专利名称：修饰的α乳白蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及在高苯丙氨酸血病人饮食中有用的修饰蛋白质。
由于遗传原因引起的人高苯丙氨酸血病是在苯丙氨酸羟化酶PAHE.C.1.99.1.2)基因座，编码DHPR(二氢蝶啶还原酶)的基因座和在BH4(四氢生物蝶吟)合成途径的两个基因座发生突变的结果。在所有高苯丙氨酸病人中，不在PHA基因座发生突变的低于3％且在高加索病人中可能近似于1％。由于PAH突变引起的高苯丙氨酸血病人中过半数的病人具有严重的PAH缺陷(典型的苯丙酮尿或“PKU”)。这种肝脏酶负责将苯丙氨酸转变成酪氨酸。 如上面图解所示，PAH缺陷导致苯丙氨酸和其有机酸代谢物在组织和血液中积累，如果不进行控制，将在婴儿和儿童中引起严重的和不可逆的智力迟钝。
全世界的PKU发病率范围从爱尔兰的每5,000个中1个到日本的大约1000,000人中1个。对世界范围PKU发病率的一个保守的平均估计为每百万生命中有50例。美国的PKU发病率大约为在所有抽查的新生儿中每10,000个中有1个。
患病的婴儿一旦确诊，在早期开始饮食治疗以降低血液苯丙氨酸水平是关键的。治疗的一般目的是使血液苯丙氨酸水平保持在1000μmol/l(16.5mg/dl)以下且优选在600μmol/l以下。最近的神经学和行为学证据表明将来的治疗目标会更低苯丙氨酸值维持在尽可能接近正常值(＜120μmol/l，或＜1.98mg/dl)。
理论上，经过频繁的血液监测和坚持使用苯丙氨酸限制性饮食可达到理想地生化控制PKU(Trahms，"Nutritional Care in MetabolicDisorders/in Food，Nutrition and Diet Therapy.8th Edition(1992)，Mahan& Arlin，eds.，W.B.Sanders Co.，Philadelphia，Pennsylvania；Kitagawaet al，Enzyme 38 321—327(1987)；and Owada et al.Acta Paediatr.Jpn.30 405—409(1988))，但实际上不常获得这种理想的结果。特别是营养治疗的设计围绕使用减少苯丙氨酸含量的配方。通常可获得的用于患有PKU的婴儿和儿童的配方是95或100％无苯丙氨酸蛋白质水解产物或者是加入少量或不加苯丙氨酸的自由氨基酸混合物。酪氨酸通常是一种补充氨基酸，因为担心会使在治疗的苯丙酮尿病人中酪氨酸水平保持低于正常平均值。
饮食的顺应性不仅在生命的早期阻止患病的婴儿和儿童智力迟钝中是重要的，而且在后期的成年人特别是患高苯丙氨酸病的孕妇中也是重要的。实际上未治疗的孕妇后代都得并发症如智力迟钝和小头畸形。少数还有先天性心脏病和出生时体重低。这些后果非常不幸，因为在大多数情况下婴儿本身并不患有高苯丙氨酸血病。也有报道随着年龄的增长且很少治疗或无苯丙氨酸饮食控制的高苯丙氨酸大儿童，青少年和成年人智商逐渐降低，学习困难且行为有障碍。因此，尤其从最近的报道，很明显PKU代表了一种终身的和跨代的疾病，需要连续地且终身地进行饮食控制(Scriver et al.，TheMetabolic Basis of Inherited Disease，Scriver，C.R.，Beaudet.A.，Sly.W.，Valle.D.，(eds)，Tth edit.McGrawo Hill，in press，Chapter 27；Joint PAO/ WHO/UNU Expert Consulltation，Energy and Protein Re-quirements，WHO Tech.Rept.Ser.No.724，WHO，Geneva，Switzerland(1985)；Levy H.L.Treatment of genetic diseases，Ed.，R.J.Desnick，Churchill—Livingston，NY，(1991))。
PUK病人的饮食方案有3套。首先，提供除苯丙氨酸外的所有必需氨基酸使婴儿和儿童正常生长和发育，如果是成人，则用于维持。通常在限定配方形式的氨基酸成份中加入维生素和无机物。对于婴儿，基线氨基酸图应与人乳汁相匹配(Nayman et al.32 1279—1289(1979)t和Joint PAo/WHO/UNU Expert Consultation，Energy andProtein Requirements，WHO Tech.Rept.ser.No.724，WHO，Genera，Switzerland(1985))，但苯丙氨酸含量例外，它相对于人乳汁而言应较低或完全不存在。对于儿童和成人，除苯丙氨酸外，最小配方氨基酸图应适应PAO/WHO/UNU建议的这些组病人需要的形式。
其次，将限定苯丙氨酸含量的食物作为天然添加剂加入氨基酸配方基本饮食中。由于这些食物含有不同水平的苯丙氨酸，食物的选择和消费的多少给综合饮食提供或多或少的灵活性和可口性。所允许的苯丙氨酸水平仅仅是适于生长和/或维持所需要的。例如，全部童年摄入的苯丙氨酸最大耐受水平是500mg/天，可接受的范围是200—500mg/天。
根据Young & Pellett(Am.J.Clin.Nutr.45 1323(1987)和美国儿科研究院营养委员会(Pediatrics 57 783(1976))估计人类的绝对苯丙氨酸需要如下面表1所示表1 mg/天mg/kg/天 mg/g蛋白质婴儿25—90学前儿童*200—500 69 63较大的儿童*200—500 22 22年青的成年人14 19*从PAH活性几乎完全缺乏的PKU病人估计出。
PKU饮食的第三种成份是在满足了必需氨基酸和苯丙氨酸的需要后，必须保证足够的热值食物。这可用低蛋白质、高碳水化合物的食物如水果、蔬菜、脂肪和油来获得。
尽管上面提及的通用的治疗配方理论上在提供必需氨基酸，限制苯丙氨酸摄入和获得足够的生化控制方面是有效的，但对于一些维生素，无机物和氨基酸而言，其营养充分性和/或生物利用度是令人怀疑的(Acosta et al.J.Inher.Metab.Dis.5 107(1982))。而且使他们遭受口味和气味平淡及高渗透负担的痛苦并导致应变性差。对一生中饮食应变性和调控的需要强调了对含较低或不含苯丙氨酸的更易于接受的食物产品的需要。
理想的是，这些产品应口感好，气味好，并且当使用它们时，食物的选择和菜单的设计有最大的灵活性。理想的产品或配方应具有高度可口性和低(优选无)苯丙氨酸这些是产生应变性和使含低蛋白苯丙氨酸的食物及更正常的饮食最大量摄入的关键品质。苯丙氨酸含量低或完全缺乏的具有高生物学价值的食物将是一种非常有价值的饮食成份，因为更多种类和体积的含苯丙氨酸的天然食物可以被接受。
现在提供了以新的且更有效的方法研究这一问题的技术。使用定点诱变，蛋白质工程和重组DNA技术的组合，可经过使有关DNA密码子突变来改变特定的已知蛋白质以减少或消除苯丙氨酸残基。
最近几年，我们对重组DNA和遗传技术，蛋白质工程的认识有了相当大的扩展。这一知识体系使我们能够选择特定的蛋白质，根据其已知序列，结构和功能进行突变。然后，编码这种蛋白质的DNA可从适当的来源克隆，突度成所需的成分，测序以证实其改变并克隆到合适的载体上进行表达。
最近几年克隆了编码各种各样的药用上和营养上重要的蛋白质之DNA序列。这些包括胰岛素，纤溶酶原激活物，α1—抗胰蛋白酶，血因子VIII和IX，溶菌酶，α—乳白蛋白和乳铁蛋白。从这些DNA序列可推导出其蛋白质序列并以多肽图谱和Edman降解法来证实。
利用蛋白质X—射线晶体学和多维核磁共振波谱学可测定许多蛋白质的三维结构。这一技术已与高功能计算机和先进的程序耦联，用它能摸拟氨基酸残基的改变对蛋白质结构和功能可能产生的影响(Nilsson et al，Curr.Opin.in Strus.Biol.2 569—575(1992)；Presta，L.G.，Curr.Opin.iro Struc.Biol.2 593—596(1992)；Cech，T.R.，Curr.Opin.in Struc.Biol.2 605—609(1992)；Pickersgill andGoodenough，Trends in Food Sci.and Tech.5 122—126(1991))。
