专利名称：：一种磷酸酯锆纳米磁珠及其制备和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及磷酸化肽的分离富集，具体地说是一种磷酸酯锆纳米磁珠及其制备，以及其在磷酸化肽的选择性分离富集中的应用。
背景技术：
：蛋白质的分离分析是近年生物分离分析领域的研究热点，蛋白质的翻译后修饰是影响蛋白质结构和功能的重要因素，在生物化学途径的调控中起着重要的作用，而其中蛋白质磷酸化是最常见也是最重要的一种翻译后修饰方式，是蛋白质组学研究的热点和难点。蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节者生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，神经活动，肌肉收縮，新陈代谢，肿瘤发生等，蛋白质磷酸化还是目前所知道的主要信号传递方式。磷酸化蛋白质的鉴定可在酶解的基础上用MALDI-TOFMS来完成检测，但是酶解后磷酸化肽段的离子信号强度往往会被残留的非磷酸化肽段的离子信号所抑制住，而且磷酸化蛋白在实际样品中的浓度又很低，所以将磷酸化肽段进行预分离和预富集是一种排除非磷酸化肽质谱分析干扰的有效方法。磷酸化肽的分离与富集较为有效的方法是固定化金属螯合亲和色谱，该方法的主要原理是利用磷酸化肽段所带的磷酸根与固定化金属亲和载体上所固载的金属离子间发生高选择性的相互作用，而非磷酸化肽段则较难与之发生特异的高选择性相互作用，固此，可以达到磷酸化肽段的选择性分离和富集的效果。近来，将金属锆或钛离子固载于以硅胶为基质的色谱固定相表面并应用于磷酸化肽的分析己有成功报道，近来Ti02和Zr02微球，Fe304/Ti02壳孔纳米颗粒等也被用来纯化和富集磷酸肽(文献1.Yu-ChieChenet.al"Fe304/Ti02Core/ShellNanoparticlesasAffinityProbesfortheAnalysisofPhosphopeptidesUsingTi02Surface-AssistedLaserDesorption/IonizationMassSpectrometry"《AnalyticalChemistry》，2005,77,5912-5919.)。但是将金属锆离子固载于功能化纳米磁珠的表面并应用于磷酸化肽的分离富集的方法则未见报告。纳米磁珠具有纳米尺度和超顺磁的双重特性，近年受到了越来越多的关注，己被广泛应用于化学、生物、医学、环境等领域(文献2.MilanJ.Beneset.al"Preparationandpropertiesofmagneticnano-andmicrosizedparticlesforbiologicalandenvironmentalseparations",《JournalofSeparationScience》，2007,30,1751-1772.)。
发明内容本发明的目的在于提供一种磷酸酯锆纳米磁珠及其制备和应用，其可在磁场的作用下简单快速地完成磷酸化肽从复杂的生物样品的高效高选择性地分离富集。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下一种磷酸酯锆纳米磁珠，其特征在于磷酸酯锆功能化纳米磁珠的结构示意如下，所述磷酸酯锆纳米磁珠的磁珠内核是四氧化三铁磁性纳米颗粒，磁珠颗粒平均直径为(10nm)。可按如下步骤操作，1.通过四氧化三铁纳米颗粒表面强的亲和力，四氧化三铁纳米磁珠颗粒表面覆盖上一层二氧化硅；具体为取0.15-0.35g四氧化三铁纳米磁珠在超声作用下分散在30-120ml的无水乙醇溶液中，在25-55。C水浴搅拌下，加入1-5ml四硅酸乙酯，反应l-5小时后，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠用无水乙醇洗涤后，再加入10-120ml的无水乙醇，在45-75。C水浴中回流5-20小时；用磁铁吸住磁珠，倒去上清液；重复上述步骤一次。2.包覆上二氧化硅层的纳米磁珠通过氨基化化学反应键合上氨基基团；具体为:将制备的覆盖上二氧化硅的纳米磁珠在真空干燥器中20-100。C放置2-24小时后，将干燥后纳米磁珠放入20-50ml无水甲苯溶液中，向甲苯溶液中加入1-3ml3-氨丙基三乙氧基硅垸，在N2保护下90-120。C搅拌回流4-15小时，然后用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，获得氨基化的纳米磁珠，依次用甲苯，蒸馏水和无水乙醇洗涤，然后在25-60°C的真空干燥器中放置5-15小时；3.氨基化后的纳米磁珠与P0Cl3反应，得到磷酸化纳米磁珠。具体为将制备的氨基化的纳米磁珠置于包含20-80mMP0C13、20-50mM2,4，6-三甲基吡啶的20-80mL无水乙腈有机溶液中反应4-18小时；用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠依次用无水乙腈和蒸馏水洗涤；4.将锆离子螯合于磷酸化纳米磁珠表面，得到固定化金属螯合亲和磁性纳米颗粒；具体为然后将键合上磷酸基团的纳米磁珠置于10-50mM的30-60mLZrOCl2水溶液中反应8-24小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠依次用100-200mM氯化钠的体积含量为10-15%的醋酸水溶液、蒸馏水洗涤，然后在20-80。