专利名称：一种促进脂肪酶催化猪油甲醇解的方法
技术领域：
本发明属于酶化学领域，涉及通过反应介质提高脂肪酶活性，同时促进脂肪酶催 化猪油甲醇解的技术。
背景技术：
脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，以脂肪酶催化动植物油脂转酯化制备生物柴 油，反应条件温和、醇用量少、甘油易回收、无废物，可以解决目前化学法生产生物柴油存在 的分离难、耗能多等问题。脂肪酶是一种油水界面激活酶，介质对酶促反应的影响极其重要。有人曾研究微 水环境、叔丁醇、正己烷、石油醚以及缓冲液离子浓度等对酵母来源的脂肪酶催化甘油三酯 甲醇解或水解的影响[1-4]。通过有机溶剂为反应介质，改变脂肪酶分子的构象W]、促进 酶与底物的结合，改善酶的催化性能，进而提高脂肪酶的经济性和实用性。参考文献[1] Jeong, G. T. Park D. H. Lipase-Catalyzed Transesterification of rapeseedoi1 for biodiesel production with tert—butanol, Appl Biochem Biotechnol，2008，148 :131-139[2]Nelson, L. A. Foglia, T. A. Marmer, W. N. Lipase-catalyzed production ofbiodiesel[J]· · Am. Oil. Chem. Soc.，1996,73 :1191-1195[3] Lu, J. Chen, Y. W. Wang, F. Tan T. W. Effect of water on methanolysis ofglycerol trioleate catalyzed by immobilized lipase Candida sp. 99—125 inorganic solvent system[J]. J Molecular Catalysis B:Enzymatic,2009, 56 :122-125[4]王丹，宋少芳，刘爱荣，于专妮，黄锡荣，李越中，曲音波，油包水微乳液介质中 脂肪酶催化α-单硬脂酸甘油酯水解反应活性研究.山东大学学报(理学版)2002，37: 527-53
发明内容
本发明的目的旨在提高脂肪酶在猪油甲醇解反应体系中的活性，进而促进脂肪酶 催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是提供一种促进脂肪酶催化猪油甲醇 解的方法，通过采用液态烷烃、甘油和磷酸缓冲液的混合液为反应介质，提高脂肪酶在猪油 甲醇解反应体系中的催化活性。在猪油和甲醇的混合液中，加入脂肪酶液和一定量的反应 介质，控制适当的温度和搅拌转速，即可实现猪油的甲醇解反应。其方法包括如下步骤a、脂肪酶液制备按Ig 6mL的比例将脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/ LK2HPO4-KH2PO4的磷酸缓冲液；b、脂肪酶液存放于4°C放置Mi ；C、反应介质制备反应介质的制备采用下述①或②的方法；
①按体积比为液态烷烃磷酸缓冲液=100 50 75，在液态烷烃中加入磷酸缓 冲液，搅拌混勻；或者②按体积比为液态烷烃磷酸缓冲液甘油=100 50 75 5，在液态烷 烃中加入磷酸缓冲液和甘油，搅拌混勻；在①或②中，所述液态烷烃为C6液态烷烃，所述磷酸缓冲液为pH接近中性的磷酸 缓冲液；d、将猪油、甲醇和脂肪酶液按质量比为1 3.74X10—5 3.47X10—4进行混 合，加入占整个反应体系40vt% 70vt%的反应介质，密封后，于38°C、160rmp振荡反 应；分别在反应他和16h时再各加一次甲醇，每次甲醇的加入量为猪油和甲醇质量比为 1 3. 74X10—5，共反应24h结束反应。优选的，步骤c的反应介质制备中所述的液态烷烃为C6液态直链烷烃或环烷烃， 所述的PH接近中性的磷酸缓冲液为pH6. 8或pH7. 0的磷酸盐缓冲液。更优选的，步骤c的反应介质制备中所述的C6液态直链烷烃或环烷烃为正己烷或 环己烷；所述的PH6. 8或pH7. 0的磷酸盐缓冲液为30 70mmol/L的磷酸盐缓冲液。本发明的有益效果在于采用本发明所述的方法，通过使用由有机溶剂中加入甘油 和缓冲液构成的反应介质，即可提高脂肪酶在猪油甲醇解反应体系中的活性，进而促进脂 肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯。猪油甲醇解的转化率为对照的1. 2 4. 8倍(以不 加相应介质的体系为对照)，改善了脂肪酶的使用性能。与现有技术相比较，本方法的突出优点为操作简单，能有效提高脂肪酶对猪油甲 醇解的催化活性，具有推广利用价值。以下结合实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。
