663位的单核苷酸多态性；所述的引物对P为上游引物5GCCTGGCTGGTAGTGCTGCT20;下游引物5CCAGGAAGGTGCCCAGGAAG20。所述的PCR扩增反应程序为94°C预变性 5min ；30 35 个循环，94°C变性 30s, 63. 5°C退火 30s，72°C延伸 30s ； 72°C延伸 IOmin0所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。所述根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛TAS1R3基因第2663位的单核苷酸 多态性为cc基因型表现为182bp和29bp条带；TC基因型表现为211bp、182bp和29bp条 带；TT基因型表现为211bp条带。本发明根据TAS1R3基因的序列设计引物，分别以3种黄 牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后在得到黄牛的 TAS1R3基因的部分序列。与NCBI公布的序列进行比较发现在第2663位存在SNP多态性。
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针对上述第2663位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计 特定的引物PCR扩增特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测 其单核苷酸的多态性。本发明对3个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位 点与黄牛部分生长性状(初生重、体重和日增重)进行关联分析，结果表明该位点能够作为 提高黄牛体重的分子标记。
图1为黄牛TAS1R3基因PCR产物电泳图2为黄牛TAS1R3基因包含第2663位的多态位点的211bp PCR产物的HindIII 酶切电泳结果；图3为黄牛TAS1R3基因SNP的不同基因型测序图。图4为HindIII PCR-RFLP方法检测黄牛TAS1R3基因第6外显子 SNP(NC_007314. 3 :g. 2663C > Τ)分析；
具体实施例方式本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛TAS1R3基因第2663位点同义密码子突变可能 产生转录后剪接效率，翻译速度和效率等发生变化的单核苷酸多态性进行检测，下面结合 对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。a、黄牛TAS1R3基因含第九外显子区域PCR引物的设计以NCBI所公布的牛(NC_007314. 3)序列为参考，利用Primer 5. 0设计能够扩增 包含黄牛TAS1R3基因第六外显子区域的PCR引物，其引物序列如下上游引物5GCCTGGCTGGTAGTGCTGCT20;下游引物5CCAGGAAGGTGCCCAGGAAG20;以上述引物对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛TAS1R3基因(NC_007314. 3序 列)第六外显子区域第2481bp 2691bp的211bp的基因片段，扩增后片段的电泳检测如 图1所示，其中，泳道1 10为检测片段，泳道M为Marker ；对扩增的片段进行测序鉴定后， 其中，第2661bp 2663bp的序列为如下所示CGGAGTGGTGCATGCCACCAATGCCATGCTG |GCC[ TTCCTCTGCTTCCTGGGCA ； 经过分析，发现Hindi 11 PCR-RFLP检测的SNP的位置如图4所示，当第2663bp (即 TAS1R3基因CDS区第2160位)的C突变为T时，导致编码第720位的密码子由GCC (如框 线所示序列)突变为 ，从而形成同义密码子突变，即由720Ala突变为772Ala。当2663bp由C突变为T时，PCR扩增TAS1R3基因产物的第第2660bp 2663bp序 列为ggct，限制性内切酶HindIII不能识别该位点，当在2663位点未发生突变时，PCR扩增 TAS1R3基因产物的第2660bp 2663bp序列为ggcc限制性内切酶HindIII识别该酶切位 点，进而将其切成182bp和29bp片段；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。b、以引物P进行PCR扩增待测黄牛的TAS1R3基因片段1、黄牛样本的采集本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1 河南南阳牛(258)，陕西秦川牛(178)，河南平顶山市郏县红牛(143)。表1黄牛样本的采集
品种样品数样品名称样品来源采样方式南阳牛258血样采自河南省南阳市黄牛良种繁育场(国静脉采血(NYcattle)家级黄牛保种场)16号针头秦川牛138血样采自陕西省秦川牛场、陕西省秦川牛良静脉采血(QC cattle)种繁育中心和陕西省大荔县16号针头郏县红牛143血样采自河南省平顶山市郏县红牛育种中静脉采血(JX cattle)心及各村镇16号针头2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500 μ L至1. 5mL Eppendorf离心 管，加入等体积PBS液，充分混勻，12000r/min离心IOmin (4°C )，弃去上清液，重复上述步骤 至上清液透明、沉淀呈淡黄色；2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500 μ L，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁， 37°C 水浴 Ih ；3)加蛋白酶K至3yL(20mg/mL)并混勻，55°C过夜至澄清，尚未澄清者，可补加 ι μ L蛋白酶κ混勻继续消化直至澄清；4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500 μ L，温和摇动离心管20min，使其充 分混勻；4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 1. 