专利名称：修饰的dna切割酶和其应用方法
背景技术：
在两个不同的二聚体DNA上的序列之间的重组，或者在同一DNA二聚体上被间插序列隔开的序列之间的重组，发生在所有能够自我复制的细胞中。DNA中的四方向霍利迪连接体(Four-way Holliday junction)是重组反应的一个特征，并且在同源重组以及位点专一性重组反应中产生(Lilley，D.M.J.PNAS 94，9513-9515(1997))。重组的倒数第二个阶段涉及利用催化作用分解四方向连接体。该催化作用是通过称为解离酶的结构特异性核酸酶来完成(Aravind，L.，et al.Nuc.Acid Res.283417-3432(2000))。解离酶在细胞中广泛存在，而且也被病毒表达。解离酶具有多种特性。许多解离酶的晶体结构已被报道，包括T7内切核酸酶I(T7Endo I)的晶体结构(Hadden，J.M.，et al.Nat.Struct.Biol.862-67(2001))。T7 Endo I具有两个催化中心，它们以这样的方式并置能够防止该酶与常规的线性DNA形成过度效力的复合体，但是使得该酶能够特异性地结合并切割分支的、受扰的或柔性的DNA。T7 Endo I的三维结构显示，两个催化结构域被很好地隔开，仅通过β-片桥连接(Hadden，J.M.，et al.Nat.Struct.Biol.862-67(2001))。该桥形成伸展且紧紧联合的反向平行β片层的一部分(β2)。T7 Endo I是149个氨基酸亚基的稳定的同型二聚体(Parkinson，M.J.andLilley，D.M.J.J.Mol.Boil.270169-178(1997))。它为强碱性(pI计算值9.5)，并以二聚体形式紧紧结合(Kd 2nM)于四方向连接体。通过同时在两条连续链上靠近交叉点5’端的位置引入切刻，T7 Endo I分解四方向连接体(Déclais，A.，et al.EMBO J.221398-1409(2003))。该结构分析显示，T7 Endo I形成紧密联系的对称的同型二聚体，包括由桥连接的两个催化结构域。每一催化结构域由一个亚基的残基17-44和另一亚基的残基50-145组成。包括T7 Endo I在内的解离酶是结构特异性的内切核酸酶，能够切割宽范围的具有各种结构诸如分支结构和单个碱基错配的异源二聚体的DNA分子(Mashal，R.D.，et al.Nat.Genet.9177-183(1995))。这种宽泛的底物特异性使得难以鉴定酶选择性识别和切割的底物的共同结构特征(White，M.F.，et al.J.Mol.Biol 269647-664(1997))。这种宽泛的底物特异性也导致解离酶在宿主细胞中产生毒性。值得去做的是，减少具有与T7 Endo I类似结构的酶的毒性，从而利于它们大量产生，用作分子生物学中的试剂。同样值得去做的是，选择性地促进特异酶活性。
发明概述本发明的实施方案提供了修饰的DNA切割酶，该酶具有与T7 Endo I至少35％的氨基酸序列同一性，被β桥隔开的两个催化中心，和β桥中的至少一个氨基酸的突变，所述突变具有改变切割活性的效果。在本发明的实施方案中，该修饰的DNA切割酶的一个特点是在宿主细胞中具有减少的毒性，从而允许该DNA切割酶大量表达。在本发明的其他实施方案中，该修饰的DNA切割酶能够进行下述反应中的至少一个切割DNA中的十字形结构；在错配碱基对的侧翼位点切割DNA；以非序列专一性的方式切割DNA；以非序列依赖性的方式产生切刻；在预先存在的切刻位置对面产生切刻。在DNA双链体的两条链上的切割产生少于11个核苷酸的单链突出端。与未修饰的酶相比，在某些实施方案中，该修饰的酶的改变的酶切割活性可以包括拓宽的酶特异性。例如，对于在β-桥中具有突变的酶，在识别到含有A、T、G或C碱基中的任何碱基的错配之后，DNA切割活性可以发生在双链体中错配侧翼的位置。在本发明的另一实施方案中，相比未修饰的酶，该修饰的酶的酶切割活性的改变发生在含锰缓冲液中。例如，切割活性的变化可以是下列之一切割活性的维持；非特异性核酸酶活性的降低；在预先存在的切刻位置对面的切刻产生活性的增强，以及产生切刻和双链切割之比降低。在本发明的另一实施方案中，相比未修饰的酶，该修饰的酶的酶切割活性的改变发生在含镁缓冲液中。因而，观察到的改变的酶活性选自在DNA的十字形结构中产生切刻相对于双链切割的比率增加；切割的十字形DNA与非切割DNA之比增加；非特异性核酸酶活性的比率降低；和在预先存在的切刻位置对面的切刻产生减少。通过修改反应条件，该修饰的酶的改变的酶活性可以是增强的活性或降低的活性。例如，修改的反应条件可以通过变化下列中的至少之一来获得pH、温度、将锰离子加入到含镁缓冲液中或相反、或改变反应混合物中的镁或锰离子的浓度；和反应物的温育时间。在本发明的实施方案中，DNA切割酶选自基因3(肠细菌噬菌体T7)、T7脱氧核糖核酸内切酶I、鼠疫杆菌(Yersinia pestis)噬菌体phiA1122内切核酸酶、噬菌体Phi Ye03-12内切核酸酶、噬菌体T3内切核酸酶、噬菌体T3脱氧核糖核酸内切酶、假单胞菌噬菌体gh-1内切核酸酶、恶臭假单胞菌(psuedomonas putida)KT2440脱氧核糖核酸内切酶I；和玫瑰噬菌体(Roseophage)S101 RP内切核酸酶I。在本发明的实施方案中，修饰的酶在β-桥中的PA位置处具有突变。例如，该突变可以是剔除(ΔPA(其中(Δ)对应于″剔除″)，或PA的置换诸如单个氨基酸、二肽、三肽或四肽置换。置换的例子包括PA/A、PA/AA、PA/PGA、PA/PAPA、PA/K、PA/G、PA/D和PA/P(其中PA/A对应于用A氨基酸置换(/)PA二肽)。在本发明的实施方案中，PA二肽位于SEQ ID.No.12中的位置46和47。在本发明的实施方案中，提供了包括基本上与SEQ ID NO1对应的DNA序列的核酸，其中至少一个突变已被引入对应于β-桥的核苷酸序列中。例如，该突变被包括在编码β-桥中的PA的位点。在该例子中，在编码PA的位点的突变可以是任何置换或剔除，这样，置换的核酸可以编码单个氨基酸、二肽、三肽和四肽。在进一步的例子中，所述至少一个突变导致选自PA/A、PA/AA、PA/PGA、PA/PAPA、ΔPA、PA/K、PA/G、PA/D和PA/P的氨基酸变化。在本发明的实施方案中，提供了包含上述任何例子中的核酸的载体。此外，提供了含有包含上述核酸的任何载体的宿主细胞。在本发明进一步的实施方案中，提供了含有下列中的至少一种的试剂盒如上所述的突变已被引入β-桥的DNA切割酶、编码该酶的核酸、包含该核酸的载体、或含有上述载体的宿主细胞。在本发明进一步的实施方案中，提供了修饰酶催化活性的方法，该方法包括选择具有由β-桥连接的两个催化中心的酶，所述催化中心位于该酶中的交互立体几何(reciprocal stereo-geometric)位置；通过将突变引入β-桥，改变这两个催化中心的交互立体几何位置。在本发明进一步的实施方案中，提供了测定DNA底物是否具有单核苷酸多态性(SNP)的方法。该方法包括步骤将所述DNA底物与上述修饰的DNA切割酶接触；和由切割产物确定所述DNA底物是否具有SNP。该方法还可以包括鉴定哪一个核苷酸形成SNP和鉴定该SNP的位置(例如参见图11)。在本发明进一步的实施方案中，提供了构建鸟枪克隆文库的方法，该方法包括步骤(a)将上述修饰的DNA切割酶与DNA温育，形成该DNA的可被连接的非序列特异性切割片段；所述可被连接的DNA能够被插入用于在宿主细胞中进行克隆的载体；和(b)构成该鸟枪克隆文库。在本发明进一步的实施方案中，提供了对DNA中的切刻进行作图的方法，该方法具有下述步骤(a)将上述酶与所述DNA在含锰缓冲液中接触；(b)允许在预先存在的切刻位置对面产生切刻，从而形成具有单链突出端的双链DNA；和(c)对DNA中的切刻作图。在本发明进一步的实施方案中，提供了过量表达T7内切核酸酶1的方法，该方法包括选择上述的宿主细胞和过量表达该T7内切核酸酶1。
在下面的附图描述中，除非另外指出，“缓冲液”指标准缓冲液，Mn2+或Mg2+缓冲液指加入2mM的该金属盐的标准缓冲液。
图1显示了未修饰的MBP-T7 Endo I(ME)蛋白融合物的表达和纯化的SDS-PAGE分析。
含有pME、pME(PA/A)和pME(ΔPA)的ER2566的培养物在37℃生长至对数中期，然后用0.5mM IPTG在30℃诱导5小时。通过离心收获诱导的细胞，将其悬浮在标准缓冲液(20mM Tris pH 7.6，50mM NaCl和1mM EDTA)中，并通过超声波打碎细胞。离心除去细胞残骸后，将粗细胞提取物应用到直链淀粉柱上。在粗提取物流过柱子后，将柱子用缓冲液充分洗涤。用含有10mM麦芽糖的缓冲液洗脱融合蛋白。在10-20％梯度凝胶上进行SDS-PAGE。每一个泳道应用了诱导的培养物的30μl样品。
泳道标记如下C，粗细胞提取物；F，流出级分；和E，麦芽糖洗脱级分。
图2显示了通过滴定分析测定的酶活性。将在20μl的2mM MgCl2或者2mMMnCl2标准缓冲液中的1μg的pUC(AT)与变化数量的酶在37℃温育30分钟。在冰上加入DNA样品缓冲液，终止反应。在带有溴化乙锭的1.2％琼脂糖凝胶上分析样品。
在所有的图中的泳道分配如下泳道1，无酶；泳道2，5ng酶；泳道3，2.5ng酶；泳道4，1.25ng酶；泳道5，0.63ng酶；泳道6，0.32ng酶各图是图a1显示的是ME(WT)，在Mg2+缓冲液中图a2显示的是ME(WT)，在Mn2+缓冲液中图b1显示的是ME(PA/A)，在Mg2+缓冲液中图b2显示的是ME(PA/A)，在Mn2+缓冲液中图c1显示的是ME(ΔPA)，在Mg2+缓冲液中图c2显示的是ME(ΔPA)，在Mn2+缓冲液中。