图1为应用反应介质促进脂肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯的工艺流程示 意图。
具体实施例方式实施例1a、脂肪酶液制备按Ig 6mL的比例将脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸缓冲液；所述的脂肪酶为深圳绿微康生物工程有限公司生产的产品名 称为LVK-F100的脂肪酶。b、脂肪酶液存放于4°C放置Mh ；C、反应介质制备在正己烷或环己烷中加入0.5倍正己烷或环己烷体积的 50mmol/L、pH6. 8的磷酸盐缓冲液，搅拌混勻；d、猪油甲醇解将猪油、甲醇和脂肪酶液按质量比为1 3. 74X ΙΟ"5 3.47X10-4 进行混合，加入占整个反应体系40vt%的反应介质，密封后，于38°C、160rmp振荡反应。分 别在反应他和IMi时再各加入按猪油和甲醇质量比为1 3.74X10_5的甲醇一次，共反应 24h结束反应。甲醇解转化率测定将反应物倒入分液漏斗静置至分层，分离出下层液体，并洗涤上层液体3次，把直接分层和洗涤分层的下层液体混合均勻，测定甲醇解转化率。以不添加正己烷和环己烷、仅加磷酸缓冲液的体系为对照，猪油甲醇解的转化率 为对照的1.5倍以上。以不加磷酸缓冲液、仅加正己烷或环己烷的体系为对照，猪油甲醇解的转化率为 对照的4. 4倍以上。实施例2a、脂肪酶液制备按Ig 6mL的比例将脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸缓冲液；所述的脂肪酶为深圳绿微康生物工程有限公司生产的产品名 称为LVK-F100的脂肪酶。b、脂肪酶液存放于4°C放置Mh ；C、反应介质制备在正己烷中加入0. 75倍正己烷体积的50mmol/L、pH6. 8的磷酸 盐缓冲液，搅拌混勻；d、猪油甲醇解将猪油、甲醇和脂肪酶液按质量比为1 3. 74X ΙΟ"5 3.47X10-4 进行混合，加入占整个反应体系70vt%的反应介质，密封后，于38°C、160rmp振荡反应。分 别在反应他和IMi时再各加入按猪油和甲醇质量比为1 3.74X10_5的甲醇一次，共反应 24h结束反应。甲醇解转化率测定将反应物倒入分液漏斗静置至分层，分离出下层液体，并洗涤 上层液体3次，把直接分层和洗涤分层的下层液体混合均勻，测定甲醇解转化率。以不加磷酸缓冲液、仅加正己烷的体系为对照，猪油甲醇解的转化率为对照的4. 6 倍以上。实施例3a、脂肪酶液制备按Ig 6mL的比例将脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸缓冲液；所述的脂肪酶为深圳绿微康生物工程有限公司生产的产品名 称为LVK-F100的脂肪酶。b、脂肪酶液存放于4°C放置Mi ；C、反应介质制备在正己烷中加入0. 5倍正己烷体积30mmol/L、pH7. 0的磷酸盐缓 冲液，搅拌混勻。d、猪油甲醇解将猪油、甲醇和脂肪酶液按质量比为1 3.74X10_5 3.47X10_4 进行混合，加入占整个反应体系60vt%的反应介质，密封后，于38°C、160rmp振荡反应。分 别在反应他和IMi时再各加入按猪油和甲醇质量比为1 3.74X10_5的甲醇一次，共反应 24h结束反应。甲醇解转化率测定将反应物倒入分液漏斗静置至分层，分离出下层液体，并洗涤 上层液体3次，把直接分层和洗涤分层的下层液体混合均勻，测定甲醇解转化率。以不加正己烷和环己烷、仅加磷酸缓冲液的体系为对照，猪油甲醇解的转化率为 对照的1.2倍。以不加磷酸缓冲液、仅加正己烷的体系为对照，猪油甲醇解的转化率为对照的4. 8 倍。以不加磷酸缓冲液、仅加正己烷和去离子水的体系为对照，猪油甲醇解的转化率为对照 的3. 7倍。实施例4