5mL离心管中，重复一次；5)加氯仿500 μ L，充分混勻20min，4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另 一 1. 5mL离心管中；6)加氯仿、异戊醇混合液(24 1) 500 μ L，充分混勻20min, 4°C，12000r/min离心 lOmin，将上清液转入另一 1. 5mL离心管中；7)加0. 1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管， 直至白色的絮状沉淀析出，_20°C保存30 60min ；8) 40C，12000r/min离心lOmin，弃去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；9) 40C，12000r/min离心lOmin，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；10)干燥后的DNA溶于80 100 μ L的TE液，4°C保存直至DNA完全溶解，0. 8%琼 脂糖凝胶电泳检测其质量，-80°C保存。11) 500 μ L的DNA溶液中加入10% SDS使其终浓度为0. 1 %，加入蛋白酶K至终浓 度达到50 μ g/mL ；12) 5 °C 保温 IOh 左右；13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25 24 1)和氯仿分别抽提一次；14) 12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA ；16)倒掉液体，70%乙醇洗涤后晾干，加入60 μ L灭菌超纯水溶解，4°C待检测。
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3、PCR 扩增PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和 1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1. 5mL离心管中，充 分混勻后瞬时离心，再分装到每个0. 2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离 心后进行PCR扩增；PCR反应体系见表2:表2PCR反应体系
体系成分体积(μυ灭菌超纯水(H2O)10.802xBuffer (内含 Mg2+、dNTPs 等)12.50引物P上游引物(10pmol/L)0. 50引物P下游引物(10pmol/L)0. 50Taq DNA 聚合酶(2.5 U/pL)0.25DNA 模扳(50ng/nL)0.45总体积25.0025μ L反应体系包括0.625 U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)， 2 X Buffer 12. 5 μ L (内含Mg2+、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/ μ L含 TAS1R3基因的黄牛基因组DNA 0. 45 μ L，lOpmol/μ L上、下游引物各0. 5 μ L ；PCR反应程序94°C 预变性 5min;
94°C 变性 30 s，
63.5°(退火30 8，L 30 35个循环； 72°C 延伸 30 s, ^72°C延伸 IOmin ；对3个黄牛品种的579个样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得579个个体的黄 牛TAS1R3基因中包含该SNP位点的21 Ibp的DNA片段。c、HindIII酶切消化PCR扩增的TAS1R3基因片段1、HindIII酶切反应消化体系(25 30 μ L) :10 15 μ L PCR产物，IOX缓冲 液(含 BSA) 2. 5 3.0 μ L，HindIII (IOU/μ L)为 1.0 1.5 μ L，灭菌纯水(H2O) 11. 5 16. 5μ L ；
2、酶切消化条件37°C恒温培养箱中消化5 10h。d、Hindi 11消化PCR产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析1)制作10 %的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)，点样后180V电压电泳50min，电泳结束后 EB染色；2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统 成像；3)根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析SNP多态性用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断SNP的多态性TAS1R3基因的第2663bp由C突变为T时，PCR扩增的TAS1R3基因产物的第 2660bp 266bp 3序列为ggct，不能识别，扩增片段未被限制性内切酶HindIII识别，片段 长度依然为21 Ibp ；而TAS1R3基因的第2663bp没有发生突变时，产物的第2660bp 2663bp 序列为ggc/c，限制性内切酶HindIII能识别，将对扩增片段酶切，片段切为182bp和29bp 两段；由于黄牛为2倍体，所以黄牛基因组的TAS1R3基因的第2663位的SNP的多态性 的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果为TT基因型表现为21 Ibp—条带；TC基因型表现为211bp，182bp，29bp三条条带；CC 基因型表现为182bp和29bp两条条带；由于29bp较小，在聚丙烯酰胺电泳分析中不太清 楚，但通过211bp和182bp这两条条带还是能够准确的鉴别TT基因型、TC基因型和CC基 因型不包含211bp条带的为CC基因型个体；不包含182bp条带为TT基因型个体；同时包 含21 Ibp和182bp条带为TC基因型个体。