图3显示了在两步反应中，ME(ΔPA)对pUC(AT)的切割。
在图a中，将pUC(AT)与该酶(DNA/酶1μg/1.5ng)在37℃，在Mg2+标准缓冲液中温育。在不同的时间点，取出等份样品，并与DNA样品缓冲液在冰上混合。在带有溴化乙锭的1.2％琼脂糖凝胶上分析收集到的样品。
在图b中，除了DNA/酶为1μg/0.5μg外，实验按照在图a中的那样进行。
图4显示了通过凝胶电泳测定的非特异性核酸酶活性。将1μg的λDNA与变化数量的酶在20μl的Mg2+或Mn2+缓冲液中，在37℃温育30分钟。通过加入DNA样品缓冲液终止反应，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。
泳道泳道1，未加入酶；泳道2，具有3ng的酶；泳道3，16ng；4，80ng；5，400ng在图a1中，ME，在Mg2+缓冲液中。
在图a2中，ME，在Mn2+缓冲液中。
在图b1中，ME(PA/A)，在Mg2+缓冲液中。
在图b2中，ME(PA/A)，在Mn2+缓冲液中。
在图c1中，ME(ΔPA)，在Mg2+缓冲液中。
在图c2中，ME(ΔPA)，在Mn2+缓冲液中。
图5显示了DNA切割酶的切刻位点切割活性的测定。
图5A显示了具有切刻位点和限制性位点的pNBI质粒。该质粒用N.BstNB1产生切刻，然后用BsaHI消化以产生含有切刻的线性双链分子。
图5B显示了不同的酶混合物获得的凝胶电泳结果。
泳道1，pNB I DNA；泳道2，用N.BstNB I消化的pNB I；泳道3，用N.BstNB I消化，然后用BsaH I消化；泳道4，用N.BstNB I和BsaH I消化，然后用10ng的在Mg2+缓冲液中的ME，在37℃消化30分钟；泳道5，用BsaH I；泳道6，用BsaH I，然后用ME消化。
图6显示了在存在不同金属离子的条件下切刻位点切割的测定。将1μg制备的底物与变化数量的修饰的或未修饰的酶在37℃，在Mg2+或Mn2+缓冲液中温育30分钟。在琼脂糖凝胶上分析消化物。
所有的图中的泳道泳道1，无酶；泳道2，具有2.5ng酶；泳道3，5ng；泳道4，10ng；泳道5，20ng。
在图a1中，未修饰的酶ME(WT)，应用在Mg2+缓冲液中。
在图a2中，ME(WT)，在Mn2+缓冲液中。
在图b1中，ME(PA/A)，在Mg2+缓冲液中。
在图b2中，ME(PA/A)，在Mn2+缓冲液中。
在图c1中，ME(ΔPA)，在Mg2+缓冲液中。
在图c2中，ME(ΔPA)，在Mn2+缓冲液中。
图7显示了修饰型DNA切割酶在DNA切刻位点的切割型式的测定。示意性地描述了用于分析在切刻位点的切割型式的方法。
图8显示了使用杂合混合物作为底物，修饰的和未修饰的DNA切割酶在单碱基错配处的DNA切割的测定。将0.5μg的每一种杂合混合物底物与20-30ng的酶在20μl反应中，在37℃温育30分钟。在琼脂糖凝胶上分析消化物。
每个图中的泳道泳道C，PCR产物pcrAAT DNA或pcrACT作为对照；泳道1，hmAATxACT；泳道2，hmAATxAGT；泳道3，hmAATxATT；泳道4，hmACTxAGT；泳道5hmACTxATT；和泳道6，hmAGTxATT。
在图a1中，ME，在Mg2+缓冲液中。
在图a2中，ME，在Mn2+缓冲液中。
在图b1中，ME(PA/A)，在Mg2+缓冲液中。
在图b2中，ME(PA/A)，在Mn2+缓冲液中。
在图c1中，ME(ΔPA)，在Mg2+缓冲液中。
在图c2中，ME(ΔPA)，在Mn2+缓冲液中。
图9显示了用于测定在各种单碱基错配DNA上的酶活性的DNA底物是如何产生的。
图A示意性地描述了具有确定的单碱基错配的各种DNA异源双链体的制备。为了制备正链DNA，未磷酸化的正向引物pr-1和磷酸化的反向引物P-pr-2被用于PCR。利用λ核酸外切酶除去PCR产物的下链或负链。用与制备正链同样的方法制备负链DNA，不同的是使用了磷酸化的正向引物P-pr-1和未磷酸化的反向引物pr-2。
图B是通过将两条纯化的单链DNA退火而产生单碱基错配异源双链体的例子。
泳道1，由PCR产生的双链DNA，pcrAAT或pcrACT；
泳道2，分离自pcrACT的正(上)链ssACT(+)；
泳道3，分离自pcrAAT的负(下)链ssAAT(-)；
泳道4，通过将纯化的正链与负链退火产生的单碱基错配(C/T)异源双链体。
图10显示了修饰的或未修饰的DNA切割酶在各个单碱基错配处的DNA切割的测定。通过将4条分离的正链中的每一条与4条负链中的每一条退火，产生16种DNA双链体。在它们中，有4种是正常的(完全匹配的)双链体；12种是具有单碱基错配的异源双链体。将0.2-0.3μg制备的双链体DNA与10-15ng的酶，在10μl的Mg2+或Mn2+缓冲液中，在37℃温育20-30分钟。在琼脂糖凝胶上分析消化物。
在图a1和a2中，将不同的双链体与ME在Mn2+缓冲液中温育。
在图b1和b2中，它们与PA(PA/A)在Mn2+缓冲液中温育。
图11显示了修饰型DNA切割酶在碱基错配位点的切割型式的测定。
图11a是该实验的示意图。
图11b显示了在1.2％低熔点琼脂糖凝胶上分离的实验中间产物。
泳道1，熔化退火处理后的混合的开环质粒； 泳道2，用T4连接酶处理之后；
泳道3和4，用ME(PA/A)在Mn2+缓冲液中进行切割，然后用T4 DNA聚合酶补平末端之后。箭头指出了被切割并在连接之后用于转化的线性质粒条带。
图11C显示了对应于(a)和(b)的DNA序列。
图12显示了T7 Endo I和β桥的三维结构。同型二聚体显示在左边，一个单体以浅灰色表示，另一个以深灰色表示。在右边是β桥的细节，显示了在该研究中被突变的脯氨酸和丙氨酸残基的位置。用(b)标记的残基是指第二个单体(浅灰色)的残基。
图13显示了未修饰的T7 Endo I的DNA和氨基酸序列。
图14是来自噬菌体的与图13中的T7 Endo I序列具有至少35％氨基酸同一性的蛋白质序列。
图15是λ中的切割位点的图谱，其显示，用修饰型T7 Endo I产生的切刻是随机的。全长线性λ噬菌体DNA用含有PA至A序列修饰(ME[PA/A])的ME融合酶在存在2mM MnCl2的条件下消化。由该反应获得的DNA片段通过苯酚抽提和EtOH沉淀来纯化。重悬浮之后，DNA片段的末端用T4DNA聚合酶和dNTPs填满(12℃或室温，30分钟)。通过将该反应的等份样品加入到事先用EcoRV消化并用小牛肠磷酸酶(CIP)去磷酸化的凝胶纯化的Litmus 28，将平末端片段插入克隆载体Litmus28的EcoRV位点。将该连接混合物用于转化感受态大肠杆菌TB1细胞。从氨苄青霉素抗性转化子中纯化出DNA，并对插入物进行测序。对收回的序列进行检查，以定位载体-插入物连接点以及λDNA的正常情况下非连续的片段之间的连接点。针对完整的λDNA序列，对连接的端点进行作图。在这里显示了使用ME[PA/A]时切割位点在λ基因组上的分布，其中该分布是随机的。
发明详述
缩写MBP，麦芽糖结合蛋白；ME，麦芽糖结合蛋白-T7内切核酸酶1连接体；PCR，聚合酶链式反应；PAGE，聚丙烯酰胺凝胶电泳；MCS，多克隆位点；dNTP，脱氧核糖核苷三磷酸；ATP，三磷酸腺苷；SNP，单核苷酸多态性。术语核酸酶与内切核酸酶可交换使用。
“切割”指在双链体的一条链或两条链中相对位置处的断裂。
“相对位置(或对面位置)”指双链体DNA的上链和下链上的位置，其中所述位置相互之间被少于11个碱基隔开。
本发明的实施方案适用于结构类似于T7 Endo I的一类酶，即具有两个催化结构域和β-桥的酶，并且包括T7 Endo 1在内(参见例如图12)。这一类的酶可以用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的保守结构域结构检索工具(Conserved Domain Architecture Retrieval Tool)(CDART)程序(Geer，Lewis Y.，et al.Genome Research 121619-1623(2002))或其它的预测性程序鉴定，这基于利用T7 Endo I的序列进行的搜索(图13)。
用这种方式鉴定出的酶的例子包括T奇数噬菌体或相关病毒，包括肠细菌噬菌体T7，NP_848275，鼠疫杆菌噬菌体phiA1122的内切核酸酶；NP_813757假单胞菌噬菌体gh-1的推定的内切核酸酶；NP_744417，恶臭假单胞菌KT2440的噬菌体脱氧核糖核酸内切酶I；NP_523312，细菌噬菌体T3的内切核酸酶；NP_064756，玫瑰噬菌体SIO1的RP内切核酸酶I；和NP_052083，细菌噬菌体phiYeO3-12的内切核酸酶。此外，其他相关的噬菌体诸如SP6、细菌噬菌体phiKMV、肠细菌噬菌体K1-5、弧菌噬菌体VpV262、BA14、BA127和BA156也可以编码类似的酶。
与T7 Endo I具有至少35％氨基酸同一性的酶的例子列于图14中。
使用遗传或生物化学手段，通过将突变引入桥而不改变催化中心本身，可以改变上述类型的酶中的两个催化中心的交互立体几何位置。因此，如本文中例示，突变被引入β-桥位点，而不干扰催化结构域的折叠和功能(实施例1)。本发明的实施方案不旨在局限于(a)将突变引入β-桥内的位点的示范性方法或(b)桥内的任何特定的突变位置。术语“突变”指在该酶中删除、置换或添加一个或多个氨基酸。
