专利名称：：似vbnc的可培养乳酸杆菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种活的细菌存在形式，确切地说是似活的非可培养状态的可培养乳酸杆菌。
背景技术：
：众所周知，目前普遍使用的动物微生态活菌制剂主要是以乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等多种益生菌研制的，其中应用最广泛、种类最多的是以乳酸杆菌为主的活菌制剂。但由于乳酸杆菌不耐热，经受不住饲料制粒与膨化过程中高温高压的破坏作用，因而许多专家极力建议应直接饲喂。然而，用于直接饲喂的活菌制剂产品最重要的标志是活菌数量，规定合格产品中的活菌数应达到IO9CFU/g，因而有效活菌数的多少和保存期的长短就成了产品货架寿命的关键指标。当前市售的该类产品主要用冻干技术保持活菌活力，但生产成本较高。一般含有IO9个活菌数的冻干粉价格约1000元/Kg，而含有101°个活菌数的价格则为两倍。尽管采用稳定化、微胶囊化及包膜等先进工艺替代，也克服不了高成本、繁制备等缺点。由此反映出动物微生态产业中存在的主要问题，一是基础研究问题，主要涉及微生物菌种的筛选与鉴定；二是产业化问题，主要涉及产品的制剂技术。而其核心问题只有一个，即保持微生物活性、提高微生物活力、延长微生物保存。自1982年细菌活的非可培养状态(viablebutnoncultutable,VBNC)发现以来，独特的生物学特征不仅让更多的人认识到VBNC病菌的巨大危害，同时也会让研究者看到VBNC益生菌的实际应用价值，即VBNC益生菌可由寡营养、低温等不利条件诱导，可以相当长时间内保留原菌生物学特征。尽管丧失了平板上生长繁殖能力，但却可以长久存活。此状态下的细菌均可启动全部促进生存和抵御不良环境的基因群，就是这些基因群的表达产物维持着菌体活性。摆在现阶段的一个瓶颈问题是VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，极易在研究过程中突然消失，使细菌转入真正死亡期，而且进入VBNC状态的细菌常规的培养方法不可培养。只有采用特殊的方法复苏后，才可培养。
发明内容本发明的目的是为解决VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，极易在研究过程中突然消失，保存期短的问题，而提供一种耐寡营养、低温等不利条件，进入VBNC状态后，用常规的培养方法既可培养的，能稳定繁殖遗传的VBNC细菌突变体，似活的非可培养状态的可培养乳酸杆菌。似VBNC的可培养乳酸杆菌，保藏编号为CGMCCNo.6579。所述的VBNC的可培养乳酸杆菌，是从自然发酵酸牛奶中分离出来的植物乳酸杆菌LactobaciIlusplantarum,似VBNC的可培养乳酸杆菌的鉴定方法，用常规的方法诱导乳酸杆菌进入VBNC状态，可培养的即为似VBNC的可培养乳酸杆菌；所述的可培养是不经过VBNC的复苏，用常规方法既可培养。似VBNC的可培养乳酸杆菌作为VBNC细菌模型用于研究VBNC细菌的应用。细菌VBNC状态是指细菌在不良环境中，细胞缩成球形，用常规方法(平板法、最大可能近似值法)培养时，不能生长繁殖，但仍然是活的细菌的特殊存在形式。不可培养是指用常规的方法不可培养；可培养是指用常规的方法既可培养。目前将正常的细菌经过诱导进入VBNC状态，及检测其是否进入VBNC状态的技术手段已经很成熟，寡营养、低温等不利条件均能诱导细菌进入VBNC状态。细菌活的非可培养状态(ViablebutNon-culturable,VBNC)的复苏是指将不能培养的细菌恢复为可培养状态的过程，国内外用于VBNC沙门氏菌复苏的方法主要源自于Reissbrodt等人在2002年发表在AppliedandEnvironmentalMicrobiology刊物上的一篇题为((ResuscitationofSalmonellaentericaSerovarTyphimuriumandEnterohemorrhagicEscherichiacolifromtheViablebutNonculturableStatebyHeat-StableEnterobacterialAutoinducer》的文章。