a、脂肪酶液制备按Ig 6mL的比例将脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸缓冲液；所述的脂肪酶为深圳绿微康生物工程有限公司生产的产品名 称为LVK-F100的脂肪酶。b、脂肪酶液存放于4°C放置Mh ；C、反应介质制备在正己烷中加入0. 5倍正己烷体积70mmol/L、pH7. 0的磷酸盐缓 冲液，搅拌混勻。d、猪油甲醇解将猪油、甲醇和脂肪酶液按质量比为1 3. 74X ΙΟ"5 3.47X10-4 进行混合，加入占整个反应体系60vt%的反应介质，密封后，于38°C、160rmp振荡反应。分 别在反应他和IMi时再各加入按猪油和甲醇质量比为1 3.74X10_5的甲醇一次，共反应 24h结束反应。甲醇解转化率测定将反应物倒入分液漏斗静置至分层，分离出下层液体，并洗涤 上层液体3次，把直接分层和洗涤分层的下层液体混合均勻，测定甲醇解转化率。以不加磷酸缓冲液、仅加正己烷和去离子水的体系为对照，猪油甲醇解的转化率 为对照的2. 2倍。实施例5a、脂肪酶液制备按Ig 6mL的比例将脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸缓冲液；脂肪酶为深圳绿微康生物工程有限公司生产的产品名称为 LVK-F100的脂肪酶。b、脂肪酶液存放于4°C放置Mh ；C、反应介质制备按体积比为液态烷烃磷酸缓冲液甘油=100 50 75 5，在液态烷烃中加入70mmol/L、pH6.8的磷酸盐缓冲液和甘油，搅拌混勻。d、猪油甲醇解将猪油、甲醇和脂肪酶液按质量比为1 3. 74X ΙΟ"5 3.47X10-4 进行混合，加入占整个反应体系60vt%的反应介质，密封后，于38°C、160rmp振荡反应。分 别在反应他和IMi时再各加入按猪油和甲醇质量比为1 3.74X10_5的甲醇一次，共反应 24h结束反应。e、甲醇解转化率测定将反应物倒入分液漏斗静置至分层，分离出下层液体，并洗 涤上层液体3次，把直接分层和洗涤分层的下层液体混合均勻，测定甲醇解转化率。以不加甘油、仅加正己烷或环己烷和磷酸缓冲液的体系为对照，猪油甲醇解的转 化率为对照的1.4倍以上。
权利要求
1.促进脂肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法，其特征在于包括如下步骤a、脂肪酶液制备按Ig 6mL的比例将脂肪酶加入pH7. 0,0. 05mol/LK2HPO4-KH2PO4的 磷酸缓冲液；b、脂肪酶液存放于4°C放置24h；c、反应介质制备反应介质的制备采用下述①或②的方法；①按体积比为液态烷烃磷酸缓冲液=100 50 75，在液态烷烃中加入磷酸缓冲 液，搅拌混勻；或者②按体积比为液态烷烃磷酸缓冲液甘油=100 50 75 5，在液态烷烃中 加入磷酸缓冲液和甘油，搅拌混勻；在①或②中，所述液态烷烃为C6液态烷烃，所述磷酸缓冲液为pH接近中性的磷酸缓冲液；d、猪油甲醇解将猪油、甲醇和脂肪酶液按质量比为1 3.74X10—5 3.47X10—4进 行混合，加入占整个反应体系40vt% 70vt%的反应介质，密封后，于38°C、160rmp振荡反 应；分别在反应他和16h时再各加一次甲醇，每次甲醇的加入量同样按照猪油和甲醇质量 比为1 3.74X10—5加入，共反应24h结束反应。
2.根据权利要求1所述促进脂肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法，其特征在 于步骤c的反应介质制备中所述的液态烷烃为C6液态直链烷烃或环烷烃，所述的pH接近 中性的磷酸缓冲液为PH6. 8或pH7. 0的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述促进脂肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法，其特 征在于步骤c的反应介质制备中所述的C6液态直链烷烃或环烷烃为正己烷或环己烷；所述 的pH6. 8或pH7. 0的磷酸盐缓冲液为30 70mmol/L的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1或2所述促进脂肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法，其特 征在于所述的脂肪酶为深圳绿微康生物工程有限公司生产的产品名称为LVK-F100的脂肪 酶。
全文摘要
一种促进脂肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法。采用能改变脂肪酶分子构象以及含水量的以液态烷烃和磷酸缓冲液构成的反应介质或以液态烷烃、磷酸缓冲液和甘油构成的反应介质，在其中进行脂肪酶催化猪油甲醇解的反应；所述的液态烷烃选取C6液态烷烃，所述的磷酸缓冲液为pH接近中性的磷酸缓冲液。所构成的反应介质可用于脂肪酶催化猪油甲醇解，猪油甲醇解的转化率为不加介质的对照体系的1.2～4.8倍。
文档编号C12P7/62GK102051387SQ201010531729
公开日2011年5月11日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者孙玉梅, 张瑶瑶, 曹方 申请人:大连工业大学