在酶的桥部分中的突变导致改变了针对不同底物的酶活性特性，并改变了最终产物的反应动力学和分布(reaction kinetics and distribution)。此外，在桥部分中的突变导致在不同的盐溶液中具有变化的酶活性特性。相比未修饰的酶，在修饰的酶的特性中观察到的变化的实践结果是，在体内的酶活性毒性降低，而酶活性在体外被保留或增强。结果，因为对宿主细胞具有降低的毒性，该修饰的酶可以在宿主细胞中被克隆并过量表达。这使得能够产生适合于用作分子生物学应用试剂的实际用途的酶量。
当(i)一个或多个突变被引入连接两个充分隔开的催化结构域的β-桥片段时，和/或(ii)反应条件被控制时，可以实现因一个或多个突变而导致的修饰型酶活性特性的变化。例如，选择反应缓冲液的金属离子组成，以提供改变的酶活性特性。在这些实施例中，反应缓冲液中包括镁或锰离子。这些缓冲液也可以被一起使用，以进一步修饰突变体的酶活性。例如，如果将锰离子加入到含有镁离子的反应混合物中，可以减少非序列特异性切刻的产生。不排除在反应缓冲液中使用镁或锰之外的金属离子，这些金属离子或者单独使用，或者与各种浓度的镁或锰离子一起使用。
在本发明的实施方案中，对T7 Endo I结构，特别是β-桥的计算机分析揭示，该桥构成二聚体界面的一部分，也揭示了，除了在桥中心的两个残基P46和A47，残基是通过氢键彼此结合(图12)。这两个残基位于该蛋白质的几何中心，赋予该蛋白质柔性。
通过将突变引入蛋白质的β-桥位置，可以实现在遗传上改变两个催化中心之间的距离。例如，对于T7 Endo I，可以产生PA/A、PA/AA、PA/PGA、PA/PAPA、ΔPA、PA/K、PA/G、PA/D和PA/P突变体，它们具有改变的酶活性，这是在含有镁或锰离子的反应缓冲液中使用各种DNA底物确认的，所述DNA底物包括错配的双链体DNA、含有切刻的双链体DNA、无切刻的双链体DNA和具有十字形结构的DNA。结构与T7 Endo I类似的蛋白质的构象柔性导致该酶具有宽泛的底物特异性。令人惊奇地，在β-桥中的各种长度的核苷酸置换(单个氨基酸、二肽、三肽或四肽)，带负电荷的、带正电荷的或电荷上中性的、结构上柔性的或结构上非柔性的，都揭示了在此描述的类型的改变的酶活性。
大约24个β-桥位置突变体被生成。这些蛋白质被纯化并表征(参见例如实施例1)。所有的突变都以某种方式改变了该酶的活性特性。两个具有活性的缺失突变体，ME(PA/A)和ME(ΔPA)，被详细表征(参见实施例1)。如所期望的，突变体中的两个催化区域正确折叠并完全具有活性，因为两者都能以与野生型蛋白质类似的效率分解十字形DNA。为了分解十字形结构，野生型酶的活性需要Mg2+。如果Mg2+用Mn2+代替，活性减少20倍或更多。对于这两个突变体，对金属离子的需求并不严格。突变蛋白在Mg2+或Mn2+缓冲液中具有几乎相同的活性。然而，ME(ΔPA)的动力学和最终产物被改变。该突变体不再能同时切割质粒上十字形结构的两条链。相反地，它在快速的反应中首先在一条链的某一位点产生切刻，从而导致十字形结构松弛，然后在另一个缓慢的反应中，在产生的切刻处切割另一条链。
对于在切刻或碱基错配处的DNA切割以及对于非序列特异性核酸酶活性，酶和它的突变体对金属离子的需求也发生变化。此时，野生型ME在Mg2+或Mn2+缓冲液中保留大致相同的活性。然而对于突变体，在Mg2+缓冲液中，这些活性显著降低。Mn2+变成必需的二价金属离子。在Mn2+缓冲液中，ME(PA/A)能够在切刻位置和在某些类型的单碱基错配位置识别并切割DNA，甚至比它的野生型对应物更有效率。
本领域普通技术人员将认识到，双链体DNA可以描述成具有上链和下链，当上链某位置的核苷酸与下链相同位置的核苷酸不互补时，错配便产生了。用DNA切割酶进行的切割能够导致下列情形中的至少一种(a)在上链和下链上的错配核苷酸的3′侧翼位置的断裂，(b)在上链和下链上的错配的5′侧翼位置的断裂，其中所述侧翼位置优选在距离错配少于约11个核苷酸的地方。
桥中的氨基酸已被改变或删除的酶突变体在体内的毒性可以显著小于野生型酶。在存在Mg2+的情况下(以毫摩尔浓度存在于宿主细胞中)，突变体诸如ME(PA/A)似乎具有显著降低的非特异性核酸酶活性。这使得过量表达突变T7内切核酸酶I例如ME(PA/A)成为可能。而且，相比野生型酶，在Mn2+中(不存在于宿主细胞中)，该突变体具有增强的解离酶活性。
属于T7内切核酸酶类型的酶(包括具有至少35％氨基酸序列同一性的蛋白质)——其中一个或多个突变已被引入催化结构域外的蛋白中并优选引入催化结构域之间的桥内，具有有益的特性。如T7 Endo I示范的有益特性的例子是
1.未修饰的酶对细胞有毒性，而修饰型酶无毒性，从而允许细胞过量表达该突变体酶(实施例1)。
2.十字形结构的切割。相比在镁缓冲液中的活性，未修饰的酶ME(WT)在锰缓冲液中的活性减少20倍。相反，修饰型酶ME(PA/A)和ME(ΔPA)在不同的缓冲液中显示出类似的活性。然而，ME(ΔPA)以等同的量产生带切刻的DNA或线性DNA，而ME(PA/A)产生双链断裂(实施例2)。这一改变的活性使得能够分解分支的DNA。
3.未修饰的和修饰的DNA切割酶两者都能发现在双链DNA中的切刻，并根据该切刻进行切割，结果是将双链DNA非序列特异性地切割成具有3或4个碱基突出端的片段(实施例2)。然而，修饰的酶在含锰缓冲液中比含镁缓冲液中具有更大的切割活性。这种特性在切刻位点作图中有用处。
4.修饰的和未修饰的酶两者都具有非特异性核酸酶活性，但是修饰型酶在含镁缓冲液中比起野生型酶具有更少的核酸酶活性。相比未修饰的酶，修饰的酶在含锰缓冲液中具有更大数量的核酸酶活性。非特异性核酸酶切割可以提供可被连接的、适合用于鸟枪或其它类型克隆的随机DNA序列。相比使用例如DNase I，该方法的优点是可以控制片段的尺寸，并避免感兴趣的DNA被断裂为极小的片段。
5.修饰的和未修饰的酶两者都识别单碱基错配。然而，在锰缓冲液中，修饰的酶比未修饰的酶具有更大的活性并且识别更宽范围的底物。为了分析单核苷酸多态性(SNPS)，将目标DNA变性，并与缺少所述多态性的相关DNA杂交。这导致产生单碱基错配，其具有8个可能性A对A、A对G、A对C、C对T、C对C、G对G、G对T和T对T。这些错配都可以被修饰型酶识别(实施例2)。这些修饰的酶为利用错配检测进行SNP检测分析提供了有用的工具。
与T7 Endo I具有至少35％氨基酸同一性并具有由β-桥隔开的两个催化中心的DNA切割酶可以被提供在试剂盒中，其中所述β-桥如上所述地含有导致变化的酶活性的突变，试剂盒中还带有合适的缓冲液，所述缓冲液例如根据上面的描述含有适应于需要的功能的锰离子或镁离子。该试剂盒可以额外地含有DNA大小梯度。说明书也可以包括在试剂盒中。可选择地，试剂盒可以包括编码该内切核酸酶的质粒，或者事实上是转化的宿主细胞制备物，其含有表达突变的切刻性内切核酸酶的重组载体。
本文中引用的所有参考文献都通过参考并入本文。此外，2003年11月21日提交的美国临时申请序列号60/524,123和Guan等.Biochemistry 434313-4322(2004)也通过参考并入本文。
实施例实施例1在桥位点处产生突变并过量表达该修饰型酶材料和方法
限制性酶、切刻酶N.BstNB I、DNA聚合酶、T4连接酶、T4 DNA激酶、β-琼脂糖酶、λ外切核酸酶、包括质粒pMAL-c2x在内的麦芽糖结合蛋白(MBP)蛋白融合表达和纯化系统、宿主大肠杆菌菌株TB1和ER2566、因子Xa蛋白酶、含十字形结构的质粒pUC(AT)和质粒LITMUS28获自新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs Inc.，Beverly，MA)。使用标准技术来合成合成的寡核苷酸。编码T7Endo I的T7噬菌体DNA具有对应于SEQ ID NO1的序列。
重组DNA和诱变方法
DNA操作和定点诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82(2)488-92(1985Jan))或PCR方法按照Sambrook等在Molecular Cloning(Sambrook，J.and Russell，D.W.(2001)Molecular Cloninga Laboratory Manual，pub.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(2001))中描述的进行。
克隆T7 EndoI突变体
为了通过PCR从噬菌体染色体DNA克隆T7 Endo I，使用两条引物
oligo-1CCCGAATTCATGGCAGGTTACGGCGCT(SEQ ID NO2；和
oligo-2CCCCCAAGCTTATTTCTTTCCTCCTTT(SEQ ID NO3)。
PCR产物用限制性酶处理，并克隆入质粒pUC19的Hind III-EcoR I位置，产生质粒pEndo I。为了由pEndo I构建pEndo(Δβ2)(其中Δβ2是删除第二个β片层)和pME(Δβ2)，进行两个连续的PCR(两步PCR)。在第一步中，pEndo I被用作模板。
oligo-1和oligo-4(TGGAAGTAAGAAGTCTGGCCACTCTTCATA)(SEQ ID NO4)被用作用于获得基因的5’端部分的引物。oligo-3(TTCGAGTATGAAGAGTGGCCAGACTTCTTA)(SEQ ID NO5)和oligo-2被用作用于获得基因的3’端部分的引物。