对于所要修饰的蛋白质和所要进行的修饰，已建立的方案可用于分离编码该蛋白质的DNA，和产生编码所需氨基酸改变的突变DNA序列。这类方案包括对含有所要改变的氨基酸的基因区域进行亚克隆。然后将亚克隆的片段用于定点诱变。对于精确的靶位点和所需的修饰类型可使用这种技术。以用于诱变DNA序列的寡聚核苷引物的方法可在最精确的位点将DNA序列中的单个碱基变成其它3种碱基中的任一种。于是，该DNA可编码完全不同的氨基酸(McPherson，M.J.，Directed Mutagenesis，Oxford Univ.Press，NY(1991)；Carter，P.，Biochem.J.237 1—7(1986)；Nickoloff and Deng，Anal.Biochem.220 81—88(1992))。
当选择合适的蛋白质用于苯丙氨酸取代时，应考虑到几个方面。首先，用作食物的蛋白质必须能大量获得。因此，必须获得高水平的表达，并且如果产品容易获得和易于纯化将会具有优势。其次，尽管蛋白质模拟变得越来越精致，但多个氨基酸改变后的结构和功能结果仍是推测的。由于较大的多肽含更多的氨基酸，大小的增大通常反映出苯丙苯酸残基的数目更大，因而需要更多的诱变来取代它们。首先，较小的多肽是更好操作的目标。原则上，可选择细胞内或分泌型蛋白质。然而这一选择受到表达系统选择的限制。
当考虑修饰何种蛋白质时，必须考虑到各种因素，包括蛋白质的结构，生理学和营养学的问题，以及是不是易于从宿主合成细胞中提取该蛋白质。
至于结构方面，蛋白质中氨基酸的相对位置和氨基酸的物理和化学特征控制蛋白质诸如活性，特异性和稳定性的特征。蛋白质的结构与其功能密切相关。一般来说，当使蛋白质的氨基酸及其构象发生改变时，重要是不改变其功能并确保其正确地进行加工以及如果必要话从细胞中分泌出来。
生理学方面取决于所选择的蛋白质特征以及它是一种酶还是一种结构、调节、运输或食物蛋白。一个潜在的问题是突变影响蛋白质的结构和功能特征，以致使宿主细胞或其功能以某种方式遭受损害。
从营养学上来说，蛋白质在化学上需要尽可能完全平衡。因此，在对可能的突变提出任何设想前，必须分析天然蛋白质，根据氨基酸含量，消化率和过敏性评价其营养潜力。
提取的容易性在一定程度上取决于生产方法。这将决定存在何种污染物质并因此使用何种提取方法。
本发明最主要的方面是选择α—乳白蛋白作为修饰对象，充分阐述所有这些变化及其相抵触的考虑来实现本发明。
根据本发明的第一个方面，提供了一个修饰的α—乳白蛋白，与野生型α—乳白蛋白相比，不包含苯丙氨酸残基或包含更少的苯丙氨酸残基。不同于人α—乳白蛋白变异体，其中的Phe—80被赖氨酸取代。
在人乳汁中，α—乳白蛋白是主要的乳清蛋白质，以～2.5g/l的水平存在(占总蛋白质的29％—Heine et al，J.Nutr.121 277—283(1991))。这是一种球形的钙结合蛋白质，相对分子量为14,200，在几乎所有哺乳动物乳汁中都有发现。
α—乳白蛋白营养价值高，其必需氨基酸占总数的63％。牛(Vilotte et al，Biochimic 69 609—620(1987))和人α乳白蛋白(Hallet al，Biochem，J.242 735—742(1987))都含123个氨基酸残基，每个单体仅有4个苯丙氨酸和4个酪氨酸残基。几千年来α乳白蛋白以人、母牛、绵羊、山羊和骆驼乳汁的形式成为我们饮食的一部分。α乳白蛋白的功能是双重的。其主要作用是作为乳糖合成酶系统的一种成份。这一合成酶在泌乳乳腺中合成乳糖。α乳白蛋白以修饰UDP β1，4—半乳糖基转移酶(E.C.2.4.1.22)的底物特异性充当一种更特异性的蛋白酶系统的第二组分。其次，α—乳白蛋白充当一种营养来源。
9种α乳白蛋白序列已被完全测定(Mackenzie and White，adv.in Prot.Chem.41 173—315(1991)；Vilotte et al，Gene 112 251—255(1992))，13种α—乳白蛋白的氨基酸成份已被公开(Mackenzie andWhite，adv，in Prot.Chem.41 173—315(1991))。Acharya等(J.Mol.Biol.208 99—127(1989))于1989年公开了狒狒α—乳白蛋白在1.7下的晶体结构，最近，在1.7下人α—乳白蛋白的晶体结构也已公开(Acharya et al，J.Mol.Biol.221 571—581(1991))。
α—乳白蛋白和C—型溶菌酶从一个共同的前体分化而成，这已被普遍接受(Hall and Campbell，Essays in Biochem.22 1—26(1986)The Biochemical Soc)。
α乳白蛋白是一个相当小的分泌蛋白，它具有4个苯丙氨酸残基。由于它是一种乳潮蛋白质，所以它较理想地适合于在转基因哺乳动物乳腺中表达，正如在下面所描述的，选这种乳腺作为表达系统。α—乳白蛋白完全适合于满足上面讨论的结构，生理，营养和可收获性方面的需要。
在结构上，人和牛成熟蛋白质4个苯丙氨酸残基分别在3，31，53和80位置及9，31，53和80位置。对这两种蛋白质的蛋白质工程研究表明根据其大小和空间，原则上几乎任一残基都可用来代替苯丙氨酸。然而，Phe—31和80位置分别涉及乳糖合成酶反应和钙结合环，因此当考虑对这些位置进行合适的取代时必须更加小心。
已知α—乳白蛋白可与其它种类的半乳糖基转移酶一起发挥功能(Khatra et al，Eur.J.Biochem 44 537—560(1974)；Powell andBrew，Biochem.J.142 203—209(1974))。
在营养学上，在选择合适的蛋白质进行修饰时应考虑3个方面氨基酸含量、可消化性和抗原性。由于这种食物将供婴儿及成年人食用，所以其营养质量和必需氨基酸水平必须尽可能高。一般来说在乳汁蛋白质中，必需氨基酸占酪蛋白的51.4％，占全中乳汁蛋白质的52.5％及占牛乳清蛋白质的58.8％。然而，在α—乳白蛋白中，必需氨基酸占总数的63.2％(Heine et al，J.Ntr.，121 277—283(1991))。更重要的是，α—乳白蛋白具有高含量的赖氨酸和半胱氨酸和特别高含量的色氨酸(占总氨基酸的5.9％)。测量体内的真实可消化性存在一些问题，然而通常可进行的研究表明α—乳白蛋白的可消化性与酪蛋白一样高且比β—乳球蛋白(BLG)更好。主要的牛乳清蛋白质BLG在人乳汁中没有发现，并且认为在易感性人群中它是一种潜在的抗原。牛α—乳白蛋白与人α—乳白蛋白非常相似且这些相似性预期可能减少牛α乳白蛋白的抗原性。与其它乳汁蛋白质相比，这似乎是正确的(Goldman，A.S.，Pediatrics 32 425—443(1963)；Strobel，S.，Hum.Nutr.Appli.Nutri.40A(1)45—54(1986))。
苯丙氨酸减少的或无苯丙氨酸的α—乳白蛋白产品可优选在泌乳的转基因动物乳腺中生产，其中的天然蛋白质可能仍然存在。这可能使纯化变得困难，除非氨基酸的取代本身改变了蛋白质的特性。然而，在泌乳动物乳汁中，修饰的α乳白蛋白及其表达的特殊优势是如果泌乳动物天然α—乳白蛋白的表达相对于修饰过的α乳白蛋白表达而言非常低，或者天然或野生型形式的表达被阻止或抑制时，从天然α—乳白蛋白中纯化可能是不必要的。通过使用胚干细胞使泌乳动物转基因可达到阻止或抑制天然形式表达的效果。如果需要纯化且为了维持蛋白质的结构必须进行保守的改变时，一种可能性是附加额外的氨基酸序列、如在C末端加一个尾巴(Smith et al，Gene 32 321—327(1984))以利于纯化。额外的氨基酸序列应具有1种或多种导致蛋白质更易于分离的特征；例如，额外的氨基酸序列可以使蛋白质根据电荷被分开。Poly—Arg或poly—Arg/Lys尾巴可改变电荷并足以获得更有效和更廉价的提取。
考虑到其它乳汁蛋白质(如酪蛋白)的苯丙氨酸含量，在实际操作中很可能与对天然α乳白蛋白的例子一样，优选从这类蛋白质中至少部分纯化出修饰的α—乳白蛋白。
