专利名称：黄牛pcsk1基因的单核苷酸多态性及其检测方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，涉及以黄牛的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作 为分子遗传标记，特别涉及三种黄牛PCSKI基因的单核苷酸多态性及其检测方法。
背景技术：
黄牛是我国的主要的畜牧之一，但是现在面临着优秀黄牛品种种源不足和种群遗 传品质较差的压力。传统的育种方法应用测试动物的表现型和其亲代、祖代及其它亲属在 小的动物模型中的遗传信息，设想性状受到许多基因遗传差异的影响，每个基因对性状有 相对较小的贡献，因此对性状的估计不可避免有些偏差。分子遗传标记是近年来现代遗传 学发展最快的领域之一，新的方法正在不断涌现，已定位的标记基因数目与日俱增。这将为 数量遗传学提供分子水平信息，家畜育种也将跨入分子育种阶段。应用分子遗传标记的现 代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加黄牛的产肉量和改善肉品质的 先进的有效的方法。分子遗传标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传 标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信 息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。 标记辅助选择主要经历了三个阶段第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋 白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记 技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现 分子标记辅助选择的目标。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)作为新的遗传标记已 广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。SNP是基因组中存在的一种数量非 常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90%以上。SNP与罕见的变异不同，通常 在种群中频率等于或小于的此种变异被称为突变，而只有频率大于时才被称为单 核苷酸多态性。目前，主要采用几种不同的方法来发现SNPs: DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA 测序结合法、AS-PCR方法、PCR-RFLP法、TaqMam技术与分子信标(Molecular Beacons)等。 在这些SNP检测技术中，(I)DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用 极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员 和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；(2) PCR-SSCP 与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操 作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；(3)AS-PCR 方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方 法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概 率，因此，目前不具有普遍应用的特点；(4) TaqMam技术与分子信标(Molecular Beacons) 都是在荧光能量转移(Fluorescence Resornance Energ Transfer，FRET)基础上建立起来的，利用荧光标记及仪器达到检测目的。焦磷酸测序(Pyrosequencing)则是利用测序过程 中可释放的焦磷酸和酶类产生荧光，是不依赖平板胶或毛细管电泳、不依赖DNA的荧光标 记技术，很可能成为未来的主流技术。(5) RFLP-PCR方法是一种检测SNP的有效技术，在发 现SNP位点后引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准 确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐 操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。PCSKs是一类丝氨酸蛋白酶，负责许多激素原和神经肽前体的剪切和成熟。到 目前为止，已经发现 9 种 PCSKs 包括 PCSKl (PCI/3, PCl)，PCSK2 (PC2)，PCSK3 (furin)， PCSK4 (PC4)，PCSK5 (PC5/6)，PCSK6(PACE4)，PCSK7(PC7/8)，PCSK8(SKI)，PCSK9(NARC-I)。其 中前7种PCs在碱性氨基酸末端分开，且这些碱性氨基酸具有一致序列Arg/Lys/His-X-X/ Lys/Arg-Arg，它的下游X表示除Cys外的任何氨基酸，后两种PCs在非基本氨基酸末端分 开。大量研究显示PCs在健康和疾病如肿瘤发生，肥胖症，糖尿病，病毒感染，细菌致病机 理，动脉粥样硬化和神经退行性变疾病中发挥不同的作用。PCSKl的转录物最初是在神经内分泌细胞中发现的，PCSKl能生成一种前蛋白转 化酶，它可激活人体内控制食欲的胰岛素、胰高血糖素以及令人产生饱胀感的阿黑皮素原 (POMC)等。PCSKl大量存在于脑垂体的垂体前叶(AL)中，PCSK2存在于神经中叶(NIL). PCSKl和PCSK2共同参与POMC的激活过程。在AL中POMC被转化成ACTH(促肾上腺皮质激 素)和β _LPR( β-促脂肪动用激素)，在NIL中ACTH被进一步转化为a-MSH(a-促黑色 素细胞激素)和CLIP (中间叶促皮质样态)，β-UR进一步转化为i3-MSH(i3-促黑色素细 胞激素)和β -END ( β -内啡肽)。为此，PCSKl基因遗传变异或SNP位点在动物生产实践 中对生长发育性状具有重要的作用。关于动物PCSKl基因遗传变异的研究国内外多见于人、鼠等动物，而少见黄牛 PCSKl基因遗传变异或SNP研究的报道。由于目前黄牛PCSKl基因遗传变异领域的研究匮 乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状(如生长发育性状)关联的研 究成为空白。
发明内容