在第二步中，获自第一步的纯化的5’和3’产物的1∶1混合物被用作模板，oligo-1和-2被用作引物。对于每一步骤，进行10至15个PCR循环(95℃，0.5min；45℃，0.5min；72℃，0.5min)。将最终产物克隆入pUC19和pMAL-c2x，从而分别产生pEndo(Δβ)和pME(Δβ2)。限制性酶Msc I的识别序列在剔除位点处产生。为了由pME(Δβ2)构建pME(PA/A)，将下述两条DNA寡核苷酸退火oligo-5AAAGTGCCTTATGTAATTGCGAGCAATCACACTTACACT(SEQ IDNO7)oligo-6AGTGTAAGTGTGATTGCACGCAATTACATAAGGCACTTT(SEQ IDNO8)，然后插入pME(Δβ2)的Msc I位置。如pME(PA/A)那样构建pME(ΔPA)，不同的是使用下述的两条不同的寡核苷酸oligo-7AAAGTGCCTTATGTAATTAGCAATCACACTTACACT(SEQ ID NO9)和oligo-8AGTGTAAGTGTGATTGCTAATTACATAAGGCACTTT(SEQ ID NO10)。
用于异源双链体分析的底物的制备
为了由pEndo(Δβ2)构建pAAT、pACT、pAGT和pATT，将下述两种寡核苷酸混合物退火oligomix-9AAAGTGCCTTATGTAAATTCCCANTAATCACACTTACACT(SEQ IDNO11)；和oligomix-10AGTGTAAGTGTGATTANTGGGAATTTACATAAGGCACTTT(SEQID NO12)，然后插入pEndo(Δβ2)的Msc I位置。通过DNA测序检验需要的各克隆。
使用Big Dye标记的染料终止化学方法(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)，在Applied Biosystems，Inc的自动DNA测序仪(3100)上进行DNA测序。通过测序检验被克隆的DNA和用作用于通过PCR制备底物的模板的DNA。
异源双链体底物的制备
为了通过熔化-退火处理制备杂合底物，将上述两种纯化的PCR产物在退火缓冲液(20mM Tris.7.6，50mM NaCl)中，以1∶1的比率混合。将该混合物在95℃温育5分钟，再在65℃温育1小时，然后逐渐冷却到室温。为了通过将纯化的单链DNA退火制备异源双链体，将正链和负链在退火缓冲液中以1∶1比率混合，然后进行熔化-退火处理。
基因表达和蛋白质纯化
利用MBP融合和表达系统表达和纯化基因产物按照以前描述的那样进行(Sambrook，J.和Russell，D.W.(2001)Molecular Cloninga Laboratory Manual，pub.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(2001)；Riggs，P.CurrentProtocol in Molecular Biology，ed.Ausubel，F.A.et al.16.6.1-16.6.14，pub.GreenAssociates/Wiley Interscience，New York(1994))。对标准实验方案的修改和非融合酶的制备参见以前的描述(Guan，C.，et al.J.Biol.Chem.191732-1737(1996))。纯化的酶，或者天然的酶或它的MBP融合形式，于-20℃保存在50％甘油中。蛋白质分析—使用牛血清白蛋白作为标准，通过Bio-Rad Protein Assay测定蛋白质的浓度。通过SDS-PAGE分析以及使用Applied Biosytems Inc.的Voyager DE(AppliedBiosystems Inc.，Foster City，CA)进行的MALDI-ToF质谱术，测定分子量和纯度。在Procise 494蛋白质/肽测序仪(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)上进行N-末端蛋白质序列分析。
为了分析解离酶活性，将具有2mM MgCl2或2mM MnCl2的20μl缓冲液(20mM Tris，pH 7.6，50mM NaCl，2mM DDT)中的1μg含十字形结构的质粒pUC(AT)与可变数量的纯化的酶在37℃温育30分钟。然后通过琼脂糖凝胶电泳分析消化产物。在Bio-Rad Phosphoimage自动密度计上，对凝胶上的DNA或蛋白质条带进行定量分析。
结果T7内切核酸酶突变体的制备和过量表达[100]使用分离自T7噬菌体的基因组DNA作为模板，通过PCR获得T7 Endo I基因。该基因作为480个碱基对(bp)的EcoRI-HindIII片段被克隆到质粒pUC19上，即pEndo I，被克隆的基因的方向与载体上的lac启动子相反。该EcoRI-HindIII片段应该可以从pEndo I转移到pMAL-c2x质粒的EcoRI-HindIII位点中，以形成MBP-Endo I框内基因融合。在pMAL系统中构建MBP-Endo I融合的第一次尝试是不成功的。在转化宿主细胞后，连接混合物不产生克隆，即使多个拷贝的lacIq基因存在于该宿主中。预想该失败可能是由甚至在未诱导的细胞中也存在的毒性表达导致的，于是取而代之用更严格调控的T7启动子构建另一种形式的pMal载体(pMalC2x-NEB)(Studier等.Meth.Enzymol.18560-89(1990))。使用该载体，获得构建物。在T7启动子表达宿主诸如ER2566或TD-1中，通常可以从1升的诱导培养物中纯化出2至5μg的ME。
为了在β-桥中产生突变，同时使PCR错误最小化，我们构建了感兴趣的区域已被删除的无活性的受体ME融合载体，而合成的寡核苷酸可以被加回到载体中。简言之，通过两步PCR，将编码第二个β片层(β2)，残基40至53的DNA，从pEndo I中删除，并由MscI位置取代。将所得的质粒命名为pEndo(Δβ2)。将突变的基因Endo(Δβ2)作为EcoR I-Hind III片段转移入pMAL-c2x的EcoR I-Hind III位置，从而产生质粒pME(Δβ2)。该质粒在大肠杆菌宿主TB1或ER2566中是稳定的。通过将短的合成的双链DNA插入pME(Δβ2)的MscI位置，产生其他的突变体。MBP-Endo I突变体的命名如下ME(ΔPA)，其中位于β-桥中心的两个残基P46和A47被去除；ME(PA/A)，其中二肽PA被单个残基A取代。二肽PA也被其它单个氨基酸、二肽、三肽或四肽取代，从而产生不同的变体诸如ME(PA/G)、ME(PA/AA)、ME(PA/PGA)和ME(PA/PAPA)等等。在突变ME(Δbdg)中，形成桥的所有6个残基(44-49)被去除。
在许多的这些突变体中，严重的T7 EndoI细胞毒性显著降低，因为突变基因可以在pMALc-2-x载体中被维持，而不会引起严重的宿主生长缺陷。与野生型ME相反，大量的MBP融合突变蛋白质在诱导后产生。在单个步骤的直链淀粉亲和层析之后，通常获得30-50mg/L的融合蛋白质(图1)。
纯化的野生型ME融合物与使用Xa因子切割除去MBP部分的酶具有同样的活性，这是通过使用pUC(AT)的活性滴定来判断的(参见上述的材料和方法以及下面的讨论)，其中已将融合蛋白质的分子量考虑在内。由于MBP-Endo I融合物具有完全的活性，所以该研究中的实验使用纯化的融合蛋白来进行。
实施例2两个缺失突变体ME(PA/A)和ME(ΔPA)的表征1.十字形结构DNA的切割[104]在负超螺旋质粒上稳定的十字形结构在结构上类似于DNA的四方向连接体。T7 Endo I高效率地分解这两种DNA结构(Parkinson，M.J.and Lilley，D.M.J.J.Mol.Biol.270169-178(1997))。为了比较不同的T7 Endo I突变体之间的酶活性，我们使用作为底物的含十字形质粒pUC(AT)的切割来定义比活性。一个单位的活性被定义为在20ml的反应中，在37℃，在30分钟内，将1μg的超螺旋pUC(AT)转变为线性形式(两链切开)或切刻形式(单链切开)所需的酶数量。我们通过酶滴定分析来测量比活性。结果在图2中给出。
在Mg2+缓冲液，ME和ME(PA/A)的比活性大致相同，为600至800U/mg(图2，图a1和b1)。当Mg2+缓冲液用Mn2+缓冲液替换时，ME活性降低约二十倍，降至只有约40U/mg(图2，图a2)。相反，在或者Mg2+或者Mn2+缓冲液中，ME(PA/A)的活性保持大约相同(600至800U/mg)(图2，图b1和b2)。用或者ME或者ME(PA/A)获得的最终产物基本上是相同的，为线性的质粒。未观察到带单个切刻的中间产物，这表明两链的切割是协调一致的。因此，脯氨酸的删除解除了Mn2+抑制，而没有改变反应进程。
相反，对于ME(ΔPA)，观察到在反应进程和离子依赖性方面的变化。这种酶的活性总的来说稍低，约400U/mg，并且在或者Mg2+或者Mn2+缓冲液中保持大致相同(图2，图c1和c2)。然而，产物与由野生型和ME(PA/A)产生的那些产物明显不同在Mg2+缓冲液中大部分的最终产物(≥90％)是带切刻的质粒(单切割)，少于10％是线性产物(双切割；图2，图c1)。对于该酶，但不是其它的酶，Mn2+影响其产物的身份，将双切割产物的百分比增加到50％(图2，图c2)。