本发明在改善PKU患者饮食中蛋白质成份的可口性及其应变性方面特别有用。这可通过选择合适的，命名为α—乳白蛋白的蛋白质来实现，它能达到具有高度营养价值及能解决上面所讨论的所有问题的标准。然后克隆编码该蛋白质的DNA，突变以去掉至少一些(但优选全部的)苯丙氨酸残基，在能大量生产使足以供应世界市场的系统中表达。
用作修饰基础的α—乳蛋白分可来源于任何合适的动物。优选人和泌乳动物，如母牛，绵羊，山羊和骆驼。起源于人或牛的α—乳白蛋白很可能是最佳的。两者都具有相似的营养价值且人类利用它们已有几千年。
牛或人α乳白蛋白特别适合于用作突变修饰的起点，因为人们类习惯于吃这两种蛋白质，并且它们非常相似，在氨基酸水平上有72％的同源性。依赖于结构和/或营养方面的考虑，用一种或几种氨基酸取代一些或全部苯丙氨酸残基。可进行选择的优选的氨基酸如表2所示。在4个苯丙氨酸位置中的任何一个上，可用这些氨基酸的任何一种组合进行取代。优选在所有这些位置进行取代，尽管本发明也覆盖在一个位置进行的取代，但在其中3个或2个位置上失败。
表2优选的苯丙氨酸取代人类牛Phe 3/9 Tyr，Leu，Arg，Met，TrpTyr，Ser，LeuPhe 31Leu，Ile，Trp，Tyr Leu，Ile，Trp，TyrPhe 53Tyr，Leu，Met，Trp Tyr，Leu，Met，TrpPhe 80Tyr，Met，Trp，Leu Tyr，Met，Trp，Leu如果取代氨基酸的选择仅仅是根据能量最小化和结构方面的考虑，那么Tyr3—Leu31—Tyr53—Tyr80人α乳白蛋白和Tyr9—Leu31—Tyr53—Tyr53—Tyr80牛α乳白蛋的是优选的(或具有比四位取代更少的取代突变体)。如果也考虑到营养需要，那么Tyr3/9—Tyr31—Tyr53—Tyr80人和牛α—乳白蛋白(或具有比四位取代更少的取代突变体)是选定的突变体。决定最佳取代的进一步的方法是看在其它种类α—乳白蛋白和在脊椎动物溶酶体中占据相应位置的氨基酸，因为检查公众可进入的数据库表明α乳白蛋白和脊椎动物种类的溶菌酶具有非常相似的结构并认为它们起源于相同的祖先基因，根据这些资料，优选Tyr3-Tyr31-Leu53-Leu80人α乳白蛋白(或具有比四位取代更少的取代突变体)。
可以取代一些或全部苯丙氨酸，为了结构的目的，可优选它们中的一个或多个不变。如果不进行任何结构方面的考虑，可取代至少一个、2个，3个或4个天然苯丙氨酸残基，取代数越多越优选。已知存在Phe80被赖氨酸取代的人α乳白蛋白的天然变异体(May-nard，F.，J.Dairy Res.59 425—429(1992))；这一变异体本身不是本发明的一部分，尽管它可用于下面将讨论的本发明的配方和方法中。
为了帮助纯化，可对α—乳白蛋白进行进一步的修饰，例如，可在该蛋白质的C—末端加上一个poly—Ary或Arg/Lys尾巴。这将改变该蛋白质的电荷并可对它进行相当廉价的大量纯化。它还具有改进该蛋白质营养品质的优势。
可以经重组DNA技术，使用现在称作蛋白质工程的一套技术来生产本发明的修饰的α乳白蛋白。
从Brookhaven数据库可获得狒狒α—乳白蛋白的等同物(co-ordinates)(Acharya et al，J.Mol.Biol.208 99—127(1989))。人蛋白质和母牛蛋白质的等同物目前还不能得到，但认为狒狒蛋白质的三维结构可给人和牛野生型和突变型α—乳白蛋白的模拟提供可接受的模板。
首先可在氨基酸类型水平考虑置换一个氨基酸的影响。因此，芳香族化合物应代替芳香族化合物，电荷代替电荷，形状代替形状等等。
第一步是测定在天然假定的三维结构中4个Phe残基中每个残基的状态。它们是Phe—3(人)或Phe—9(牛)在分子表面；Phe—31暴露于表面；Phe—53在分子内部腔中，Phe—80大部分被包埋。方便的是这4个残基完全分离，以致有理由假定如果导入的改变大部分保守，那么在这些位点间的相互作用可能很小。
建立的模型表明，基本上任一残基都可取代Phe—3/9和31，因为两者都在分子表面。两个包埋的Phe残基可用使周围蛋白质活动很小的残基代替。而且，Leu和Met可用于代替Phe，但极性或带电基团很可能破坏基结构，因此优越性较差。
可从文献得到一些指导，但它们并不是专用于α—乳白蛋白或本发明的目的(如Bordo和Argos(J.Mol.Biol.217 721—729(1991))，Lesk和Bosevell(Curr.Opih.Struct.Biol.2242(1992))，Singh和Thornton("Atlas of Protein Side—Chain Interactions".Vols 1and 2，IRZ Press.Oxford，England(1992))，和计算机程序(例如TriposAssociates的程序SYBYLTM))，这些指导在评价可能需要进行的任一其它修饰时可能是有用的。
下面的描述对该位置进行了小结3位是表面残基，可接纳大多数残基Tyr，Leu，Arg.Met.Trp(按相对能量逐步增加的顺序)，最优选的是Tyr。
9位是表面残基，可接纳大多数残基。大多数α—乳白蛋白在这一位置有一个Ser.选用的残基为Tyr.Ser.Ile。
31位暴露于表面，因此可接纳任一残基。然而，这一区域对乳糖合成酶反应是重要的且疏水相互作用可能是重要的。因此，如果保留活性较重要的话，此处最优选Leu和可能是Ile，然后是Trp。
53位大部分被包埋，Tyr.Leu，Met.Trp是按能量逐步增加的顺序。
80位完全被包埋。Tyr，Met，Trp，Leu是此处的顺序。此处是钙结合环区域，因此，此处的改变可能很重要。Tyr是最相近的同形态残基。
C端位于表面，因此相当暴露。在此处加入一些残基可能对其结构没有明显的影响，但能改进其分离特征。
可以在人、牛或其它α—乳白蛋白中使用这些所建议的取代的任一组合。
尽管在原则上根据本发明的修饰的α—乳白蛋白可以用任何方法(包括化学合成)制备，但一般选择的方法包含重组DNA技术的使用，其中蛋白质从相应的核酸序列表达。
根据本发明的第二个方面，提供了一种制备上面所述的修饰的α—乳白蛋白的方法，该方法包含将连续的氨基酸耦联在一起，和/或连接寡—和/或多—肽。为了优选，正如上面所预示的，将连续的氨基酸耦联到一起优选以核糖体进行介导。现在，许多表达方法学在本领域的技术人员充分掌握的一般知识范围之内。特别是Sambrook等的《分子克隆》第2版，冷泉港实验室出版(1989)可提供参考。
在这类表达中有用的核酸本身形成本发明的一部分。根据本发明的第3个方面，提供了一种分离的或重组的核酸，它编码与野生型α—乳白蛋白相比不包含苯丙氨酸残基或苯丙氨酸残基较少的修饰的α—乳白蛋白。
考虑到遗传密码子的简并性，许多不同的核酸序列可编码本发明的任一特定的蛋白质。所有这些序列都包含在本发明的范围内，尽管在实际上优选下列核酸序列(a)其密码子尽可能与野生型基因的密码子相对应；(b)其密码子的选择与表达宿主的优选密码子一致；或(c)其密码子根据标准(a)和(b)折衷进行选择。
根据本发明的编码修饰的α—乳白蛋白的重组DNA既不局限于cDNAs也不局限于编码修饰的蛋白质的天然基因组序列，尽管这些序列可能是优选的。可以使用WO—A—9005188的“小基因”方法，其中存在于天然基因的一些(但不是全部)内含子存在于构建体中，并将它导入宿主细胞。
根据本发明的这一方面，重组DNA常是一种载体形式。本发明并不局限于任一特定的载体形式，例如，它可以是质粒，粘性质粒或噬菌体。含有与编码修饰的α—乳白蛋白序列有效耦联的足够的调节序列(包括启动子)的载体在作为表达载体时是有用的。不包含有效耦联的调节序列的载体在作为克隆载体时是有用的。
根据本发明的重组DNA也可以是适用于制备转基因动物的构建体形式，例如经微注射或经同源重组导入动物的构建体。
本发明的第4个方面是将连续的核苷酸耦联到一起和/或将寡—和/或多聚核苷连接起来制备本发明的核酸，该方法完全在本领域的技术人员知识范围内。