本发明解决的问题在于提供黄牛PCSKl基因单核苷酸多态性检测方法及其应用， 寻找与黄牛经济性状相关的SNP作为分子标记，加快黄牛良种繁育速度。本发明通过以下技术方案来实现三种黄牛PCSKl基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括黄牛PCSKl基因第44686位为T或G的单核苷酸多态性。上述黄牛PCSKl基因的单核苷酸多态性的检测方法为以包含PCSKl基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增 黄牛PCSKl基因；用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据电泳结果鉴定黄牛PCSKl基因第44686位的单核苷酸多态 性；所述的引物对P为上游引物P1 TCAAAGCAATCACCAAAGAAG 21 ；
下游引物P2 ACAAAACACCCACTTCAGACA 21。所述的PCR扩增反应程序为94°C预变性 5min ；94°C变性 30s，62. 5°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 个循环；72°C 延伸lOmin。所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。所述的根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结PCSKl基因第44686位的碱基多态性为TT型 表现203bp和103bp ；TG型表现306bp、203bp和103bp ；GG型表现:306bp。与现有技术相 比，本发明具有以下有益的技术效果本发明公开了与黄牛生长发育相关的功能基因PCSKl的核苷酸多态性，该核苷酸 多态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估 计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。本发明对PCSKl基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，以及与三种黄牛体 尺性状之间进行了性状关联分析；结果显示PCSKl基因的核苷酸多态位点能够成为分子遗 传辅助育种的标记。本发明提供的检测方法为PCSKl基因的SNP与体尺性状关系的建立奠定了基础， 以便用于中国黄牛标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
图1为黄牛血样基因组DNA电泳检测图；图2为黄牛PCSKl基因第14外显子及侧翼区306bp克隆测序PCR产物电泳图；图3为黄牛PCSKl基因第14外显子及侧翼区306bp PCR产物的HinfI酶切电泳检 测PCSKl基因多态性的电泳结果图；泳道1，3，4，6 :GG基因型个体(306bp)；泳道2、7 :TG基 因型个体(306bp，203bp，103bp)；泳道 5 :TT 基因型个体(203bp，103bp) ；M =Marker (622bp, pBR322DNA/Msp I Markers)。图4为黄牛PCSKl基因SNP的不同基因型测序峰图。
具体实施例方式本发明以PCSKl基因保守序列设计引物扩增PCSKl基因第14外显子及侧翼区 306bp片段，分别以三种黄牛品种的基因组为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，经测 序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态；针对发现的单核苷酸多态进行性状关联性分析，并 提供其检测方法，使得PCSKl基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗 传标记，为加快建立具有优质经济性状的黄牛种群提供依据。a、黄牛PCSKl基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测1、黄牛血样的采集及处理取黄牛血样10mL，加入0. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰 盒，-80°C保存备用。本实施例采用了 3个黄牛品种，具体如表1所示。表1奶山羊样品来源表
权利要求
黄牛PCSK1基因的单核苷酸多态性，其特征在于，其基因单核苷酸多态性包括黄牛PCSK1基因第44686位为T或G的单核苷酸多态性。
2.黄牛PCSKl基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤 以包含PCSKl基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PCSKl基因；用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚 丙烯酰胺凝胶电泳；根据电泳结果鉴定黄牛PCSKl基因第44686位的单核苷酸多态性； 所述的引物对P为上游引物 Pl TCAAAGCAATCACCAAAGAAG 21 ； 下游引物 P2 :ACAAAACACCCACTTCAGACA 21。
3.如权利要求2所述的黄牛PCSKl基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所 述的PCR扩增反应程序为94°C预变性5min ；94°C变性30s, 62. 5°C退火30s，72°C延伸30s，35个循环；72°C延伸 IOmin0
4.如权利要求2所述的黄牛PCSKl基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所 述的聚丙烯酰胺凝胶的浓度为12%。
5.如权利要求2所述的黄牛PCSKl基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所 述的根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结PCSKl基因第44686bp位为TT型表现203bp和103bp ； TG 型表现306bp、203bp 和 103bp ；GG 型表现306bp。
全文摘要
本发明公开了黄牛PCSK1基因的单核苷酸多态性及其检测方法，其基因单核苷酸多态性包括以包含PCSK1基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛PCSK1基因；用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据电泳结果鉴定黄牛PCSK1基因第44686bp的碱基多态性。该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长发育性状密切相关的分子遗传标记，以用于黄牛的辅助选择和分子育种，加快黄牛良种繁育速度。
文档编号C12Q1/68GK101962684SQ20101053156
公开日2011年2月2日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者单俐敏, 张春雷, 房兴堂, 汪琴, 陈宏 申请人:徐州师范大学