一种鼠李聚糖硫酸酯及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种鼠李聚糖硫酸酯及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鼠李聚糖硫酸酯及其制备方法和应用。
背景技术：
血栓栓塞性疾病是现代社会主要的致死性疾病之一，且随着人类饮食结构
的变化有逐年上升的趋势。目前，每年抗凝血药物的全球市值约为40亿美元， 并以13%的速度逐年递增；抗血栓药物的全球市值约为120亿美元，每年以15 %的速度递增。因此，现有抗凝血和抗血栓药物远远不能满足日益增长的临 床需要。而且，研究发现作为抗凝血药物已经广泛应用了70多年的肝素具有多 种副作用，如诱发血小板减少症、出血作用、对先天性凝血酶缺乏无效、无抑 制凝血酶与纤维蛋白结合的能力。此外，制备肝素的主要原料中肝素浓度低， 与牛相关的"疯牛病"的发生，迫切需要寻找抗凝血药物的可替代资源。近 年来人们除继续研究开发低分子量肝素，如依诺肝素、那屈肝素钙、达肝素钠 和亭扎肝素钠外，还根据肝素的结构特点进行天然高分子的结构改造，如纤维 硫酸酯、果胶、甲壳质、软骨素以及这些多糖衍生物的硫酸酯。实验证明，这 些肝素类物质都具有一定的抗凝血活性，但都有一定的毒性。海藻是抗凝血多 糖的一个天然丰富来源。目前海藻多糖的研发主要集中于红藻多糖和褐藻多 糖。如藻酸双酯钠及甘糖酯，是以褐藻酸为原料，经过分子修饰而制备的具有 抗血栓作用药物；另外，研究比较多的则是褐藻岩藻聚糖硫酸酯，其具有抗血 栓形成和溶解血栓的双重作用。但是，目前有关绿藻多糖的研发很少。绿藻多 糖主要存在于绿藻细胞间质中，多为水溶性硫酸多糖，它也存在于绿藻细胞壁
之中，绿藻细胞壁微纤维主要由木聚糖或甘露聚糖构成，另外，绿藻细胞质内 尚有少量的多糖存在。水溶性硫酸多糖是绿藻多糖的主要成分，其组成和结构 随绿藻种类的不同而不同。目前，有关鼠李聚糖硫酸酯未见报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种鼠李聚糖硫酸酯及其制备方法和应用，它能弥补 现有技术的上述不足。
一种鼠李聚糖硫酸酯，其特征在于该鼠李聚糖硫酸酯是鼠李糖构成的长链
多糖，同时在鼠李糖基上连接着硫酸酯基，硫酸酯基的取代度为0.4 2，鼠李 聚糖硫酸酯的重均分子量为150000 400000道尔顿，分子式为(C6H704R2) n， 结构式如下所示
其中n=500~1800， R=H或S03—。
上述鼠李聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于将海藻藻体加水浸泡匀 浆，室温提取，分离出沉淀物，再向沉淀物加水，加热提取，分离出清液， 将所得清液浓缩，脱盐，再将脱盐后的溶液浓缩，然后依次通过离子交换色 谱柱分离、凝胶色谱柱分离，将得到的多糖溶液浓縮，干燥。 上述鼠李聚糖硫酸酯在制备抗凝血药物或抗栓药物中的应用。 本发明的鼠李聚糖硫酸酯是一种具有强聚阴离子性质的硫酸多糖类化合 物，来源于天然海藻，有望成为一种新型的抗凝血药物或抗栓药物，将具有 良好的市场应用前景。
具体实施例方式
称取干燥的海藻藻体加入海藻重量10 60倍的水浸泡匀浆，室温下搅拌
提取0.1 2小时，离心弃去清液，取含海藻藻体的沉淀物，再加海藻重量 10 60倍的水，在60 100。C水浴中搅拌提取1~10小时，离心弃去杂质，取 清液，将所得清液减压浓縮，然后进行透析或超滤去除盐，将除去盐后的多 糖溶液减压浓縮后，通过离子交换色谱柱Q-Sepharose Fast Flow分离，依次 以蒸馏水、0.01 5.0 mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集多糖溶液，将该多糖溶 液减压浓縮，再通过凝胶色谱柱SephacryalS-400HR进一步分离，以蒸馏水 洗脱，收集多糖溶液，将所得多糖溶液减压浓縮，冷冻干燥即得本发明的鼠 李聚糖硫酸酯。