如图2所示，其中，泳道5包含182bp和21 Ibp条带，其为TC基因型个体，泳道3 不包含182bp条带，为TT基因型个体，泳道1、泳道2、泳道4、不包含2Ilbp条带，为CC基 因型个体，泳道 M 为 Marker I (2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)。4)不同基因型个体PCR产物的测序验证对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结 果表明包含182bp和21 Ibp条带的杂合子TC基因型个体其2663位的测序图的确表示为T 或C，如图3a所示，自左向右第6个峰为两个峰，而CC基因型、TT基因型分别为C、T，如图 3b、c所不。e、黄牛TAS1R3基因SNP位点的频率统计分析1)基因和基因型频率基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。Paa =NAA/N，其中Paa代表某一位点的AA基因型频率；Naa表示群体中具有AA基因型的个体数； N为检测群体的总数量。基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式
可以写成PA = (2NM+NAal+NAa2+NAa3+NAa4+......+NAan)/2N式中，Pa表示等位基因A频率，Naa表示群体中具有AA基因型的个体数量，NAai表 示群体中具有Aai基因型个体数量，al-an为等位基因A的η个互不相同的复等位基因。本研究所涉及的等位基因为T和C，所以具体的基因频率计算公式为Pc = (2NCC+NTC) /2N
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Pt = (2NTT+NTC) /2N式中，PT，Pc分别表示等位基因T和C等位基因的频率，NTT、NTe和Nee分别表示TT、 TC和CC基因型的个体数量，N表示总群体数目。在不同黄牛品种TAS1R3基因SNP中的C等位基因频率变化幅度在35. 7 % 62.6%, T等位基因频率变化幅度在37. 4% 64. 3%之间，如表3所示。表3黄牛TAS1R3基因第2663位SNP基因频率分布表
权利要求
一种检测黄牛TAS1R3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含TAS1R3基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛TAS1R3基因；用限制性内切酶HindIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛TAS1R3基因第2663位的单核苷酸多态性。所述的引物对P为上游引物5GCCTGGCTGGTAGTGCTGCT 20；下游引物5CCAGGAAGGTGCCCAGGAAG 20。
2.如权利要求1所述的检测黄牛TAS1R3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所 述的PCR扩增反应程序为94°C预变性 5min ；30 35 个循环 94°C变性 30s,63. 5°C退火 30s，72°C延伸 30s ；72°C 延伸lOmin。
3.如权利要求1所述的检测黄牛TAS1R3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所 述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4.如权利要求1所述的检测黄牛TAS1R3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，根 据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛TAS1R3基因第2663位的单核苷酸多态性为CC基因 型表现为182bp和29bp条带；TC基因型表现为211bp、182bp和29bp条带；TT基因型表现 为211bp条带。
全文摘要
本发明公开了一种检测黄牛TAS1R3基因单核苷酸多态性的方法，以包含TAS1R3基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛TAS1R3基因；用限制性内切酶HindIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛TAS1R3基因第2663位的单核苷酸多态性；由于TAS1R3基因功能涉及初生重、日增重、体重生长性状，本发明提供的检测方法为TAS1R3基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
文档编号C12Q1/68GK101962682SQ20101053154
公开日2011年2月2日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者张春雷, 房兴堂, 汪琴, 袁静, 钱丽娜, 陈宏 申请人:徐州师范大学