专利名称：一种黄牛add1基因单核苷酸多态性及其检测方法
一种黄牛ADD1基因单核苷酸多态性及其检测方法技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及黄牛ADDl基因的单核苷酸多态性(SNP)的筛查和 检测及其作为辅助选择标记在黄牛育种中的应用。
背景技术：
基因多态性是指不同物种或同一物种内不同个体间基因组序列的差异，这些差异 是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，它包括碱基的替换、插入、缺失以及重复 序列拷贝数的变化。
单核苷酸多态性指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的 多态性，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型变异的SWs约占2/3，其他几 种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多 数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。
根据对遗传性状的影响，基因多态性又可分为两种一种是同义基因多态性，即 SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱 基的“含义”相同；另一种是非同义基因多态性，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改 变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非 同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更 可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重 要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的 研究中也具有重要意义。
近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多 态技术(SSCP) ,PCR-RFLP和直接测序技术等，SSCP它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱 基突变。iTakao,经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现， 他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过 聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种 方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊 的仪器。
Adducin是一种新的细胞膜骨架蛋白，是一种由α和β两个亚单位组成的异二 聚体蛋白质(hetero dimeric protein),位于 spectrin-actin 的连接部。Adducin 可选 择性地与spectrin-actin复合物结合，结合位点位于其α和β亚单位的尾部，且亲和力 明显高于与任一 spectrin或actin单体的结合(J Biol Chem, 1996) 电镜证实，adducin 还具有促进spectrin分子与spectrin-actin复合物结合而形成多边网状结构，以及促进 actin纤维聚合的功能(J Biol Chem, 1998) 1996年Kuhlman等发现adducin尚具有阻 止actin纤维快速生长端(fast growing end)延伸的功能，起成帽蛋白的作用，其结果使 actin纤维长度均一，更有利于actin纤维的聚合。Actin(肌动蛋白)是一种重要的收缩 蛋白，不仅参与肌球蛋白介导的肌肉收缩运动(Holmes，1998 ；Pollard，1990)，而且也可以通过受调控的聚合动力学过程(Smith，1988)或凝胶一溶液转化(Pollard et al. , 1982) 单独介导细胞运动。Adducin除具有构建和维持细胞膜骨架网状结构的功能外，在细胞信号 转导和细胞膜离子转运中亦有重要作用。Tripodi等于1996年进行的大鼠肾小管上皮细胞 (NRK252E)转染试验进一步证实，与转染MNScDNA的细胞相比，携带突变cDNA的转染细胞钠 泵的最大转运速率加快，且actin与突变adducin的聚合作用明显增强，提示adducin基因 突变具有显著的功能改变。Adducin参与小鼠卵母细胞染色体的减数分裂，提示其在胚胎发 育中可能起一定作用。在猪上的研究表明，编码肌动蛋白(Actin)的基因与皮率、肩部背膘 厚、肥肉率、瘦肉率、臀部平均背膘厚、眼肌高、股二头肌PH和肌内脂肪有一定的相关性。
目前，对ADDl基因的研究着重在人和小鼠上，且是与高血压发病的关系的研究。 但是对有关ADDl基因变异与高血压发病关系的研究结果颇不一致。关于ADDl基因与生长 发育性状的研究尚未有报道，基于肌动蛋白的研究成果，将进一步探讨adducin (细胞膜骨 架蛋白)的功能。发明内容
本发明解决的问题在于利用PCR产物混合测序的方法筛查黄牛ADDl基因的多态 性位点，提供了一种黄牛ADDl基因多态性的筛查和检测方法。通过关联分析寻找与黄牛生 长性状相关的SNP作为分子标记，以功能SNP作为黄牛分子育种和辅助选择的标记，加快良 种选育速度和提高种群品质。
本发明是通过以下技术方案来实现
一种黄牛ADDl基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括
在黄牛的ADDl基因第70027位为G或A的碱基多态性；
在黄牛的ADDl基因第70051位为G或A的碱基多态性。
所述黄牛ADDl基因的单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤
以包含ADDl基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增 黄牛ADDl基因；所述的引物对P为
上游引物5，ATAGTCATCTGACCTGCTTGA3，
下游引物5，AGCGGTGACCACATTCTTA3，；
PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化、测 序；
最后进行PCR-SSCP检测首先分别用变性剂进行变性处理，然后根据聚丙烯酰胺 凝胶电泳结果判定其多态性。
所述的黄牛ADDl基因的单核苷酸多态性的检测方法，所述的PCR扩增的反应程序 为:95°C预变性^iin ；94°C变性45s，58°C退火50s，72°C延伸Imin, 32个循环，最后72°C延 伸 10min，4°C 保存。
所述的黄牛ADDl基因的单核苷酸多态性的检测方法，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳 采用10%的聚丙烯酰胺凝胶。
本发明利用PCR-SSCP方法对黄牛ADDl基因第八外显子70027和70051位点上的 错义突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测。
本发明对3个黄牛品种上述两个SNP进行了基因分型和基因频率分析，同时也对SSCP多态位点与黄牛生长性状之间进行了关联分析。
与现有技术相比，本发明把PCR产物混合测序筛查SNP与PCR-SSCP结合起来解决 了 SSCP的不稳定性，以防突变位点的漏检，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的， 便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的遗传标记，可用于黄 牛的辅助选择和分子育种。