根据本发明的第5个方面，提供了一种含有上面所述重组DNA的宿主。该宿主可以是一种克隆宿主，其中通常是一种细菌，如大肠杆菌，或者也可以是一种表达宿主。在表达宿主中，编码修饰的α乳白蛋白的DNA可以有效地与用于表达的足够的调节序列(包括启动子)耦联而且该宿主允许以组成型或在调节条件下进行表达。在本发明中可使用大范围的表达宿主，包括细菌(特别是E.coli)，酵母(如Saccharomyces cerevisiae，Hansenula polymorpha和Pischia pas-toris)，昆虫细胞(如Spodoptera frugiperda)和哺乳动物细胞系(如BHK和CHO细胞系)。尽管如此，最优选的表达宿主是动物，特别是非人类的胎盘哺乳动物，其种系中包含编码修饰的α乳白蛋白的DNA，该种系的成年雌性能在乳腺中表达修饰的α—乳白蛋白以便在其乳汁中积累修饰的α—乳白蛋白。如果修饰的α—乳白蛋白来自与宿主动物不同的种类，该转化的宿主严格地说是转基因动物；例如携带编码修饰的人α—乳白蛋白的DNA的母牛或公牛是人基因的转基因动物。尽管如此，根据本发明，并不是所有宿主动物都是转基因动物，由于它完全在本发明的可能性范围内并且在某些情况下，优选提供一种给定种类的宿主动物(例如牛)，它携带编码相同种类的修饰的α—乳白蛋白(在该例子中是牛α乳白蛋白)的DNA。经过对已经形成的并将继续发展的用于制备转基因动物的技术进行常规修改或经过基因治疗技术(该技术的形成用于以另一基因版本取代或补充一个基因版本)可制备这类“类似转基因”动物。
乳腺表达系统具有高表达水平，低花费，正确加工和易获得的优点。一些工作者已从泌乳的转基因动物中生产出牛和人α—乳白蛋白(Vilotte et al，Eur.J.Biochem.186 43—48(1989)；Hochi etal，Mol.Reprod and Devel.33 160—164(1992)；Sozdier et al，FEBSLetters 297(1，2)13—18(1992))并已显示出生产高水平的蛋白质。对于泌乳的乳腺(WO—A—8801648)而言，α—乳白蛋白启动子能指导异源基因的表面(Stinnakre et al，FEBS Letters 284(1)19—22(1991))。
其它的转基因动物，包括在成年雌性乳汁中表达异源性蛋白质的转基因哺乳动物已在文献中描述。例如，WO—A—8800239和WO—A—9005188描述了转基因哺乳动物的生产，如绵羊、它能表达药用上有价值的蛋白质，包括因子IX和α—抗胰蛋白酶。所有上面列出的方法学和其它出版物都可进行修改以生产根据本发明的转基因或类似转基因的动物。在本发明中优选使用已知的泌乳动物(例如母牛，绵羊，山羊或甚至是骆驼或猪)作为宿主，但宿主的选择首先取决于是否便利，而不取决于本发明本身的任一要求。
根据本发明的转基因动物或其它宿主可用任一便利的方法来制备。因此，本发明并不局限于用于其制备的任一特定的方法。例如，可按上面WO—A—8800239和WO—A—9005188所述以微注射制备转基因动物、或以胚干细胞技术制备它们(如在WO—A—9003432中所述)。
宿主中野生型α乳白蛋白基因的表达应进行阻止或至少使减弱，以便简化纯化。
根据本发明的第6个方面，提供了一种适用于高苯丙氨酸血患者的食品，该食品包含至少一种与野生型α—乳白蛋白相比不含苯丙氨酸残基或苯丙氨酸残基更少的修饰的α—乳白蛋白。
修饰的α—乳白蛋白优选的特征如上所述。
该食品可以(且通常是)包含其它成份。修饰的蛋白质单独或与L—氨基酸和/或其它低或不含苯丙氨酸的蛋白质或多肽组合将适用于患PKU的婴儿，儿童和成年人。对于婴儿和非常年幼的儿童，以低或无苯丙氨酸的α—乳白蛋白作为蛋白质基础的配方看起来和尝起来应更象正常完全蛋白质的婴儿配方，并且因此应比通用的蛋白水解产物或氨基酸混合物的特殊饮食配方更易耐受。
根据本发明用于婴儿和非常年幼的儿童的含修饰的α—乳白蛋白的特殊饮食食品或补充物可含其它成份，如脂肪源，碳水化合物源和适出水平的维生素，无机物以及其它营养因子。除了修饰的α乳白蛋白外，额外的氮源还可以时任何L—氨基酸(如L—酪氨酸)，加入后可改进产品总的必须氨基酸质量，使其营养充足。在任何情况下，终产品总的苯丙氨酸含量一般不超过80mg，优选不超过25mg/100g粉米等价物，或者无苯丙氨酸。任一低Phe或无Phe多肽，如为源于酪蛋白的多肽(CDP)(来自干酪加工过程，凝乳酶(粗制凝乳酶)分解乳升蛋白质(α—酪蛋白)并将CDP释放到乳清部分中)也适合于作为额外的氮源以提高得到的氨基酸图谱总的品质。也可以加入L—酪氨酸和非必需氨基酸，加入的量达到在人乳汁和正常儿童饮食中的量和/或比这一量更高以保证营养充分。
含修饰的α乳白蛋白用于婴儿和年幼儿童的特殊饮食食品或添加物可以是可立即食用的液体，或以粉末或浓缩液体的形式，经加水和搅拌变成立即食用的形式。每100ml(60—75kcal/ml)立即食用的液体配方或重配粉末一般含1.2到3.0g，优选大约1.3到1.5g蛋白质；2.2到4.0g，优选大约3.6g，脂肪或脂肪混合物；以及6到9g碳水化合物。
对于大多数婴儿，乳糖一般是优选的碳水化合物源，但玉米固体糖浆，蔗糖或其它糖也可用于患PKU的婴儿和年幼儿童的特殊饮食食物中。
另外，含修饰的α—乳白蛋白作为低Phe或无Phe蛋白质源的特殊饮食食品一般含无机物以提供营养学上可接受量的钙，磷，钾，钠，氯，镁，铁，铜，锌，锰，钼，硒，铬，氟和碘，并加上足够量的维生素，如维生素A，D，E，B1，B2，B6，B12，C，尼克酰胺，泛酸，叶酸，维生素K，生物素和胞碱。还应加入其它的营养因子如胡萝卜素，中磺酸，肌醇，肉毒碱和核苷酸。
包含在特殊饮食食品中的上述每种营养成分量和其可接受的化学形式在下列法典中提供美国联邦管理法规(181—184部分)和1980年的美国婴儿配方条例，美国联邦食品、药物和化妆品条例第2部分，第IV章，第192部分，1980年9月26日制定的，1985年10月7日修订的公众法96—359。
由EC委员会对婴儿配方和其它配方的指令(欧洲共同体官方杂志，No.L 175/35，1991)和营养药典委员会建议的婴儿和儿童食物国际标准提供了相似但不精确的建议。结合FAO/WHO食品标准纲要，CAC/RS，72/74，1967。表了显示了建议的最小值、最大值和优选值。
表3
表3
表3(续)<
<p>*根据66.67 Kcal/100ml计算因此，对于婴儿和非常年幼的儿童，理想的特殊饮食补充还应类似于人乳汁，除了其苯丙氨酸含量应不超过80mg/100g配方或固态物。在整个婴儿期，儿童期和青春期坚持低苯丙氨酸饮食治疗是绝对必要的。日需求量如下面表4所示表4
表4
*所有已知的必需氨基酸(除苯丙氨酸外)，必需脂肪酸，无机物和维生素应供给足够量。
**取自健康与疾病的现代营养M.Shils，V.Young编辑；1988年，第7版，Lea和Febiger费城。
大龄儿童、青少年和孕妇的饮食，特别是患PKU的食谱应含有低Phe或无Phe配方，其加入量应超过低苯丙氨酸食物总热量值的50％。这一配方可特别设计成适用于每个年龄组，即考虑具有建议的日摄入量，或形成一种通用的配方并附有特别用途说明且对每个生物类别稀释度不同。这种配方不同于婴儿和非常年幼儿童的配方，在大约500—1000kcal或500—1000ml中含有下列RDI水平(近似值)的营养成分，如表5所示。
表5
表5
对于儿童和成年人(包括孕妇)而言，特别饮食补充配方的目标是使配方具有可口性且是饮食中令人回味的高质量成份。这一配方应含有所有必需氨基酸(除苯丙氨酸外)和维生素及无机物，特别是那些在低蛋白食物(如水果和蔬菜)中一般含量不高的维生素和无机物。这些营养成份(除蛋白质外)是钙，铁，叶酸，镁和微量无机物。
用于患PKU的儿童，成年人和孕妇的典型配方含有但不局限于下列优选的营养成份范围，如表6所示。
表6
表6<
<p>低苯丙氨酸或无苯丙氨酸的α—乳白蛋白也非常适合于加入乳汁饮料中，供PAH缺陷的大龄儿童，孕妇，青少年和成年人使用。
作为选择，这种修饰的α—乳白蛋白或含修饰的α乳白蛋白的饮食食物补充可用于食物中如面包、冰淇淋和糖霜混合物，作为功能性蛋白来源，它们还可以不含苯丙氨酸，或至少是苯丙氨酸含量减少。