文中提及的VBNC沙门氏菌复苏所需主要材料为含有30%牛血清和50ymol/L去甲肾上腺素的SAPI培养基，其中SAPI培养基成份较为复杂。通过此法可以使维持VBNC长达I年的细菌恢复为可培养状态。本发明人多年从事VBNC细菌的研究，新近研究发现了又一种活的细菌存在形式，有些VBNC细菌突变体，在进入VBNC状态后，具备了VBNC细菌相关基因，不经过细菌活的非可培养状态(ViablebutNon-culturable,VBNC)的复苏，用常规方法培养，即可培养。这些突变体与VBNC细菌具有相同的特征，但又有别于VBNC细菌，命名为似VBNC的可培养细菌。获得了多株VBNC细菌突变体，其中植物乳杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的VBNC细菌突变体于2012年9月18日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。弥补了VBNC细菌不能生长繁殖和无法保存的缺憾，在不良环境中能持续存活的“菌种”。解决了微生态制剂产业中存在的核心问题。在作为VBNC细菌模型用于研究VBNC细菌，研究VBNC的发生机制，及以乳酸菌为载体，研制口服疫苗等方面，本研究对乳酸杆菌实施化学诱变，经VBNC诱导条件筛选，以及AFLP鉴定后获得VBNC乳酸杆菌突变体，并对VBNC乳酸杆菌及其突变体对断奶仔猪的免疫学活性进行测定，从而为进一步研制新型猪用微生态制剂奠定基础。图1选择性扩增产物PAGE检测，M:分子量标记；1:阴性对照；2:乳酸杆菌；3:似VBNC的可培养乳酸杆菌；图2早期断奶仔猪平均体重变化；图3不同时期内断奶仔猪血清中IL-1O含量；图4不同时期内各组断奶仔猪血清中TNF-α含量。具体实施方式实施例1植物乳酸杆菌化学诱变乳酸杆菌(L)是吉林农业大学预防兽医学实验室从自然发酵酸牛奶中分离，经16sRNA鉴定为植物乳酸杆菌plantarum)0由吉林农业大学预防兽医学实验室保存。I)似活的非可培养状态的可培养乳杆菌MVR株的获得。实验组取5XIO8个/ml的乳酸杆菌(L)菌体悬浮液lml，加入100μINTG(lmg/ml)，充分混合后，在30°C条件下作用30min，反应结束后用O.1M磷酸缓冲液[pH7.O]终止反应，NTG用量以致死率达到80%95%为宜。对照组未经NTG处理的乳酸杆菌(L)悬浮液。实验组、对照组的菌液进行10倍稀释，涂布于MRS固体培养基中，37°C培养。将单菌落接种到100ml的液体MRS中，振荡培养至0D_接近O.8时，取Iml菌液至pH2.O3.0，MRS液体培养基中，4°C兼性厌氧培养。在VBNC诱导过程中，取经NTG和未经NTG处理的菌液涂布于固体MRS中，37°C培养，未经NTG处理的乳酸杆菌作为对照组在35d内可培养菌数显著下降，连续培养3d，无细菌生长，按专利200810051106.9提供方法检测，即取待检菌液50μ1，加入SYT09和PI各25μ1，吹吸混匀，避光染色1520min。然后将经墨水染黑的微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片上，吸取适量菌体滴在微孔滤膜上，待液体刚好被滤膜吸干时，在其上盖上盖玻片，并用力压片，使细菌充分固定在膜上。最后在盖玻片上滴一滴无自发荧光的油，用落射荧光显微镜于暗室观察。而荧光显微镜观察全部为呈现绿色荧光的活菌，表明对照组已于第35d进入VBNC状态。而经NTG处理的实验组的可培养菌数在整个观察期内一直具备可培养能力。