本实施例中所述的海藻藻体可为礁膜、宽礁膜、袋礁膜、囊礁膜、北极 礁膜、破礁膜、厚礁膜、皱礁膜、褐色礁膜、尖种礁膜、孔石莼、石莼、长 石莼、硬石莼或花石莼；所述的海藻藻体加水浸泡匀浆，也可为将海藻碾碎、 切细、剁碎、研磨或绞碎与水混合形成海藻匀浆，或将海藻加工成干燥粉末 与水混合形成海藻匀浆；所述的离子交换色谱柱Q-Sepharose Fast Flow还 可改用DEAE Sepharose、DEAE Cellulose、DEAE Sephadex、 Q-Sepharose XL、 Q Sepharose、 Q Sepharose 4 Fast Flow、 QAE Sephadex或Dowex;所述的用 蒸馏水、0.01 5.0mol/L氯化钠水溶液洗脱也可改用蒸馏水、0.01 5.0mo}/L 氯化钾水溶液洗脱；所述的凝胶色谱柱Sephacryal S-400 HR还可改用 Sephacryal S-300 HR、 Sephacryal S-200 HR、 Sephacryal S-100 HR、 Sephacryal S-500HR、 Sephacryal S-1000 SF、 Toyopearl HW-65、 Superdex200、 Superose 6、 Superose 12、 Sepharose 6 Fast Flow、 Sepharose 4 Fast Flow、 Sepharose 2B、
Sepharose 4B、 Sepharose 6B、 Sepharose CL-2B、 Sepharose CL-4I3或Sepharose CL-6B;所述的用蒸馏水洗脱也可改用0.01 1.0 mol/L醋酸钠水溶液、 0.01 1.0mol/L氯化钠水溶液、0.01 1.0mol/L氯化钾水溶液或0.01-1.0 mol/L
碳酸氢铵水溶液洗脱。
本发明的鼠李聚糖硫酸酯为白色或类白色无定形粉末，略有淡咸味。用气 相色谱法测定多次制得的鼠李聚糖硫酸酯的单糖组成，用高碘酸氧化、 Smith(史密斯)降解和甲基化分析测定糖苷键连接位置、用硫酸钡-明胶比浊法 测定硫酸酯基含量并计算硫酸酯基取代度、用高效凝胶渗透色谱法测定分子 量。通过分析确定，本发明的鼠李聚糖硫酸酯是鼠李糖构成的长链多糖，同时 在鼠李糖基上连接着硫酸酯基，硫酸酯基的取代度为0.4~2，鼠李聚糖硫酸酯 的重均分子量为150000 400000道尔顿，分子式为(C6H704R2) n，结构式如
下所示
其中n=500 1800, R=H或SCV。
下面是鼠李聚糖硫酸酯的抗凝血作用和抗栓作用评价结果。
鼠李聚糖硫酸酯的抗凝血作用是通过活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间 和凝血酶原时间进行评价的，鼠李聚糖硫酸酯的抗栓作用是通过对大鼠体内、 体外试验性血栓形成的影响进行评价的。
1.鼠李聚糖硫酸酯对活化部分凝血活酶时间的影响取健康人静脉血，置于 含有1/10(血液与抗凝剂体积比为9: l)体积重量百分浓度为3.3%的枸橼
酸钠抗凝液的塑料管中，轻轻颠倒混匀，以3000转/分钟离心15min，收 集上层血浆，备用。取待测血浆卯pL，分别加入5， 15， 50， 100， 200， 300， 500吗/mL的鼠李聚糖硫酸酯水溶液10iiL， 37。C孵育lmin，加入活 化部分凝血活酶时间试剂100|iL, 37。C孵育2 min，加入37。C预热 0.025mol/L CaCb溶液100pL，记录凝固时间，即为活化部分凝血活酶时 间值。对照组加入生理盐水l(VL，按上述方法测定活化部分凝血活酶时 间值。实验结果表明，鼠李聚糖硫酸酯可明显延长活化部分凝血活酶活化 时间，与对照组比较有显著性差异(PO.OOl)，表明鼠李聚糖硫酸酯能抑制 内源性凝血途径或共有凝血途径。不同浓度鼠李聚糖硫酸酯对活化部分凝 血活酶时间的影响表现为浓度愈大，凝固时间愈长，表明鼠李聚糖硫酸酯 的抗凝作用与浓度呈线性关系，