上面所述的转基因动物或类似转基因宿主动物的乳汁根据本发明经过进一步修饰或不修饰可适用于作为食品，尤其是当宿主野生型α—乳白蛋白基因的表达减弱或受阻止时的乳汁。对修饰的蛋白质的进一步加工包括去掉用于调节或其它用途的氨基酸尾巴，例如，在其加入配方中前进行加工。
根据本发明的第7个方面，提供了供高苯丙氨酸血患者取食的方法，该方法包含给高苯丙氨酸血患者提供一种或多种食品，该食品中含有比野生型α乳白蛋白苯丙氨酸残基更少的修饰的α乳白蛋白。
而且，修饰的α乳白蛋白优选的特征如上面本发明的第一个方面有关内容所述。
该食品优选的特征如上面本发明的第二个方面有关部分所述。更普遍地，本发明每个方面的特征按其它各方面的需要，并在细节上已作必要的修正。
服用的剂量和时间由患者自己斟酌处理，但一般遵照医生，营养学家或其它医学顾问的指导。
本发明用下面非限制性的实施例来说明。在实施例中提到了一些附图，其中
图1在实施例1中讨论，显示了人α乳白蛋白基因的2个重迭的基因组λ克隆的限制性图谱。
图2在实施例1中讨论，显示了人α乳白蛋白转基因构建体。
图3在实施例1中讨论，显示了人α乳白蛋白转基因小鼠与非转基因小鼠脱脂乳的SDS—PAGE分析。
图4在实施例1中讨论，显示了人α乳白蛋白转基因小鼠乳汁与人α乳白蛋白标准品的蛋白印迹。
图5在实施例2中讨论，显示了牛α—乳白蛋白PCR引物的序列。
图6在实施例2中讨论，显示了牛α乳白蛋白PCR引物和产物的位置。
图7在实施例3中讨论，显示了用于诱变的牛α乳白蛋白PCR引物的序列。
图8在实施例4和5中讨论，显示了用于Phe取代的PCR方案和用于转基因构建体PKU1到4的克隆方案。
图9在实施例4中讨论，显示了PKU1到4转基因小鼠乳汁与对照小鼠乳汁及牛α乳白蛋白标准品的Western分析。
图10在实施例4中讨论，显示了以Western印迹分析2个PKU1转基因小鼠品系的乳汁与牛α—乳白蛋白标准品稀释液来进行定量。
图11在实施例5中讨论，显示了Phe取代的PCR方案和转基因构建体PKU5和PKU1K的克隆方案。
图12在实施例6中讨论，显示了用于牛α—乳白蛋白和在COS细胞中表达的PKU5到10构建体的克隆方案；
图13在实施例6中讨论、显示了用pC—BOVA和pC—PKU5至10构建体转染的COS细胞上清液的免疫沉淀物质的放射自显影。
实施例1人α乳白蛋白在转基因小鼠中的克隆和表达人α乳白蛋白基因的克隆人α乳白蛋白的DNA序列已公开(Hall et al.，Biochem.J.242735—742(1987))。使用人的序列，设计PCR引物，从人基因组DNA中克隆出2个小片段，一个在该基因的5’端，另一个在其3’端。将它们亚克隆到pUC18载体上并用作探针筛选商品(Stratagene)λ基因组文库。用已建立的方法分离出2个含α乳白蛋白基因的重组噬菌体(4a和5b.l)(Sambrook et al.，《分子克隆》第二版，冷泉港实验室(1989))。限制性图谱表明两个克隆都含有α乳白蛋白基因的全部编码序列，但区别在于存在的5’和3’序列量不同(图1)。
对克隆5b.1处显子的序列分析和克隆4a的部分测序表明这些克隆与公开的序列相同。
转基因构建体(图2)pHA—1由人α乳白蛋白编码区，来自以7kb EcoRI/SalI片段克隆到pUC18上产生的1克隆5b.1的～1.8kb的5’侧翼和3kb的3’侧翼组成。
poBHA(绵羊β—乳球蛋白，人α乳白蛋白)由4个DNA片段构建(1)4.2kg SalI/EcoRV片段，含有绵羊β—乳球蛋白启动子(WO A—9005188)；
(2)74bp合成的寡聚核苷酸，与8bp的BclI连接物和人α乳白蛋白的序列的碱基15—77相对应，用作平头BglI片段；(3)来自1克隆4a的6.2kg BglI/PstI人α—乳白蛋白的片段，包含碱基77处的BglI位点与3’侧翼XhoI位点之间的区域；(4)用PstI和SalI剪切的pSL1180(Pharmacia)人α乳白蛋白在转基因小鼠中的表达命名为pHA—1(含人α乳白蛋白基因和侧翼区)和pOBHA(含有由绵羊β乳球蛋白启动子控制的人α乳白蛋白基因)的两个构建体注射到小鼠胚中，并养育成转基因动物。
人α—乳白蛋白在这些小鼠乳汁中的表达水平范围从不可检测到～3mg/ml。表7列出了转基因蛋白质相对量的小结。使用以考马斯蓝染色的SDS—PAGE，等电聚焦，以商品抗人α乳白蛋白的抗体(Sigma)观察Western印迹和层折聚焦分析取自这些动物的脱脂乳。这些分析的结果表明与人α—乳白蛋白标准品(Sigma)相比，转基因蛋白质具有恰当的大小，pI和抗原性。
图3和4显示了几只小鼠的结果。图3显示了脱脂的转基因小鼠乳汁与未转基因对照小鼠乳汁的SDS—PAGE分析。图4显示了这些乳汁与人α乳白蛋白标准品的Western印迹。
表7转基因小鼠汁分析小鼠 考马斯蓝 Western印迹205.19 pHA1 - -204.10 pHA1 ++++204.7pHA1 +++ +++230.15.3 pHA1 +++ n.d.230.15.5 pHA1 +++ n.d.230.15.6 pHA1 +++ n.d.230.21.5 pHA1 +++ n.d.230.21.1 pHA1 ++n.d.235.15 OBHA - n.d.235.19 OBHA ++++236.6OBHA ++++234.1OBHA + +234.4OBHA ++++234.14 OBHA + +(表7显示了经过在考马斯凝胶和Western印迹上与蛋白质标准品进行比较估计出的在转基因小鼠乳汁中人α—乳白蛋白的相对水平。
-＝＜0.5mg/ml+＝～0.5-1mg/ml++ ＝～1-2mg/ml+++ ＝～2-3mg/mln.d.＝未检测)实施例2牛α乳白蛋白在小鼠中的克隆和表达克隆中α乳白蛋白在牛α乳白蛋白中有3种已知的变异体，其中B型是最普遍的一种。来自Bos(Bos)nomadicus f.d.indicus的A变异体与B变异体的区别在残基10上A中的Glu取代成B中的Arg。与来自Bos(Bibos)javanicus 的C变异体的序列区域尚未获得(McKenzie &White，Advances in Protein Chemistry 41 173—315(1991))。
使用图5所示的PCR引物从基因组DNA中克隆牛α—乳白蛋白基因(编码N型)>下面SEQ ID NOs列出了这些引物。
Ba-2SEQ ID NO1Ba-7SEQ ID NO2Ba-8SEQ ID NO3Ba-9SEQ ID NO4在所有PCR反应中，DNA来源是Holstein—Friesian母牛血液。
使用引物Ba—7与引物Ba一8结合扩增的启动子区长度是2.05kb。将这一BamHI/EcoR片段克隆到Bluescript(pBA—P2)上。
使用引物Ba—9与引物Ba—2结合扩增包含300bp3’侧翼区的全部牛α乳白蛋白基因。这些引物包含BamHI限制性酶识别位点，该位点允许将扩增的3kb片段直接亚克隆到pUC18的BamHI位点上，产生构建体pBA—G3。
将来自克隆pBA—P2的BamHI/EcoRV片段连接到BA—G3的EcoRV/BamHI片段上，产生构建体pBA(图6)。
由于Taz聚合酶缺乏校正活性，因此保证扩增的牛α乳白蛋白DNA与公开的牛α乳白蛋白基因相同必要的。对所有外显子和2个启动子片段进行了序列分析。比较牛α乳白蛋白外显示子与Vilotte所公开的序列显示出3处改变(1)在外显子I的＋759位C变为A；5’非编码区。这一改变已有报道(Hoehi et al.，Mol.Reprod.and Devel.33 160—164(1992))。
(2)在外显子I的＋792位CTA变为CTG；两者都是亮氨酸的密码子。
(3)在外显子II的＋1231位GCG变为ACG；由丙氨酸变成苏氨酸。这是该蛋白质更普遍的B形式的象征。
尽管在PCR扩增过程中不能排除序列的错读，但上面的错配序列很可能是由于牛DNA的来源不同而产生的。牛α乳白蛋白在转基因小鼠中的表达将pBA构建体(图6)注射入小鼠胚胎并养育出9只转基因动物。按实施例1所述进行乳汁分析。经考马斯蓝染色的SDS—PAGE凝胶分析并与α乳白蛋白标准量进行比较表明表达水平范围从检测不出到～0.5—1，g/ml。