我们研究了Mg2+缓冲液中，低和高的酶:底物比时的反应进程(图3)。尽管在延长的温育后或当使用高浓度的酶时ME(ΔPA)可以最终将切刻的质粒转变为线性形式(图3，图b)，但在低酶浓度时，第二链切割的速率比第一链速率低100倍以上。底物过量时的反应条件(低的酶浓度，如图3，图a所示)需要每个酶分子进行多次转换反应，以在所有底物分子上完成第一链切割。因此，对于该酶，第一和第二链切割似乎是两个独立的反应。
对解离酶反应的最终产物的限制性消化分析证明，ME(PA/A)和ME(ΔPA)如ME那样在十字型结构处切割pUC(AT)。进一步将桥缩短，产生ME(Δbdg)，这导致非常低的切刻活性(5-10U/μg)，无任何双链切割。该残留的活性依然对十字形结构具有特异性。
这些结果显示，在活性突变体中的两个催化结构域正确折叠并完全具有活性。我们也推断，每一个结构域作为产生切刻的内切核酸酶独立地发挥功能。为了有效地分解十字形DNA，在酶的两个催化中心之间维持适当的几何关系是必要的。通过遗传学方法改变这两个中心的相对位置，导致了酶效率、金属离子偏好、反应动力学和最终产物分布的变化。
2.非特异性内切核酸酶活性[110]当使用高浓度的酶时，观察到T7 Endo I的非特异性内切核酸酶活性。为了比较T7 Endo I变体之间的非特异性核酸酶活性，在20ml反应中，37℃，将1μg的λ噬菌体DNA与变化数量的酶温育30分钟。将消化产物进行凝胶电泳。结果呈现在图4中。
对于野生型酶ME，非特异性核酸酶活性在Mg2+或Mn2+缓冲液中大致相同(图4，图a1和图a2)。这与特异性底物的20倍离子效应(参见上文)形成对比。突变也选择性地影响非特异性核酸酶活性在Mg2+缓冲液中，两种突变体ME(PA/A)和ME(ΔPA)显示出比ME低20和50倍的非特异性核酸酶活性(图4，图b1和c1)，而对于特异性底物的比活性则几乎没有降低。Mn2+则不损害这两种突变体的非特异性核酸酶活性非特异性降解在类似的或较低的酶浓度发生，如同ME观察到的情况(图4，图b2和b2)。
将Mg2+加入到含有Mn2+的反应混合物中，对提高的ME(PA/A)和ME(ΔPA)的非特异性核酸酶活性产生竞争性抑制。将10至20mM的Mg2+加入到2mM Mn2+缓冲液中，消除了这些酶90％以上的非特异性核酸酶活性。
通过ME或ME(PA/A)消化产生的λDNA片段的鸟枪克隆和序列分析表明，该酶随机地切割线性DNA(图15)。
3.带切刻的DNA双链体的切割[114]我们在上文指出，ME(ΔPA)在切刻位点切割DNA，最终将pUC(AT)的带切刻的中间体转变为线性形式(图3，图b)。为了确定T7 Endo I是否能够在任何切刻处进行切割，或仅仅在解离反应的过程中进行切割，我们制备了没有十字形特征的线性带切刻的底物。质粒pNB I(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)含有位点专一性切刻酶N.BstNBI的单个识别位点，它首先用该切刻酶消化，然后用BsaHI消化。所得的产物是2.5kb的线性DNA分子，具有距离分子的一端约600bp的切刻。采用同样的实验方案，但是没有用N.BstNBI切刻，则产生了无切刻的对照底物。这些底物然后与ME在Mg2+缓冲液中温育，并在琼脂糖凝胶上分析片段。除了原始的2.5kb DNA，带切刻的底物还产生了预期的0.6kb和1.9kb DNA片段(图5)，而对照仅产生2.5kb的底物DNA。这表明，T7 Endo I识别存在于双链体中的切刻，并在该位点或其附近切割分子。
在切刻的对面或近似对面进行切割是一种新的活性，因此我们研究了上述突变体对这种新的底物的特性，并再次比较了Mg2+或Mn2+支持反应的能力。结果呈现在图6中。
与Mn2+抑制野生型酶的十字形解离情况相反，在Mg2+或Mn2+缓冲液中，野生型ME在切刻处显示出等同的活性(图6，图a1和a2)。这暗示了，对于该酶，被Mn2+抑制的是十字形的第一链切割。对于ME(ΔPA)，在Mg2+缓冲液中的活性无法检测到(图6，图c1)，而在Mn2+中，活性被显著增加(图6，图c2)。该行为与它在十字形底物上的活性是相容的，原因是在十字形上Mg2+支持的活性主要是产生切刻的产物，而Mn2+导致双链切割。这暗示了，在Mg2+中，该酶不能通过在第一切刻的对面或近似对面进行切割来有效地完成解离反应，但是Mn2+支持在该切刻对面或近似对面的切割，如在此所看到的。
在存在Mn2+的情况下，对于切刻位置的切割，ME(PA/A)是比它的野生型对应物更具有活性的酶。事实上，获得了野生型所没有的其它产物，其中这些产物对应于在上文中该酶所观察到的增加的一般性非特异性活性。在本实验中，酶的数量(20ng)远少于为了获得广泛的非特异性活性所使用的数量(400ng)。
图7阐释了我们测定该切刻位点活性的切割位置的方法。简言之，质粒pNB1首先用切刻酶N.BstNB I处理，然后用ME或ME(PA/A)，在Mn2+缓冲液中切割。从琼脂糖凝胶鉴定和纯化出线性质粒。在末端用T4DNA聚合酶加dNTP进行加工从而产生平末端后，将分离自质粒Litmus 28并含有多克隆位点和用于测序的引物结合位点的300bp平末端Stu I-SnaB I片段与这些产物连接。重组质粒从各转化子中分离出来，并用选自寡核苷酸S12050和S12051(NEB，Beverly，MA)的两种引物进行测序，序列是从MCS插入片段的中心向外读取。结果显示，该内切核酸酶在连续链中引入了单切割，位于切刻的5’方向的3或4bp处。这两个位置以大致相等的频率被发现(数据未显示)。测序数据也显示，在该实验条件下，该酶不切割在该反应中产生的粘性末端处的短的单链突出端，因为由填充反应产生的复制序列是完整的。
4.具有单个碱基错配的DNA异源双链体的切割[119]为了测试T7 Endo I和它的突变体在单个碱基错配位点切割DNA的能力，我们利用了在诱变实验中产生的突变pEndo I基因。构建四个pEndo I衍生物，命名为pAAT、pACT、pAGT和pATT(参见实验程序)。它们之间的唯一的区别是在该基因的相同位置处的单碱基变异。使用这4个克隆作为模板，获得4个PCR产物，约480bp长，命名为pcrAAT、pcrACT、pcrAGT和pcrATT。通过将这4个PCR产物中的任意两个PCR产物混合，然后进行熔化-退火处理，可以获得单碱基错配的异源双链体分子(Babon，J.J.，et al.Molecular Biotechnology，2373-81(2003))。制备了6种杂合混合物底物，命名为hmAATxACT、hmAATxAGT、hmAATxATT、hmACTxAGT、hmACTxATT和hmAGTxATT。除了两个原始的同源双链体外，每种杂合混合物预期还含有两种不同的异源双链体。例如，除了原始的pcrAAT和pcrACT外，hmAATxACT还含有A/G和C/T单碱基错配异源双链体。错配位置离分子的一端约150bp。在各种杂合混合物中异源双链体的最大含量是50％。两种不同的杂合混合物可能含有同样类型的碱基错配，但是错配位置侧翼的序列是不同的。
在Mg2+或Mn2+缓冲液中，将6种杂合混合物分别与ME、ME(PA/A)和ME(ΔPA)温育。对消化物进行琼脂糖凝胶电泳(图8)。结果显示，无一例外地，ME消化了异源双链体，由原始480bp产生150bp和330bp双链体。在直接使用pcrAAT、ACT、AGT或ATT作为底物的对照中，仅仅能够鉴定到原始的480bp DNA条带(图8，图a1和a2)。这表明，ME切割存在于6种杂合混合物的每一种杂合混合物中的两种异源双链体中的至少一种异源双链体。ME对这些底物的切割效率在Mg2+或Mn2+缓冲液中大致相同。然而，在Mg2+缓冲液中，几乎检测不到ME(PA/A)或ME(ΔPA)的切割(图8，图b1和c1)。通过在反应中用Mn2+替代Mg2+，ME(PA/A)或ME(ΔPA)的切割效率被显著增加(图8，图b2和c2)。在存在Mn2+的情况下，对于切割在杂合混合物底物中的单碱基错配DNA，ME(PA/A)至少具有和ME一样的活性。ME(ΔPA)则是活性较低的酶，甚至在Mn2+缓冲液中。
为了评价该酶对各种单碱基错配的切割效率，我们制备了异源双链体底物，每一底物仅仅含有其中一种可能的错配(图9，图A)。简言之，通过使用λ外切核酸酶选择性地消化相关PCR产物的其中一条链，产生8种单链DNA分子，约480个碱基长，命名为ssAAT(+)、ssAAT(-)、ssACT(+)、ssACT(-)等等。将其中每一条正链和其中每一条负链退火，便能够产生16种双链体DNA分子。其中，12种是单碱基错配异源双链体，4种是同源双链体分子(图9，图B)。该碱基错配位置距分子的其中一个末端约150bp。一些异源双链体可能含有相同类型的错配，但是错配周围的序列是不同的。
将如上制备的16种DNA双链体分别与ME和ME(PA/A)在Mn2+缓冲液温育。在琼脂糖凝胶上分析消化物(图10)。结果显示，通过将两条相应的正链和负链退火而产生的4种正常的DNA双链体分子不被ME(图10，图A)或ME(PA/A)(图10，图B)特异性切割。两种酶都能够在其中至少一个错配碱基为胞嘧啶的单碱基错配位置有效地切割异源双链体。两种酶都不在G/G错配处非常有效地切割DNA。两种酶之间的最明显的差异是，ME(PA/A)比ME在A/A和T/T错配上具有高得多的活性。总之，在存在Mn2+的情况下，当在单碱基错配位置切割DNA时，ME(PA/A)是比它的野生型对应物更为有效的酶。为了测定该酶在单碱基错配位置的切割型式，我们进行了如图11，a中所示的实验。简言之，通过用HindIII消化，将质粒pAAT、pACT、pAGT和pATT线性化。将这四种线性质粒混合，并进行熔化-退火处理。将退火的质粒混合物用T4连接酶和ATP处理，以产生松弛的环状分子。大部分的(高达75％)再环化的质粒应当含有对T7 Endo I切割敏感的单碱基错配位点。该连接混合物在Mn2+缓冲液中用ME(PA/A)处理，然后用T4DNA聚合酶加dNTP处理，形成平末端，然后进行琼脂糖凝胶电泳。从凝胶分离出代表全长线性质粒的DNA条带(图11，图b)。纯化的线性物用T4连接酶处理，并转化入大肠杆菌宿主TB1。从各转化子分离出质粒，利用定位于距原始错配位置150bp的引物，对贯穿通过连接结合点的序列进行测序。结果显示，在错配碱基的5’方向距离该错配碱基1至3个bp的位置，ME(PA/A)切割DNA的两条链，产生3至7(它们中的许多是4至6)bp长的粘性末端，这是通过在错配位点处产生的复制序列的长度来判断的。