2. 鼠李聚糖硫酸酯对凝血酶时间的影响血浆的分离如上所述。取待测血浆 90nL,分别加入5， 15， 50， 100， 200， 300， 500(ig/mL的鼠李聚糖硫酸 酯水溶液10(aL，37。C孵育lmin，加入37。C预热凝凝血酶时间试剂200 pL， 记录凝固时间，即为凝血酶时间值。对照组加入生理盐水10pL，按上述 方法测定凝血酶时间值。实验结果表明，鼠李聚糖硫酸酯可明显延长血浆 凝血酶时间，与对照组比较有显著性差异(PO.OOl)，说明鼠李聚糖硫酸酯 能抑制凝血酶活性或抑制纤维蛋白原转化为纤维蛋白。不同浓度鼠李聚糖 硫酸酯对凝血酶时间的影响表现为浓度愈大，凝固时间愈长，表明鼠李聚 糖硫酸酯的抗凝作用与浓度呈线性关系。
3. 鼠李聚糖硫酸酯对凝血酶原时间的影响血浆的分离如上所述。取待测血 浆90pL,分别加入5， 15， 50， 100， 200， 300， 500吗/mL的鼠李聚糖硫
酸酯水溶液10pL， 37。C孵育lmiii，加入37。C预热凝血酶原时间试剂200 (iL，记录凝固时间，即为凝血酶原时间值。对照组加入生理盐水lO(iL， 按上述方法测定凝血酶原时间值。实验结果表明，鼠李聚糖硫酸酯对血浆 凝血酶原时间影响不明显，与对照组比较无显著性差异(PX).05)，表明鼠
李聚糖硫酸酯对外源性凝血途径没有影响。
4. 鼠李聚糖硫酸酯对大鼠体内试验性血栓形成的影响取体重200~250克的 健康雄性Wistar大鼠，随机分为生理盐水组、16mg/kg鼠李聚糖硫酸酯 组、8mg/kg鼠李聚糖硫酸酯组、4mg/kg鼠李聚糖硫酸酯组和4mg/kg肝 素组，每日分早晚2次灌胃，每次灌胃0.4mL，生理盐水组灌以生理盐水 0.4mL。于第11天按每日总量灌胃后20分钟，用戊巴比妥钠腹腔注射麻 醉大鼠(40mg/kg)，剥离右侧颈总动脉15mm长，用体内血栓形成仪的 刺激电极将动脉近心端轻轻挑起，用测温探头挑起动脉远心端。药后30 分钟用1.6mA直流电流持续刺激7分钟，当动脉内因血栓形成阻塞血流 时，血管表面温度突降。从刺激开始到温度突降所需时间称阻塞时间 (Ocelusiontime,简称OT)，以OT长短作为药效指标。各组实验数据以均 数加减标准差表示，进行统计学处理，组间差异的显著性检验用t检验。 实验结果表明，鼠李聚糖硫酸酯有明显的抗动脉血栓作用，剂量增加则作 用增强，而且鼠李聚糖硫酸酯比肝素有明显抗动脉血栓作用(P<0.001)。
5. 鼠李聚糖硫酸酯对大鼠体外试验性血栓形成的影响药物分组对照组(生 理盐水组)、8mg/kg鼠李聚糖硫酸酯组、4mg/kg鼠李聚糖硫酸酯组、2 mg/kg鼠李聚糖硫酸酯组和2 mg/kg肝素组。取健康雄性Wistar大鼠，以 戊巴比妥钠静脉麻醉大鼠(40 mg/kg)，分离颈总动脉，以干燥的玻璃 射器自颈总动脉取血2mL，均分于两个硅化聚乙烯管环内，血液在37。C 环境中，以17转Z分钟转动30分钟后停止，按拉丁方设计的给药顺序分 别向每根管环的两端各加药O.lmL，转动60分钟，自聚乙烯管环内倾出 血栓，立即称重，测量血栓长度，置6(TC恒温干燥箱中烘干，并称其干 重，按上述步骤再取血做其余四组，然后再取5只大鼠重复上述实验，按 以下公式计算各药物组的溶栓率。各组实验数据以均数加减标准差表示， 进行统计学处理，组间差异的显著性检验用t检验。
对照组血栓湿重一给药组血栓湿重 溶栓率(％) = -^- x 100%
对照组血栓湿重
实验结果表明，8mg/kg鼠李聚糖硫酸酯、4mg/kg鼠李聚糖硫酸酯组和2 mg/kg鼠李聚糖硫酸酯组湿重、干重及长度与生理盐水组比较均明显减小
(PO.OOl)，表明鼠李聚糖硫酸酯具有体外溶栓作用，而且8mg/kg鼠李聚 糖硫酸酯组和4 mg/kg鼠李聚糖硫酸酯组比2 mg/kg肝素组有明显溶栓作用
(P<G.001)，肝素组与生理盐水组比较，血栓湿重、干重及长度均无明显差 别(P〉0.05)。
权利要求