采用AFLP法，对实验组、对照组的基因组DNA，用MseI和EcoRI两种酶对对基因组DNA进行酶切，酶切产物与接头连接后，依次进行预扩增和选择性扩增。选择性扩增的模板是预扩增产物，在扩增前要对预扩增产物做20倍稀释，最后选择性扩增产物用8%中性聚丙烯酰胺凝胶EB染色检测。图1可见每条泳道上随机分布的清晰条带，而且条带数目适中，谱带质量较高，产物多集中在50bp750bp。而且实验组与对照组间存在多条差异条带，说明两者基因组DNA存在多态性。由此证明乳酸杆菌在NTG诱变后，其基因组发生了突变。实验组中获得经NTG处理的VBNC乳酸杆菌突变体，命名为似活的非可培养状态可培养乳杆菌MVR株，已于2012年9月18日，送至中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.6579ο实施例2饲喂似活的非可培养状态可培养乳酸杆菌MVR株，对断奶仔猪的影响试验动物分组将断奶仔猪随机分为1、2、3、4四组。其中，I组饲喂VBNC乳酸杆菌突变体，2组饲喂VBNC乳酸杆菌，3组饲喂乳酸杆菌，4组为空白对照。I3组按每克饲料中含IO9个CFU活菌数的标准添加至饲料中，采取分圈和自由采食的方式饲养。每天饲喂3次，试验周期为7d。饲养7d后，停止饲喂各实验菌株，仍按每克饲料中含IO9个CFU活菌数的标准加入大肠杆菌，每天观察各组腹泻情况。出现腹泻后次日，按上述设计继续饲喂7d。在整个试验周期内，每隔2d早晨空腹称重，以每个重复为单位，计算各组平均日增重(ADG)，同时每天观察仔猪的精神状态、腹泻等情况。DVBNC乳酸菌及其突变体对断奶仔猪生长性能的影响将12只断奶仔猪随机分组后于第2d开始称重，动物体重总体呈增长趋势，但3，4组在第18d体重下降。图2显示，第I组仔猪平均体重高于其它3组，特别是在第6d后体重迅速增加。而且在第7d攻入大肠杆菌后，4个组的体重仍在增长，其中I组体重增长率最高。通过对动物精神状态及腹泻等情况观察，I组动物活泼好动，腹泻于第12d最晚出现，而且只表现为轻度；2组于第IOd出现腹泻，为轻度；3、4组均于第9d出现重度腹泻。上述结果表明，VBNC乳酸杆菌突变体对攻菌前动物机体有一定的调节效果。当腹泻后再次饲喂不同处理的乳酸杆菌时，1，2组动物体重略有增长，但3，4组却在调整后期出现体重下降情况，这可能因腹泻导致食欲下降有关。但从整体动物体重变化情况看，只有I组与对照组相比差异显著0°〈0.05)，表明应用VBNC乳酸杆菌突变体，即似活的非可培养状态的可培养乳杆菌MVR株，可明显促进断奶仔猪增重。2)VBNC乳酸菌及其突变体对断奶仔猪外周血淋巴细胞转化率的影响外周血淋巴细胞转化率测定仔猪前腔静脉无菌采血，肝素钠抗凝。用淋巴细胞分离液小心将淋巴细胞提取出来。用含10%小牛血清的1640培养液调整细胞浓度为5XIO5个/ml，然后加入96孔细胞培养板中，细胞悬液分装3n个孔，200μI/孔，其中3(η_1)个孔加入不同浓度的ConA(5μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、200μg/ml),另3个孔不加ConA作为对照。置5%0)2，371培养48117211，于培养结束前411611在各孔内加入1(^1MTT(5mg/ml)，37°C培养4h6h，立即测定无需终止反应，最后用酶标仪测定570nm下的OD值，并根据OD值计算刺激指数(SI)。实验设立了5组ConA浓度(5μg/ml、10μg/ml、100μg/ml>200μg/ml),并同时对仔猪外周血淋巴细胞进行刺激。由表2可知，组别的F=7.685，P=Q.04<0.05，差异显著；而ConA浓度的F=14.015，P=Q.00<0.01，差异极显著。说明不同组别和不同ConA浓度对淋巴细胞的增殖均存在显著影响，有必要进一步对组别及ConA浓度两因素不同水平的均值进行多重比较。