实施例3定点诱变PCR引物的SEQ ID NOs设计下列SEQ ID NOs作为PCR引物，用于本实施例和随后的实施例中PKU-1SEQ ID NO5PKU-2SEQ ID NO6PKU-2L SEQ ID NO7PKU-3SEQ ID NO8PKU-4SEQ ID NO9PKU-5SEQ ID NO10PKU-6SEQ ID NO11PKU-7SEQ ID NO12PKU-8SEQ ID NO13PKU-9SEQ ID NO14PKU-10 SEQ ID NO15取代Phe残基牛α乳白蛋白的4个苯丙氨酸(Phe)残基出现在该基因的前3个外显子中。
根据蛋白质模拟，营养学方面，存在于不同种类的天然α乳白蛋白或溶菌酶基因的氨基酸变异体设计用于Phe取代的一套7个寡核苷酸(PKU—PCR引物1，2，2L，3，4，7和8)。这些引物的序列(与编码链或非编码链互补)，预期的氨基酸变化和每个诱变点如图7所示。这些寡核苷酸充当PCR引物和诱变引物。PKU引物1与2或2L结合使用，7与8结合使用，产生含前2个Phe取代的435bp扩增片段(A)。PKU引物3和4或者9和10产生含后2个Phe取代的601bp的PCR产物(B)(见图8)。
分别使用位点EcoRI/BamHI和BamHI/XbaI亚克隆PCR产物进行测序。PvuI位点(已被改造成PKU引物2，2L，3，7和8)在氨基酸31和氨基酸53之间产生单一的限制性位点而不改变该区编码的氨基酸。C末端的氨基酸尾巴在α乳白蛋白基因C端加入额外的氨基酸能寿命从由源性α乳白蛋白蛋白蛋白质中进行分离。目的在于测定增加的氨基酸是否影响转基因的表达。Poly—Arg尾巴引物PKU—5和6(见图7和8)用于扩增牛α乳白蛋白基因的3’端以产生0.44kb的PCR产物C。引物PKU6含6一个Arg残基的编码区，紧接牛α乳白蛋白序列最后一个天然的Leu氨基酸之后并产生单一的SalI和SnaBI位点。单一的SalI/SnaBI位点可被消化并插入连接物以产生所需任意长度的poly—Arg或poly—Arg/Lys尾巴。天然的终止密码子随后是～30bps的3’序列，并以BspMI限制性酶位点结尾。
实施例4牛α乳白蛋白构建体在体内的组装和表达在转基因动物乳腺中表达的构建体共制备了5个构建体具有poly—Arg尾巴的天然牛α乳白蛋白基因(pNARG—H)和2个带有和不含poly—Arg尾巴的突变的牛α乳白蛋白基因(PKU—1至PKU—4)。在这些构建体中的Phe突变体以蛋白质模拟和营养学方面为基础。构建体的设计在图8中列出。
从5个DNA片段构建pBARG—H(1)来自pBA，SstI到HpaI的2.04kg的片段；(2)来自pBA，HpaI到HindIIII的1.25kg的片段；(3)来自PCR产物C HindIII到BspMI的0.44kb的片段；(4)来自pNA BspMI到BglII的0.51kb的片段；(5)用SstI和Bg1II消化的载体pSL 1180。
从6个DNA片段构建PKU—1(1)来自pBA SstI到HpaI的2.04kg的片段；(2)来自PCR产物A(PKU引物对1和2)HpaI到PvuI的0.46kb的片段。
(3)来自PCR产物B(引物对3和4)PvuI到BsaBI的0.60Kb的片段；(4)来自pBA BsaBI到HindIII的0.22kb的片段；(5)来自pBA HindIII到BglII的0.95kb的片段；(6)用SstI和BglII消化的载体PSL 1180；
PKU—2以与PKU—1相同的方式构建，除了其中的片段5来自pBARG—H并含有poly—Arg尾巴。
PKU—3以与PKU—1相同的方式构建，除了片段(2)(PCP产物A)使用PKU引物1结合2L进行扩增。
PKU—4以与PKU—3相同的方式构建，除了片段(5)来自pBARG—H并含有poly—Arg尾巴。
上述诱变产生的氨基酸取代及其质粒PKU—1到PKU—4在表8中显示。
人α乳白蛋白3’侧翼区来自λ克隆4a(图1)的9.3kb BamHI片段含人α乳白蛋白基因的3’侧翼区并在所有PKU构建体中都包括，它作为转基因胚植入前筛选的合适的靶。该9.3kb的片段插入到在所有上述构建体中都存在的单一BglII位点上(见图8)。
经过用BamHI剪切从载体序列上消化出用于显微注射的DNA。用于显微注射的DNA的制备和转基因小鼠的生产按公开的方法进行(Hogan et al.，"Manipulating the Mouse EmbryoA Laboratary Man-Hal"，Cold Spring Harbor laboratory Press(1986))。表8在转基因构建体中出现的氨基酸取代取代 Arg尾巴 人3’侧翼质粒位置 930 53 80Tyr，Tyr，Tyr，Tyr- + pPKU-1Tyr，Tyr，Tyr，Tyr+ + pPKU-2Tyr，Leu，Tyr，Tyr- + pPKU-3Tyr，Leu，Tyr，Tyr+ + pPKU-4Wild type + + pBARGh无苯丙氨酸的牛α乳白蛋白在转基因小鼠中的表达转基因建立者动物在产后第10天分泌乳汁，并对其乳汁进行Western Blots分析(见图9)。全部构建体(野生型牛α乳白蛋白pBARG—H和4个诱变的牛α乳白蛋白构建体(KU1—4))都能在乳汁中表达并分泌中α乳白蛋白蛋白质。上面较强的带(见图9)很可能是糖基化变异体形成的，它也存在于pBARG—H中(资料未显示)。表9显示了这些转基因小鼠乳汁中无苯丙氨酸牛α乳白蛋白蛋白质的相对量。为进行蛋白质定量，对乳汁样品的系列稀释液进行Western Blots并与牛α—乳白蛋白标准品进行比较。图10显示了对PKU—1转基因小鼠样品使用这一程序。
结合已建立的技术(如ELISA、PI、测序和圆二色性)对蛋白质进行进一步的分析。用这些方法试图了解该蛋白质的大小和电荷及折叠情况。
表9PKU1—4在转基因小鼠乳汁中的表达构建体 在转基因乳汁中的α乳白蛋白蛋白质pBARG-H0-0.50mg/mlPKU-1 0-0.25mg/mlPKU-2 0-0.50mg/mlPKU-3 0-0.10mg/mlPKU-4 0-0.50mg/mlRNA分析
使用牛α乳白蛋白的特异性探针对转基因乳腺总RNA进行Northern印迹分析。正如所预期的，全部具有可检测的重组蛋白质水平的动物样品都表现出牛α乳白蛋白mRNA表达。在mRNA量与存在的转基因蛋白质之间没有明确的相关性。
为了证实表达的蛋白质来自于突变的α乳白蛋白基因，以RT—PCR方法克隆提取RNA中存在的牛α乳白蛋白mRNA并测序。结果证实从PKU1—4构建体中转录出mRNA，因此翻译的蛋白质应是无苯丙氨酸的。
实施例5在人α乳白蛋白启动子控制下诱变的牛α乳白蛋白在体内的表达实施例1，2和4的资料表明人α乳白蛋白转基因的表达与天然牛α乳白蛋白转基因相比相当高，这反映了内源性中和人基因表达水平的差异。由于这可能归因于5’控制区的差异。因此用人α乳白蛋白基因的序列取代牛α乳白蛋白的转录起始位点的5’区。
制备了2个构建体，命名为PKU—5和PKU—1H，其中掺入的氨基酸取代如表10所示。构建体的设计在图11中列出。
PKU—5在第一克隆步骤中，将3个片段亚克隆到pUC18的EcoRI/BamHI位点上(1)使用PKU引物7结合8经PCR扩增得到的EcoRI到PvuI片段(片段A、图11)；(2)使用PKU引物9和10经PCR扩增得到的PvuI到BsaBI的片段(片段B，图11)。
(3)来自pBA的BsaBI到HindIII的片段。
最终构建体包含6个DNA片段(1)来自N克隆4a(图1)含人α乳白蛋白启动子的SalI到KpnI的3.7kb的片段；(2)合成的152bp的寡核苷酸，包含从KpnI位点到AVG的人α乳白蛋白序列和从AUG到HapI位点的牛α乳白蛋白序列；(3)来自第一亚克隆步骤的HpaI到HindIII的1.25kb片段；(4)来自pBA从HindIII到BglII的0.95kb片段；(5)来自λ克隆4a(图1)的人α乳白蛋白基因3’侧翼从BamHI到XhoI的3.7kb片段；(6)用SalI和BamHI剪切的Bluescript KS—载体。