C的真空干燥器中放置5-15小时，得到磷酸酯锆纳米磁珠。所述磷酸酯锆纳米磁珠可用于蛋白酶解物中磷酸化肽的富集和纯化。即在适宜的酸性条件下，用于蛋白样品中的磷酸化肽的高选择性的分离富集，通过洗涤除去非磷酸化肽段，避免质谱分析中非磷酸化肽的干扰。本发明具有如下优点1.覆盖上二氧化硅的纳米磁珠可有效保护四氧化三铁磁核被酸和碱的侵蚀，及可以进一步在二氧化硅表面进行功能化反应，键和上磷酸酯的纳米磁珠可有效地阻止四氧化三铁磁核非特异性性吸附非磷酸肽。2.纳米磁珠的高比表面积和超顺磁的特性结合金属锆离子对磷酸化肽的高选择性亲和相互作用原理制备所得的纳米磁珠，可在磁场的作用下简单快速地完成磷酸化肽从复杂的生物样品的高效地分离富集，可以减少因离心等前处理步骤而带来的样品损失。3.由于纳米尺度的材料有很大的比表面积，因此纳米磁珠可以键和上更多的磷酸酯锆功能基团，因而磷酸酯锆纳米磁珠具有更高效地富集能力。4.磷酸酯锆纳米磁珠有较好地亲水性，可以很好地溶解在水溶液中，在生理条件下有很好的生物相容性和稳定性，而且可以与蛋白样品中的磷酸化肽高选择性地相互作用。5.本发明首先将磷酸基团引入表面包覆有二氧化硅的、以四氧化三铁为磁性内核的纳米磁性颗粒表面，然后通过金属锆离子与表面磷酸基团的相互作用形成表面磷酸酯锆层，成功制备了一种对磷酸化肽具高效、高选择性分离和富集特性的磁性纳米颗粒。此纳米磁珠主要用于在磁场作用下从生物样品中高效分离富集磷酸化肽，所提取的磷酸化肽可直接采用质谱进行分析表征。图1为磷酸酯锆纳米磁珠的制备示意图2为磷酸酯锆纳米磁珠对磷酸化蛋白a-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽的富集和纯化的MALDI-TOF质谱图；磷酸化肽的序列见表1;图3为磷酸酯锆纳米磁珠对磷酸化蛋白(3-酪蛋白酶解产物中磷酸化肽和标准磷酸化酪氨酸肽段的富集和纯化的MALDI-TOF质谱图；磷酸化肽的序列见表2。具体实施例方式下面用具体实施例介绍本发明。实施例1利用磷酸酯锆纳米磁珠实现磷酸化肽的富集磷酸酯锆纳米磁珠的制备1.四氧化三铁内核磁珠在超声作用下分散在30ml的无水乙醇溶液中，在40。C水浴和搅拌下，加入1.0ml四硅酸乙酯(TEOS)，反应2小时后，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠用无水乙醇洗涤后，再加入80ml的无水乙醇，在60。C水浴中回流12小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液。2.覆盖上二氧化硅的纳米磁珠在真空干燥器中放置12小时后，在35ml无水甲苯溶液中加入1.5ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，在&保护和110°C下搅拌回流10小时，然后用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，获得氨基化的纳米磁珠，依次用甲苯，蒸馏水和无水乙醇洗涤，然后在25。C的真空干燥器中放置12小时；重复上述步骤一次。3.氨基化的纳米磁珠置于包含40mMP0C13,40mM2,4,6-三甲基吡啶的40mL无水乙腈有机溶液中反应12小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠依次用无水乙腈和蒸馏水洗涤。4.键合上磷酸基团的纳米磁珠置于30mM的50mlZrOCl2水溶液中反应12小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠依次用200mM氯化钠的体积含量为10%的醋酸水溶液、蒸馏水洗涤，然后在30°C的真空干燥器中放置12小时，得到磷酸酯锆纳米磁珠，得到磷酸酯锆纳米磁珠。样品溶液的制备lmg的a-酪蛋白和P-酪蛋白的分别溶解在lmL,50mM的碳酸氢胺溶液中(pH8.2)，按照与胰蛋白酶的质量比40:1的比例加入月夷蛋白酶进行酶解反应，反应时间为16h,酶解温度控制在37"C。获得的蛋白酶解溶液置于-30°C冰箱中保存备用。磷酸化肽的富集及MALDI分析磷酸酯锆纳米磁珠分散在无水乙睛溶液中。上述磷酸化蛋白(x-酪蛋白和(3-酪蛋白的酶解液分别溶解在50%ACN，5.0Q/。HAC水溶液中，然后取2pL的样品溶液和10ul固定化锆金属离子螯和亲和色谱颗粒溶液，孵育10-60min，用磁铁吸住磷酸酯锆纳米磁珠，移走上清液，然后依次用含10nL50。/。ACN，200mMNaC1，5.0。/。HAC的混合溶液和1050%ACN,5.0%HAC的混合溶液清洗5-20min，然后用5-20%的氨水超声洗脱10-60min后用磁铁吸住固定化锆金属离子螯和亲和色谱颗粒，取上清液放入离心管，冷冻干燥，5)iL含有l。/。H3P04的DHB(10-50mg/mL)溶液加入到干燥过的离心管中，取0.5溶液沉积于MALDI靶上，形成共结晶，进行MALDI-TOF质谱分析。分析结果由图2和图3可见，来自于磷酸化蛋白a-酪蛋白和(3-酪蛋白酶解产物中的磷酸化肽被磷酸酯锆纳米磁珠所捕获，而非磷酸化肽则可被容易洗脱，说明磷酸酯锆修饰的纳米磁珠能特异的富集和分离纯化磷酸化肽。表l.在a-酪蛋白酶解液中检测到的磷酸化肽<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2磷酸酯锆纳米磁珠的制备1.0.15g四氧化三铁内核磁珠在超声作用下分散在60ml的无水乙醇溶液中，在45。