而校正模型对应的F=Il.302,/^=0.00<0.01，表明所用分析模型有统计学意义。因而由表3可知，I组与4组间差异极显著0°〈0.01)，而与3组差异显著(7X0.05)。另外，2组与4组亦存在显著差异G°〈0.05)。上述结果表明，饲喂VBNC乳酸杆菌突变体和VBNC乳酸杆菌的仔猪淋巴细胞转化率高，均比正常机体获得了较高的细胞免疫能力，两者均对断奶仔猪免疫机能具有促进作用。当ConA浓度达到200μg/ml时,对每组淋巴细胞转化的影响极显著0°〈0.01)，故而此浓度即为最适浓度，可以用于断奶仔猪的淋巴细胞转化试验中。3)VBNC乳酸菌及其突变体对断奶仔猪外周血细胞因子浓度的影响外周血中细胞因子浓度监测采集第一次饲喂期、`攻菌期、腹泻期，以及第二次饲喂期的猪血，分离血清。用ELISA方法检测血清中TNF-α、IL-10等细胞因子的含量，具体操作严格按说明书进行，每个样品做2个复孔。按绘制的标准曲线，换算出各样品中相应细胞因子的浓度。经单因素ANOVA方差分析，4个组动物体内的IL-10含量在不同时期内均不存在显著差异0°>0.05)，尽管在机体遭受外来抗原时，各组IL-10含量有所起伏，但对整体免疫机能的影响不显著(图3)，这说明不同处理的乳酸杆菌均未能通过刺激机体产生抗炎因子IL-10的方式来提高免疫机能。而从TNF-α含量及变化却明显看出(图4)，I组的TNF-a量始终低于对照组(4组)，特别是在病原感染时，与对照组存显著差异(/X0.05)，说明VBNC乳酸杆菌突变体能够有效抑制机体产生肿瘤坏死因子，降低了机体遭遇炎症的风险，因为TNF-α是一种致炎性细胞因子。2组的TNF-a量除在第一次饲喂期内其含量与对照组持平外，在其它3个时期内均低于对照组，特别是在腹泻期与第二次饲喂期内，显著低于对照组(/X0.05)，说明VBNC乳酸菌同样具有抑制肿瘤坏死因子产生的作用，但它可以保护整个机体免遭炎性的效果尚需经过长期多次饲喂才能显现出来。相比之下，3组的TNF-a含量与对照组无显著差别，说明未经任何处理的乳酸杆菌抑制机体炎性反应的作用不显著。所有数据的统计分析采用SPSS18.0统计软件，两组间比较采用独立样本T检验，多组之间的比较采用单因数方差分析。显著性差异水平为P<O.05，极显著性差异水平为P<O.01。综合以上分析结果可知，VBNC乳酸杆菌及其突变体可有效促进机体淋巴细胞转化，抑制肿瘤坏死因子，降低炎性反应，具有免疫调节作用。权利要求1.似VBNC的可培养乳酸杆菌，保藏编号为CGMCCNo.6579。2.根据权利要求1所述的似VBNC的可培养乳酸杆菌，是从自然发酵酸牛奶中分离出来的植物乳酸杆菌。3.似VBNC的可培养乳酸杆菌的鉴定方法，用常规的方法诱导乳酸杆菌进入VBNC状态，可培养的即为似VBNC的可培养乳酸杆菌；所述的可培养是不经过VBNC的复苏，用常规方法既可培养。4.权利要求1所述的似VBNC的可培养乳酸杆菌作为VBNC细菌模型用于研究VBNC细菌的应用。全文摘要本发明公开了似VBNC的可培养乳酸杆菌，是新近研究发现的又一种活的细菌存在形式，是VBNC细菌突变体，在进入VBNC状态后，具备了VBNC细菌相关基因，不经过细菌活的非可培养状态的复苏方法复苏，用常规方法就可培养。其中植物乳杆菌的VBNC细菌突变体于2012年9月18日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。弥补了VBNC细菌不能生长繁殖和无法保存的缺憾；作为VBNC细菌模型用于研究VBNC的发生机制，及以乳酸菌为载体、研制口服疫苗等方面具有广阔的前景，并对VBNC乳酸杆菌及其突变体对断奶仔猪的免疫学活性进行测定，从而为进一步研制新型猪用微生态制剂奠定基础。文档编号C12N1/20GK103031259SQ20121040381公开日2013年4月10日申请日期2012年10月22日优先权日2012年10月22日发明者李影,钱爱东,段锐,段冶,王立新,张宇申请人:吉林农业大学