PKU—1H以与PKU与相同的方式构建，除了片段(3)来自PKU—1(实施例4)。
表10转基因构建体中的氨基酸取代取 代 人启动子 质粒位置 930 53 80Tyr，Tyr，Tyr，Tyr+pPKU—1HSer，Tyr，Leu，Leu+pPKU—5在转基因小鼠中的表达将两个构建体KU—1H和PKU—5注射到小鼠胚中。到目前为止得到了PKU—5构建体的转基因动物。养育这些动物用于繁殖以分析其乳汁。
实施例6诱变的牛α乳白蛋白在体内的表达瞬时表达构建体为了分析α乳白蛋白基因的大范围突变，建立了一个体外表达试验。其中，将天然牛的和突变牛的α乳白蛋白基基编码区(实施例2，3，4和5序列位置756到3030；Vilotte et al.，Biochemie 69，609—620(1987))克隆到COS细胞表达载体pcDNA 3(Invitrogen)中以产生pC—BOVA和pC—PKU—5到—10。
参考图12，详细列出其构建如下(1)将含牛α乳白蛋白序列从位置756到位置831的HpaI位点之间的合成的寡核苷酸克隆到载体pCDNA3的HindIII/BamHI位点上；(2)将牛α乳白蛋白基因的编码区以HpaI到BamHI之间的片段插入，产生构建体pC—BOVA；(3)将pC—BOVA中的HpaI到HindIII的1.25kb片段换成含Phe取代的HpaI到HindIII的1.25kb片段(图11)以产生构建体pC—PKU—5到—10。
氨基酸9和30之间的限制性位点PpmMI和氨基酸53和80之间的AvrII的存在(图11)允许产生4个苯丙氨酸中的1个或2个被取代的PKU构建体，如表11所述。
表11存在于COS细胞构建体中的氨基酸取代取代 质粒930 53 80Phe，Phe，Phe，PhepC-BOVASer，Tyr，Leu，LeupC-PKU-5Phe，Tyr，Leu，PhepC-PKU-6Tyr，Phe，Phe，TyrpC-PKU-7Phe，Phe，Phe，TyrpC-PKU-8Phe，Phe，Phe，LeupC-PKU-9Ser，Phe，Phe，PhepC-PKU-10在COS细胞中的表达用10μg质粒转染细胞，72小时后，蛋白质标记上35S—甲硫氨酸和35S—半胱氨酸。收集上清液并经免疫沉淀后在聚丙烯酰胺凝胶上分析α乳白蛋白。
图13显示了在COS细胞中的瞬时表达导致天然的和突变的牛α乳白蛋白分泌。由Phe9变成Ser的氨基酸取代(pC—PKU 10)产生的表达水平与野生型牛α乳白蛋白相等。Phe30被Tyr取代且Phe53被Leu取代(pC—PKU6)，Phe90被Tyr取代(pC—PKU8)后，表达水平下降。pC—PKU5，7，和9的表达在本试验系统检测水平之下。这一系统可定义在转基因动物中最高表达的氨基酸取代。
实施例7如何使用含修饰的蛋白质的乳汁对于患苯丙酮尿的儿童，需要一种无苯丙氨酸的特殊食品补充。由于在早些年饮食的顺应性是关键的，因此优选味道好且饮食顺应性增强的任一治疗配方。
在设计苯丙酮尿儿童的饮食时，必须确定每天的蛋白质，热量值和氨基酸需要(包括苯丙氨酸)以维持寿命和生长的需要，计算由特殊饮食补充提供的蛋白质和热量值，然后决定需要什么天然食品来满足但不超出苯丙氨酸需要。正常情况下这种苯丙氨酸的供应经过加入测定量的乳汁和其它常规食品来实现。
苯丙酮尿儿童曲型的每日饮食应包含3份/天的特殊补充物，该补充物含修饰的α乳白蛋白和前面描述的表3中的其它营养成份。通用的建议是限制性的苯丙氨酸饮食，将它进行有规律的调整以满足年龄，生长和维持的需要，使生使得以延续。
实施例8从乳汁中制备/分离修饰的蛋白质对于大多数(如果不是全部)特殊配方制品，需要从修饰的α乳白蛋白质中分离和纯化正常α乳白蛋白。例如，对于儿童，青少年和孕妇，零或最少量Phe的配方应具有最大饮食灵活性并很可能终自以饮食治疗PKU。
因此设计在C端加上poly—Arg或Arg/Lys尾巴，以便能够更有效和更廉价地分离。这一设计能改变修饰的蛋白质的电荷以便从正常α乳白蛋白的中将它分离出来。这种分离应可用实验室和工业量的乳清分离并接着进行液相色谱技术来实现，后一分离可能以分子电荷差异的基础。液相色谱已表现出允许从乳汁的乳清中分离和纯化蛋白质和其它成份。
其它技术也可使用，特别是用于实验室或桌面规模鉴定。这些技术包括但不局限于SDS—PAGE色谱和放射免疫试验。
实施例9修饰蛋白质的配方根据本发明可配制一些特殊饮食配方用于治疗高苯丙氨酸血。这些配方是所有用配方中独一无二的，因为其中一种完全的蛋白质(修饰的α乳白蛋白)是占优势的蛋白质和无Phe的氨基酸源，而在通用配方中，N源全部以L—氨基酸的形式或是广泛水解的酪蛋白蛋白质。
这些新治疗配方中占优势的完全蛋白质特性增强了饮食顺应性，因为其味道和可口性有了极大的改进，纯的L—氨基酸和肽混合物典型地味道很差且难以忍受。因此修饰的蛋白质在生产一系列配方用于从婴儿期开始持续到怀孕期和成年期的整个生命历程中的饮食治疗具有优势。
含有相同修饰的α乳白蛋白源的这些配方可改变总共的蛋白质含量，加入L—氨基酸以改进营养价值，加入非蛋白质源提供能量，如加入糖，玉米浆和/或脂肪，以及维生素，无机物和调味品(如果合适的话)。很明显，用于婴儿的特殊饮食配方应试图与人乳汁的成份或其生理效力相匹配，并由此应含高百分数的脂肪热值。用于儿童和成年人的配方应含更多的总蛋白质和较少的脂肪，如果有的话，应加入与年幼儿童和婴儿所需比例不同的维生素和无机物。取天然食品与这些非婴儿组的配方进行组合以设计成具有相同苯丙氨酸水平的食物组，因此可变换使用不同的食物组来进一步增加饮食多样性，因而增强了其顺应性。
序列描述(1)一般资料(A)用于除US外的所有指定国的申请人(A)名称药用蛋白质有限公司(B)街道Orchard Brae House 30 Queesferry Road(C)城市Edinburgh(E)国家英国(F)邮编(号码)EH4 2HG(i)仅限于US的发明人/申请人(A)姓名Colman、Alan(B)街道65 Cromwell Lane(C)城市Coventry(E)国家英国(F)邮编(号码)CN4 8AQ(A)姓名Wright，Gordon(B)街道168 ESKhill(C)城市Penicuik(D)州Midlothian(E)国家英国
(F)邮编(号码)EH26 8DQ(A)姓名SAWYER，Lindsey(B)街道14 MORNINGSIDE PARK(C)城市EDINBURGH(E)国家英国(F)邮编(号码)EH10 5HB(A)姓名Rigden，Daniel John(B)街道38 Denver Avenue(C)fdymCrewe(D)州Cheshire(E)国家United Kindom(F)邮编(号码)CW2 7PX(ii)发明题目修饰的α—乳白蛋白(ii)序列号15(iv)计算机可读形式(A)媒介类型Floppy disk(B)计算机IBM PC兼容性(C)操作系统PC—DOS/MS—DOS
(D)软件Patent In Releose#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GCGGATCCAC AACTGAAGTG ACTTAGC27(2)SEQ ID NO2资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2GATGGATCCT GGGTGGTCAT TGAAAGGACT GATGC 35(2)SEQ ID NO3资料(i)序列特征(A)长度43个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3GCAGGCGAAT TCCTCAAGAT TCTGAAATGG GGTCACCACA CTG 43(2)SEQ ID NO4资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GAGGATCCAA TGTGGTATCT GGCTATTTAG TGG33(2)SEQ ID NO5资料(i)序列特征(A)长度46个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GCTGAATTCG TTAACAAAAT GTGAGGTGTA TCGGGAGCTG AAAGAC46(2)SEQ ID NO6资料(i)序列特征(A)长度58个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.6GCGGATCCGA TCGCTTGTGT GTCATAACCA CTGGTATGGT ACGCGGTACA GACCCCTG 58(2)SEQ ID NO7资料(i)序列特征