序列表<110>新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs，Inc.)Guan，ChudiKumar，SanjayKucera，Rebecca<120>修饰的DNA切割酶和其应用方法<130>NEB-236-PCN<150>60/524,123<151>2003-11-21<150>PCT/US04/039288<151>2004-11-22<160>25<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>450<212>DNA<213>未知<220>
<223>肠细菌噬菌体T7<400>1atggcaggtt acggcgctaa aggaatccga aaggttggag cgtttcgctc tggcctagag 60gacaaggttt caaagcagtt ggaatcaaaa ggtattaaat tcgagtatga agagtggaaa120gtgccttatg taattccggc gagcaatcac acttacactc cagacttctt acttccaaac180ggtatattcg ttgagacaaa gggtctgtgg gaaagcgatg atagaaagaa gcacttatta240attagggagc agcaccccga gctagacatc cgtattgtct tctcaagctc acgtactaag300ttatacaaag gttctccaac gtcttatgga gagttctgcg aaaagcatgg tattaagttc360gctgataaac tgatacctgc tgagtggata aaggaaccca agaaggaggt cccctttgat420agattaaaaa ggaaaggagg aaagaaataa 450<210>2<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>2cccgaattca tggcaggtta cggcgct 27<210>3<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>3cccccaagct tatttctttc ctccttt 27<210>4<211>30<212>DNA<213>未知
<220>
<223>引物<400>4tggaagtaag aagtctggcc actcttcata 30<210>5<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>5ttcgagtatg aagagtggcc agacttctta 30<210>6<211>39<212>DNA<213>未知<220>
<223>寡核苷酸<400>6aaagtgcctt atgtaattgc gagcaatcac acttacact 39<210>7<211>39<212>DNA<213>未知<220>
<223>寡核苷酸<400>7agtgtaagtg tgattgcacg caattacata aggcacttt 39<210>8<211>36<212>DNA<213>未知<220>
<223>寡核苷酸<400>8aaagtgcctt atgtaattag caatcacact tacact36<210>9<211>36<212>DNA<213>未知<220>
<223>寡核苷酸<400>9agtgtaagtg tgattgctaa ttacataagg cacttt36<210>10<211>40<212>DNA<213>未知<220>
<223>寡核苷酸混合物
<220>
<221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>n是a，c，g或t<400>10aaagtgcctt atgtaaattc ccantaatca cacttacact40<210>11<211>40<212>DNA<213>未知<220>
<223>寡核苷酸混合物<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>n是a，c，g或t<400>11agtgtaagtg tgattantgg gaatttacat aaggcacttt40<210>12<211>149<212>PRT<213>未知<220>
<223>肠细菌噬菌体T7<400>12Met Ala Gly Tyr Gly Ala Lys Gly Ile Arg Lys Val Gly Ala Phe Arg1 5 10 15Ser Gly Leu Glu Asp Lys Val Ser Lys Gln Leu Glu Ser Lys Gly Ile20 25 30Lys Phe Glu Tyr Glu Glu Trp Lys Val Pro Tyr Val Ile Pro Ala Ser35 40 45Asn His Thr Tyr Thr Pro Asp Phe Leu Leu Pro Asn Gly Ile Phe Val50 55 60Glu Thr Lys Gly Leu Trp Glu Ser Asp Asp Arg Lys Lys His Leu Leu65 70 75 80Ile Arg Glu Gln His Pro Glu Leu Asp Ile Arg Ile Val Phe Ser Ser85 90 95Ser Arg Thr Lys Leu Tyr Lys Gly Ser Pro Thr Ser Tyr Gly Glu Phe100 105 110Cys Glu Lys His Gly Ile Lys Phe Ala Asp Lys Leu Ile Pro Ala Glu115 120 125Trp Ile Lys Glu Pro Lys Lys Glu Val Pro Phe Asp Arg Leu Lys Arg130 135 140Lys Gly Gly Lys Lys145
<210>13<211>151<212>PRT<213>未知<220>
<223>鼠疫杆菌噬菌体phiA1122<400>13Met Ala Gly Thr Tyr Ala Ala Arg Gly Ile Arg Lys Val Gly Thr Phe1 5 10 15Arg Ser Gly Leu Glu Asp Lys Val Ser Lys Gln Leu Glu Gly Lys Gly20 25 30Ile Lys Phe Asp Tyr Glu Leu Trp Lys Ile Pro Tyr Val Val Pro Ala35 40 45Ser Asn His Val Tyr Thr Pro Asp Phe Leu Leu Pro Asn Gly Ile Phe50 55 60Ile Glu Thr Lys Gly Leu Trp Glu Ser Asp Asp Arg Lys Lys His Leu65 70 75 80Leu Ile Arg Glu Gln Phe Pro Glu Leu Asp Ile Arg Leu Val Phe Ser85 90 95Ser Ser Arg Thr Lys Leu Tyr Lys Gly Ser Pro Thr Ser Tyr Gly Glu100 105 110Trp Cys Glu Lys His Gly Ile Leu Phe Ala Asp Lys Leu Ile Pro Val115 120 125Glu Trp Leu Lys Glu Pro Lys Lys Glu Val Pro Phe Asp Arg Leu Lys130 135 140Gln Ala Lys Gly Gly Lys Lys145 150<210>14<211>153<212>PRT<213>未知<220>
<223>细菌噬菌体phiYe03-12<400>14Met Ala Gly Ala Tyr Ala Ala Arg Gly Val Arg Lys Val Gly Ala Phe1 5 10 15Arg Ser Gly Leu Glu Asp Lys Val Ser Lys Gln Leu Glu Ser Lys Gly20 25 30Ile Lys Phe Asp Tyr Glu Leu Trp Arg Ile Pro Tyr Val Ile Pro Ala35 40 45Ser Asp His Leu Tyr Thr Pro Asp Phe Leu Leu Pro Asn Gly Ile Phe50 55 60