图1是本发明的技术流程示意图2是本发明中PCR产物混合测序筛查到的黄牛ADDl基因序列70027位G-A突 变测序结果图3是本发明中PCR产物混合测序筛查到的黄牛ADDl基因序列70051位G-A突 变测序结果图4是本发明用来检测PCR产物片段大小的琼脂糖凝胶电泳；
图5是本发明用来检测各样本突变情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
具体实施方式
本发明首先根据ADDl基因的保守序列设计引物，分别以3种黄牛品种的基因组 DNA为模板，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列 比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-SSCP检测；最后，根据在群体 中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析，筛选出与黄牛生长性 状密切相关的分子标记。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
a、地方黄牛品种ADDl基因部分DNA序列的克隆
1、血样的采集及处理
取血样10mL，加入0. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰 盒，-80°C保存备用。
本研究所用黄牛血样总数555份，具体为
1)郏县红牛374份血样采自河南省平顶山市郏县红牛保种区；
2)秦川牛血样116份采自河南省南阳市黄牛良种繁育场；
3)鲁西牛血样65份，采自山东牛场。
2、血样基因组DNA的提取
(1)将冷冻血样室温解冻，转移500 μ L至1. 5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓 冲液，充分混勻，12000r/min离心10mir^4°C )，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。
(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500 μ L，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管 壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提缓冲液的配制:0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS 加超纯水500mL，灭菌、调pH至8. 0，4°C保存备用。
(3)加蛋白酶K 3yL(20mg/mL)并混勻，55°C过夜至澄清，尚未澄清者，可补加 ι μ L蛋白酶κ混勻继续消化至澄清。
(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500 μ L，温和摇动离心管20min，使其充分混勻，4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 1. 5mL离心管中，重复一次。
(5)加氯仿500 μ L，充分混勻20min，4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另 一 1. 5mL离心管中。
(6)加0. 1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管 直至白色的絮状沉淀析出，_20°C保存30 60min。
(7) 4°C，12000r/min离心lOmin，弃上清，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。
(8)4°C,12000r/min离心lOmin，弃上清，室温下使乙醇挥发干净。(9)干燥后的 DNA溶于80 100 μ L的TE-缓冲液或超纯水，4°C保存直至DNA完全溶解，0. 8%琼脂糖凝 胶电泳检测其质量，-80°C保存。
3、扩增引物设计
根据NCBI 数据库中(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)牛的 GenBank 登录号为 NC_007304的ADDl基因的外显子8DNA序列，以该基因序列保守区序列为参考利用I^rimer 5.0设计PCR引物对，其引物对序列如下
上游引物5，ATAGTCATCTGACCTGCTTGA3，
下游引物5，AGCGGTGACCACATTCTTA3，
该引物扩增了黄牛ADDl基因第8外显子区域及一部分内含子区域。
4、PCR扩增ADDl基因外显子8
分别以3个黄牛品种的DNA为模版，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反 应体系为15 μ L，见表1 ；PCR总反程序，见表2。
表IPCR反应体系
权利要求
1.一种黄牛ADDl基因的单核苷酸多态性，其特征在于，其基因单核苷酸多态性包括在黄牛的ADDl基因第70027位为G或A的碱基多态性；在黄牛的ADDl基因第70051位为G或A的碱基多态性。
2.权利要求1所述黄牛ADDl基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以 下步骤以包含ADDl基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛 ADDl基因；所述的引物对P为上游引物5，ATAGTCATCTGACCTGCTTGA3，下游引物5，AGCGGTGACCACATTCTTA3，；PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化、测序；最后进行PCR-SSCP检测首先分别用变性剂进行变性处理，然后根据聚丙烯酰胺凝胶 电泳结果判定其多态性。
3.如权利要求2所述的黄牛ADDl基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于， 所述的PCR扩增的反应程序为95°C预变性^iin ；94°C变性45s，58°C退火50s，72°C延伸 Imin，32个循环，最后72°C延伸IOmin，4°C保存。
4.如权利要求2所述的黄牛ADDl基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所 述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10%的聚丙烯酰胺凝胶。
全文摘要
本发明公开了一种检测黄牛ADD1基因单核苷酸多态性的方法，以包含ADD1基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛ADD1基因，再进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段大小；然后进行SSCP多态性的检测。其基因多态性包括在黄牛的ADD1基因序列表SEQID No.8第70027位为G或A的碱基多态性；在黄牛的ADD1基因序列表SEQID No.8第70051位为G或A的碱基多态性。SSCP多态性与生产性能关联分析证实SSCP多态位点与生产性状之间有一定的相关性，秦川牛基因型为BB的个体体重显著高于基因型AA为个体的。该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的分子遗传标记，以用于黄牛的辅助选择和分子育种，对提高黄牛的生产性能具有重要的作用。
文档编号C12Q1/68GK102031304SQ20101053155
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者张春雷, 房兴堂, 钱丽娜, 陈宏 申请人:徐州师范大学