(A)长度58个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7GCGGATCCGA TCGCTTGTGT GTCATAACCA CTGGTATGGA GCGCGGTACA GACCCCTG58(2)SEQ ID NO8资料(i)序列特征(A)长度69个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(xi)SEQ ID NO8序列描述GCGGATCCGA TCGTACAAAA CAATGACAGC ACAGAATATG GACTCTACCA GATAAATAAT 60AAAATTTGG 69(2)SEQ ID NO9资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(vi)序列描述SEQ ID NO9GCTCTAGATC ATCATCCAGG TACTCTGGCA GGAG 34(2)SEQ ID NO10资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GCTGAAGCTT CACTTACTTC ACTC 24(2)SEQ ID NO11资料(i)序列特征(A)长度65个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型 cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11GCGGATCCAA AGACAGCAGG TGTTCACCGT CGACGACGCC TACGTAACTT CTCACAGAGC 60CACTG 65(2)SEQ ID NO12资料(i)序列特征(A)长度46个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12GCTGAATTCG TTACAAAAT GTGAGGTGAG CCGGGAGCTG AAAGAC 46(2)SEQ ID NO13资料(i)序列特征(A)长度54个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDN A(xi)序列描述SEQ ID NO13GCGGATCCGA TCGCTTGTGT GTCATAACCA CTGGTATGAT ACGCGGTACA GACC54(2)SEQ ID NO14资料(i)序列特征(A)长度69个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑学线型(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14GCGGATCCGA TCGTACAAAA CAATGACAGC ACAGAATATG GACTCCTCCA GATAAATAAT60AAAATTTGG69(2)SEQ ID NO15资料(i)序列特征(A)长度34个碱基对(A)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(ii)分子类型cDNA(vi)序列描述SEQ ID NO15GCTCTAGATC ATCATCCAGC AGCTCTGGCA GGAG3
权利要求
1.一种修饰的α乳白蛋白，它与野生型α乳白蛋白相比不含苯丙氨酸残基或更少的苯丙氨酸残基，它不同于Phe-80被赖氨酸取代的人α乳白蛋白变异体。
2.根据权利要求1的修饰的α乳白蛋白，在其C端含有一个氨基酸尾巴以利于纯化。
3.根据权利要求2的修饰的α乳白蛋白，其中的C端尾巴是poly-Arg或Arg/Lys。
4.根据权利要求1、2或3的修饰的α乳白蛋白，它是修饰的牛α乳白蛋白。
5.根据权利要求4的修饰的牛α乳白蛋白，其中Phe9被Tyr，Ser或Leu取代。
6.根据权利要求4或5的修饰的牛α乳白蛋白，其中Phe31被Leu，Ile，Trp或Tyr取代。
7.根据权利要求4，5或6的修饰的牛α乳白蛋白，其中的Phe53被Tyr，Leu，Met或Trp取代。
8.根据权利要求4到7任一项的修饰的牛α乳白蛋白，其中Phe80被Tyr，Met，Trp或Leu取代。
9.根据权利要求1、2或3要求的修饰的α乳白蛋白，它是修饰的人α乳白蛋白。
10.根据权利要求9要求的修饰的人α乳白蛋白，其中Phe3被Tyr，Leu，Arg，Met或Trp取代。
11.根据权利要求9或10要求的修饰的人α乳白蛋白，其中的Phe31被Leu，Ile，Trp或Tyr取代。
12.根据权利要求9，10或11要求的修饰的人α乳白蛋白，其中Phe53被Tyr，Leu，Met或Trp取代。
13.根据权利要求9到12任一项要求的修饰的人α乳白蛋白，其中Phe80被Tyr，Met，Trp或Leu取代。
14.一种制备根据权利要求1到13任一项要求的修饰的α乳白蛋白的方法，该方法包含将连续的氨基酸耦联到一起和/或连接寡—和/或多—肽。
15.一种编码不含苯丙氨酸残基或苯丙氨酸残基比野生型α乳白蛋白更少的修饰的α乳白蛋白的分离的或重组的核酸。
16.一种编码在权利要求1到13中任一项要求的修饰的α乳白蛋白的分离的或重组的核酸。
17.在权利要求15或16中要求的重组DNA，它是一种载体形式。
18.一种制备根据权利要求15或16要求的核酸的方法，该方法包含将连续的核苷酸耦联到一起和/或连接寡—和/或多—核苷酸。
19.一种宿主，它含有权利要求15、16或17要求的重组DNA。
20.权利要求19中要求的宿主，它是一种非人类的胎生哺乳动物，其种系中含有编码修饰的α乳白蛋白的DNA，该种系的成年雌性能在乳腺中表达修饰的α乳白蛋白，使修饰的α乳白蛋白在乳汁中积累。
21.权利要求20中要求的宿主哺乳动物，它是母牛(或公牛)、绵羊、山羊，骆驼或猪。
22.权利要求19、20或21中要求的宿主，其中宿主野生型α乳白蛋白基因的表达受阻或减弱。
23.一种适用于高苯丙氨酸血患者的食品，该食品不含苯丙氨酸残基，或含有至少一种修饰的α乳白蛋白，该α乳白蛋白包含的苯丙氨酸残基比野生型α乳白蛋白更少。
24.根据权利要求23的食品，其中修饰的α乳白蛋白，或至少一种修饰的α乳白蛋白是权利要求2到13中任一项所要求的。
25.根据权利要求23或24所要求的食品，它是一种适用于婴儿或儿童高苯丙氨酸血患者的食谱被充或配方。
26.根据权利要求23或24的食品，它是根据权利要求19、20或21所要求的雌性哺乳动物的乳汁。
27.一种给苯丙酮尿患者进食的方法，该方法包含给患者服用1种或多种含有修饰的α乳白蛋白的食品，该α乳白蛋白不含苯丙含酸残基，或苯的氨酸残基化野生型α乳白蛋白更少。
28.根据权利要求27的方法，其中的食品是权利要求23到26任一项所要求的。
全文摘要
包含比野生型α乳白蛋白苯丙氨酸残基更少的修饰的α-乳白蛋白蛋白，例如来源于牛和人的α乳白蛋白可用作高苯丙氨酸血患者的食谱成分。优选全部苯丙氨酸残基被取代。修饰的α-乳白蛋白可在非人类的宿主动物乳腺中表达，以便在其乳汁中积累，且如果需要的话可从其中分离。
文档编号C07K14/76GK1127528SQ94192790
公开日1996年7月24日 申请日期1994年7月13日 优先权日1993年7月16日
发明者A·考尔曼, G·瑞特, L·萨叶, D·J·里顿 申请人:Ppl治疗(苏格兰)有限公司