Ile Glu Thr Lys Gly Leu Trp Asp Ser Asp Asp Arg Lys Lys His Leu65 70 75 80Leu Ile Arg Glu Gln His Pro Glu Leu Asp Ile Arg Leu Val Phe Ser85 90 95Ser Ser Arg Ser Lys Leu Tyr Lys Gly Ser Pro Thr Ser Tyr Ala Glu100 105 110Trp Cys Glu Lys His Gly Ile Leu Phe Ala Asp Lys Leu Ile Pro Val115 120 125Glu Trp Leu Lys Glu Pro Lys Lys Glu Val Pro Phe Asp Lys Phe Lys130 135 140Thr Lys Lys Gly Val Lys Lys Asn Gly145 150<210>15<211>152<212>PRT<213>细菌噬菌体T3<400>15Met Ala Gly Ala Tyr Ala Ala Arg Cys Thr Gln Gly Arg Ala Phe Arg1 5 10 15Ser Gly Leu Glu Asp Lys Val Ser Lys Gln Leu Glu Ser Lys Gly Ile20 25 30Lys Phe Asp Tyr Glu Leu Trp Arg Ile Pro Tyr Val Ile Pro Glu Ser35 40 45Asp His Leu Tyr Thr Pro Asp Phe Leu Leu Pro Asn Gly Ile Phe Ile50 55 60Glu Thr Lys Gly Leu Trp Asp Ser Asp Asp Arg Lys Lys His Leu Leu65 70 75 80Ile Arg Glu Gln His Pro Glu Leu Asp Ile Arg Leu Val Phe Ser Ser85 90 95Ser Arg Ser Lys Leu Tyr Lys Gly Ser Pro Thr Ser Tyr Gly Glu Trp100 105 110Cys Glu Lys His Gly Ile Leu Phe Ala Asp Lys Leu Ile Pro Val Ala115 120 125Gly Val Lys Glu Pro Lys Lys Glu Val Pro Phe Asp Lys Phe Lys Thr130 135 140Lys Lys Gly Val Lys Lys Asn Gly145 150<210>16<211>147<212>PRT<213>未知
<220>
<223>假单胞菌噬菌体gh-1<400>16Met Ala Tyr Ala Gly Pro Lys Gly Ala Arg Thr Gly Ala Phe Arg Ser1 5 10 15Gly Leu Glu Asp Arg Asn Ala Lys His Met Asp Lys Leu Gly Val Lys20 25 30Tyr Asp Phe Glu Arg Phe His Ile Asn Tyr Val Val Pro Ala Arg Asp35 40 45Ala Lys Tyr Thr Pro Asp Phe Val Leu Ala Asn Gly Ile Ile Ile Glu50 55 60Thr Lys Gly Ile Trp Glu Val Asp Asp Arg Lys Lys His Leu Leu Ile65 70 75 80Arg Glu Gln Tyr Pro Asp Leu Asp Ile Arg Leu Val Phe Ser Asn Ser85 90 95Asn Ser Lys Ile Tyr Lys Gly Ser Pro Thr Ser Tyr Ala Asp Phe Cys100 105 110Thr Lys His Gly Ile Gln Phe Ala Asp Lys Leu Val Pro Arg Asp Trp115 120 125Leu Lys Glu Ala Arg Lys Glu Ile Pro Gln Gly Val Leu Val Pro Lys130 135 140Lys Gly Gly145<210>17<211>141<212>PRT<213>未知<220>
<223>恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)KT2440<400>17Met Gly Leu Lys Tyr Gly Phe Arg Ser Gly Leu Glu Glu Arg Ala Ala1 5 10 15Asp Gln Leu Thr Ala Val Gly Met Gly Phe Thr Phe Glu Ser Leu Val20 25 30Val Pro Tyr Thr Arg Pro Ala Lys Val His Lys Tyr Thr Pro Asp Phe35 40 45Ala Leu Ala Asn Gly Ile Ile Val Glu Thr Lys Gly Arg Phe Leu Thr50 55 60Glu Asp Arg Gln Lys Gln Leu Leu Val Lys Ala Gln His Pro Glu Leu65 70 75 80
Asp Val Arg Phe Val Phe Ser Asn Ser Lys Thr Lys Ile Asn Lys Arg85 90 95Ser Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Trp Cys Ser Lys Asn Gly Phe Gln Tyr100 105 110Ala Asp Lys Leu Val Pro His Ala Trp Leu Asn Glu Pro Val Asn Glu115 120 125Ala Ser Leu Ser Ile Ile Lys Gly Leu Ser Lys Glu Lys130 135 140<210>18<211>134<212>PRT<213>未知<220>
<223>玫瑰噬菌体SI01<400>18Met Leu Asn Ser Lys Ser Ser Thr Arg Lys Arg Ala Leu Lys Ala Gly1 5 10 15Tyr Arg Ser Gly Leu Glu Glu Gln Thr Ala Lys Asp Leu Lys Lys Arg20 25 30Lys Val Leu Phe Thr Tyr Glu Glu Thr Lys Ile Lys Trp Leu Asp Ser35 40 45Lys Val Arg Thr Tyr Thr Pro Asp Phe Val Leu Pro Asn Gly Val Ile50 55 60Ile Glu Thr Lys Gly Arg Phe Val Ala Ala Asp Arg Arg Lys His Leu65 70 75 80Glu Ile Gln Lys Gln Phe Gly Thr Leu Tyr Asp Ile Arg Phe Val Phe85 90 95Thr Asn Ser Lys Ala Lys Leu Tyr Lys Gly Ala Lys Ser Ser Tyr Ala100 105 110Asp Trp Cys Asn Lys His Gly Phe Leu Tyr Ala Asp Lys Thr Ile Pro115 120 125Glu Asp Trp Leu Asn Glu130<210>19<211>13<212>DNA<213>未知<220>
<223>合成<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>错配
<400>19aattccaata atc 13<210>20<211>11<212>DNA<213>未知<220>
<223>人工<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>错配<400>20aattcccagt a 11<210>21<211>20<212>DNA<213>未知<220>
<223>合成<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>错配<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>错配<400>21aattcccagt accaataatc 20<210>22<211>10<212>DNA<213>未知<220>
<223>合成<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>错配<400>22aattcccagt 10<210>23<211>18<212>DNA<213>未知<220>
<223>合成<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>错配
<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>错配<400>23aattcccagt caataatc18<210>24<211>149<212>PRT<213>未知<220>