1.一种鼠李聚糖硫酸酯，其特征在于该鼠李聚糖硫酸酯是鼠李糖构成的长链多糖，同时在鼠李糖基上连接着硫酸酯基，硫酸酯基的取代度为0.4～2，鼠李聚糖硫酸酯的重均分子量为150000～400000道尔顿，分子式为(C6H7O4R2)n，结构式如下所示其中n＝500～1800，R＝H或SO3-。
2. 权利要求1所述的鼠李聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于将海藻藻 体加水浸泡匀浆，室温提取，分离出沉淀物，再向沉淀物加水，加热提 取，分离出清液，将所得清液浓縮，脱盐，再将脱盐后的溶液浓縮，然 后依次通过离子交换色谱柱分离、凝胶色谱柱分离，将得到的多糖溶液 浓縮，干燥。
3. 权利要求1所述的鼠李聚糖硫酸酯在制备抗凝血药物或抗栓药物中的 应用。
4. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的海藻藻体为礁膜、 宽礁膜、袋礁膜、囊礁膜、北极礁膜、破礁膜、厚礁膜、皱礁膜、褐色 礁膜、尖种礁膜、孔石莼、石药、长石莼、硬石莼或花石莼。
5. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的海藻藻体加水浸泡 匀浆为将海藻藻体直接浸泡于水中然后匀浆，或将海藻碾碎、切细、剁 碎、研磨或绞碎后与水混合形成海藻匀浆，或将海藻加工成干燥粉末与 水混合形成海藻匀浆。
6. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的离子交换色谱柱分离为用色谱柱Q-Sepharose Fast Flow、 DEAE Sepharose、 DEAE Cellulose、 DEAE Sephadex、 Q-Sepharose XL、 Q Sepharose、 Q Sepharose 4FastFlow、 QAE Sephadex或Dowex分离，所用的洗脱液为水溶液、 0.01~5.0 mol/L氯化钠水溶液或0.01~5.0 mol/L氯化钾水溶液。 7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的凝胶色谱柱分离为 用色谱柱Sephacryal S-400 HR、 Sephacryal S-300 HR、 Sephacryal S-200 HR、 Sephacryal S-100 HR、 Sephacryal S-500 HR、S印hacryal S-1000 SF、 Toyopearl HW-65、 Superdex 200、 Superose 6、 Superose 12、 Sepharose 6 Fast Flow、 Sepharose 4 Fast Flow、 Sepharose 2B、 Sepharose 4B、 Sepharose 6B、 Sepharose CL-2B、 Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B 分离，所用的洗脱液为水溶液、0.01~1.0mol/L醋酸钠水溶液、 0.01 1.0mol/L氯化钠水溶液、0.01~1.0mol/L氯化钾水溶液或 0.01~1.0mol/L碳酸氢铵水溶液。
全文摘要
一种鼠李聚糖硫酸酯，其特征在于该鼠李聚糖硫酸酯是鼠李糖构成的长链硫酸多糖，分子式为(C₆H₇O₄R₂)_n，制备时将海藻藻体加水浸泡匀浆，室温提取，分离出沉淀物，再向沉淀物加水，加热提取，分离出清液，将所得清液浓缩，脱盐，再将脱盐后的溶液浓缩，然后依次通过离子交换色谱柱分离、凝胶色谱柱分离，将得到的多糖溶液浓缩，干燥。本发明的鼠李聚糖硫酸酯是一种具有强聚阴离子性质的硫酸多糖类化合物，可用于制备一种新型的抗凝血药物或抗栓药物，具有良好的市场应用前景。
文档编号A61P7/02GK101104650SQ20071001632
公开日2008年1月16日 申请日期2007年7月23日 优先权日2007年7月23日
发明者毛文君 申请人:中国海洋大学