<223>肠细菌噬菌体T7<400>24Met Ala Gly Tyr Ser Ala Lys Gly Ile Arg Lys Val Gly Ala Phe Arg1 5 10 15Ser Gly Leu Glu Asp Lys Val Ser Lys Gln Leu Glu Ser Lys Gly Ile20 25 30Lys Phe Glu Tyr Glu Glu Trp Lys Val Pro Tyr Val Ile Pro Ala Ser35 40 45Asn His Thr Tyr Thr Pro Asp Phe Leu Leu Pro Asn Gly Ile Phe Val50 55 60Glu Thr Lys Gly Leu Trp Glu Ser Asp Asp Arg Lys Lys His Leu Leu65 70 75 80Ile Arg Lys Gln His Pro Glu Leu Asp Ile Arg Ile Val Phe Ser Ser85 90 95Ser Arg Thr Lys Leu Tyr Lys Gly Ser Pro Thr Ser Tyr Gly Glu Phe100 105 110Cys Glu Lys His Gly Ile Lys Phe Ala Asp Lys Leu Ile Pro Ala Glu115 120 125Trp Ile Lys Glu Pro Lys Lys Glu Val Pro Phe Asp Arg Leu Lys Arg130 135 140Lys Gly Gly Lys Lys145<210>25<211>149<212>PRT<213>未知<220>
<223>肠细菌噬菌体T7<400>25Met Val Gly Tyr Gly Val Lys Gly Ile Arg Lys Val Gly Ala Phe Arg1 5 10 15Ser Gly Leu Glu Asp Lys Val Ser Lys Gln Leu Glu Ser Lys Gly Ile20 25 30
Lys Phe Glu Tyr Glu Glu Trp Lys Val Pro Tyr Val Ile Pro Ala Ser35 40 45Asn His Thr Tyr Thr Pro Asp Phe Leu Leu Pro Asn Gly Ile Phe Val50 55 60Glu Thr Lys Gly Leu Trp Glu Ser Asp Asp Arg Lys Lys His Leu Leu65 70 75 80Ile Arg Glu Gln His Pro Glu Leu Asp Ile Arg Ile Val Phe Ser Ser85 90 95Ser Arg Thr Lys Leu Tyr Lys Gly Ser Pro Thr Ser Tyr Gly Glu Phe100 105 110Cys Glu Lys His Gly Ile Lys Phe Ala Asp Lys Leu Ile Pro Ala Glu115 120 125Trp Ile Lys Glu Pro Lys Lys Glu Val Ser Phe Asp Arg Leu Lys Arg130 135 140Lys Gly Gly Lys Lys14权利要求
1.修饰的DNA切割酶，其包括(a)与T7 Endo I至少35％的氨基酸序列同一性，(b)被β桥隔开的两个催化中心，和(c)在β桥中的至少一个突变，相比未修饰的酶，其具有改变酶切割活性的效应。
2.根据权利要求1的修饰的DNA切割酶，其在宿主细胞中具有降低的毒性，从而允许该DNA切割酶过量表达。
3.根据权利要求1的修饰的DNA切割酶，其中所述酶活性包括下列中的至少一种在DNA的十字形结构处的切割、非序列特异性地产生切刻、在预先存在的切刻位点对面产生切刻、非序列特异性的DNA切割以及在错配碱基对的侧翼位点的DNA切割。
4.根据权利要求1的修饰的DNA切割酶，其中改变的酶活性的产物是具有少于11个核苷酸的单链突出端的DNA双链体。
5.根据权利要求1的修饰的DNA切割酶，其中，相比未修饰的酶，改变的酶切割活性还包括更宽的酶特异性。
6.根据权利要求5的修饰的DNA切割酶，其中DNA切割活性还包括在双链体中的错配处进行切割，其中所述错配可以是A、T、G或C碱基中的任何碱基。
7.根据权利要求1的修饰的DNA切割酶，其中，相比未修饰的酶，修饰的酶的酶切割活性的改变发生在含锰缓冲液中。
8.根据权利要求7的修饰的DNA切割酶，其中改变的酶活性选自切割活性的维持、非特异性核酸酶活性的降低、在预先存在的切刻位置对面产生切刻的活性的增强，以及产生切刻和双链切割的比率的降低。
9.根据权利要求1的修饰的DNA切割酶，其中改变的酶活性发生在镁缓冲液中。
10.根据权利要求9的修饰的DNA切割酶，其中改变的酶活性选自在DNA的十字形结构产生切刻相对于双链切割的比率增加；切割的十字形DNA与非切割DNA的比率增加；非特异性核酸酶活性的比率降低；和在预先存在的切刻位置对面的切刻产生减少。
11.根据权利要求1的修饰的DNA切割酶，当与未修饰的酶相比较时，在修改的反应条件下对于切割DNA具有增强或降低的活性。
12.根据权利要求12的修饰的DNA切割酶，其中反应条件的修改选自改变下列中的至少一种pH、温度、反应混合物中的锰或镁盐浓度和反应时间。
13.根据权利要求1的修饰的DNA切割酶，选自下列一组酶基因3(肠细菌噬菌体T7)、T7脱氧核糖核酸内切酶I、鼠疫杆菌噬菌体phiA1122内切核酸酶、噬菌体Phi Ye03-12内切核酸酶、噬菌体T3内切核酸酶、噬菌体T3脱氧核糖核酸内切酶、假单胞菌噬菌体gh-1内切核酸酶、恶臭假单胞菌KT2440脱氧核糖核酸内切酶I；和玫瑰噬菌体S101 RP内切核酸酶I。
14.根据权利要求1的修饰的DNA切割酶，其中所述至少一个突变是在β桥中PA位置的突变。
15.根据权利要求14的修饰的DNA切割酶，其中在PA位置的至少一个突变是PA的置换或删除，PA的置换选自单个氨基酸、二肽、三肽和四肽。
16.根据权利要求15的修饰的DNA切割酶，其中所述β桥中的至少一个突变选自PA/A、PA/AA、PA/PGA、PA/PAPA、ΔPA、PA/K、PA/G、PA/D和PA/P。
17.根据权利要求15的修饰的DNA切割酶，其中所述PA二肽位于SEQ ID.No.13的位置46和47。
18.核酸，其包括基本上对应于SEQ ID NO1的DNA序列，其中至少一个突变已被引入到对应于β桥的序列中。
19.根据权利要求18的核酸，其中所述突变发生在编码β桥中的PA的位点。
20.根据权利要求19的核酸，其中在编码PA的位点处的突变是置换或删除，所述置换的核酸编码单个氨基酸、二肽、三肽和四肽。
21.根据权利要求17的核酸，其中所述至少一个突变导致氨基酸变化，所述氨基酸变化选自PA/A、PA/AA、PA/PGA、PA/PAPA、ΔPA、PA/K、PA/G、PA/D和PA/P。
22.载体，其编码权利要求18至21中任一项所述的核酸。
23.宿主细胞，其含有权利要求22的载体。
24.试剂盒，其含有下述中的至少一种权利要求1的修饰的DNA切割酶、权利要求18-21的核酸、权利要求22的载体或权利要求23的宿主细胞。
25.用于修饰酶催化活性的方法，包括(a)选择具有通过β桥连接的两个催化中心的酶，所述催化中心在所述酶中处于交互立体几何位置；(b)通过将突变引入所述β桥，改变所述两个催化中心的交互立体几何位置；和(c)修饰所述酶的催化活性。
26.测定DNA底物是否具有单核苷酸多态性(SNP)的方法，包括(a)将所述DNA底物与权利要求1的修饰的DNA切割酶接触；和(b)由被切割的产物确定所述DNA底物是否具有SNP。
27.根据权利要求26的方法，还包括鉴定哪一种核苷酸形成所述SNP。
28.根据权利要求26的方法，还包括鉴定所述SNP的位置。
29.形成鸟枪克隆文库的方法，包括(a)将权利要求1的修饰的DNA切割酶与DNA温育，以形成所述DNA的可被连接的非序列特异性切割片段；所述可被连接的DNA能够插入到用于在宿主细胞中进行克隆的载体中；和(b)形成所述鸟枪克隆文库。
30.用于对双链体DNA中的切刻进行作图的方法，包括(a)将权利要求1的修饰的DNA切割酶与所述双链体DNA在含锰缓冲液中温育；(b)允许在预先存在的切刻位点对面产生切刻，以形成具有单链突出端的双链体DNA片段；和(c)对DNA中的切刻进行作图。
31.用于过量表达T7内切核酸酶1的方法，包括选择权利要求23的宿主细胞，并过量表达所述T7内切核酸酶1。
全文摘要
提供了有关修饰的DNA切割酶的组合物和方法，该修饰的DNA切割酶与T7Endo I具有至少35％的氨基酸序列同一性。该修饰的酶包括两个由β桥隔开的催化中心，其中所述β桥含有至少一个突变，该突变具有改变酶切割活性的效应，这是与未修饰的酶相比较而言的。与该修饰的DNA切割酶有关的、可以在不同的反应条件中被调节的活性包括下列中的至少一种(a)非序列特异性切刻活性；(b)在预先存在的切刻位置切割双链体DNA的第二链，从而产生带有单链突出端的线性双链体；(c)非序列特异性DNA切割；(d)切割在错配侧翼的DNA；和(e)在DNA双链体中的十字形结构处进行切割。
文档编号C12Q1/68GK1906292SQ200480040697
公开日2007年1月31日 申请日期2004年11月22日 优先权日2003年11月21日
发明者C·关, S·库马尔, R·库塞拉 申请人:新英格兰生物实验室公司