C水浴和搅拌下，加入1.5ml四硅酸乙酉旨(TEOS)，反应3小时后，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠用无水乙醇洗涤后，再加入90ml的无水乙醇，在45。C水浴中回流13小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液。2.覆盖上二氧化硅的纳米磁珠在真空干燥器中放置8小时后，在20ml无水甲苯溶液中加入1.5ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，在N2保护和90。C下搅拌回流4小时，然后用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，获得氨基化的纳米磁珠，依次用甲苯，蒸馏水和无水乙醇洗涤，然后在30。C的真空干燥器中放置6小时；重复上述步骤一次。3.氨基化的纳米磁珠置于包含30mMPOCl3,30mM2,4,6-三甲基吡啶的30mL无水乙腈有机溶液中反应8小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠依次用无水乙腈和蒸馏水洗涤。4.键合上磷酸基团的纳米磁珠置于20mM的30mlZrOCl2水溶液中反应12小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠依次用100mM氯化钠的体积含量为11%的醋酸水溶液、蒸馏水洗涤，然后在20。C的真空干燥器中放置6小时，得到磷酸酯锆纳米磁珠。得到磷酸酯锆纳米磁珠。实施例3磷酸酯锆纳米磁珠的制备1.0.25g四氧化三铁内核磁珠在超声作用下分散在80ml的无水乙醇溶液中，在50。C水浴和搅拌下，加入2.0ml四硅酸乙酯(TEOS)，反应4小时后，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠用无水乙醇洗涤后，再加入100ml的无水乙醇，在65。C水浴中回流14小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液。2.覆盖上二氧化硅的纳米磁珠在真空干燥器中放置16小时后，在40ml无水甲苯溶液中加入1.5ml3-氨丙基三乙氧基硅浣(APTES)，在Nz保护和115。C下搅拌回流8小时，然后用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，获得氨基化的纳米磁珠，依次用甲苯，蒸馏水和无水乙醇洗涤，然后在35。C的真空干燥器中放置10小时；重复上述步骤一次。3.氨基化的纳米磁珠置于包含60mMP0C13,35mM2,4,6-三甲基吡啶的60mL无水乙腈有机溶液中反应16小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠依次用无水乙腈和蒸馏水洗涤；4.键合上磷酸基团的纳米磁珠置于35mM的40mlZrOCl2水溶液中反应12小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠依次用150mM氯化钠的体积含量为12%的醋酸水溶液、蒸馏水洗涤，然后在40°C的真空干燥器中放置10小时，得到磷酸酯锆纳米磁珠。得到磷酸酯锆纳米磁珠。实施例4磷酸酯锆纳米磁珠的制备1.0.25g四氧化三铁内核磁珠在超声作用下分散在100ml的无水乙醇溶液中，在30。C水浴和搅拌下，加入2.5ml四硅酸乙酉旨(TEOS)，反应5小时后，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠用无水乙醇洗涤后，再加入120ml的无水乙醇，在70。C水浴中回流15小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液。2.覆盖上二氧化硅的纳米磁珠在真空干燥器中放置20小时后，在50ml无水甲苯溶液中加入1.5ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，在N2保护和120。C下搅拌回流12小时，然后用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，获得氨基化的纳米磁珠，依次用甲苯，蒸馏水和无水乙醇洗涤，然后在40。C的真空干燥器中放置14小时；重复上述步骤一次。；3.氨基化的纳米磁珠置于包含70mMPOCl3,50mM2,4,6-三甲基吡啶的70mL无水乙腈有机溶液中反应18小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠依次用无水乙腈和蒸馏水洗涤。4.键合上磷酸基团的纳米磁珠置于40mM的60mlZrOCl2水溶液中反应12小时，用磁铁吸住磁珠，倒去上清液，磁珠依次用180mM氯化钠的体积含量为15%的醋酸水溶液、蒸馏水洗涤，然后在60°C的真空干燥器中放置14小时，得到磷酸酯锆纳米磁珠。得到磷酸酯锆纳米磁珠。磁珠SEQUENCELISTING<110〉中国科学院大连化学物理研究所<120〉一种磷酸酯锆纳米磁珠及其制备和应用<130〉<160>19<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>9<212〉PRT<213>人工序列<220〉<221>PHOSPHORYLATION<222>(1)..(9)<223><400>1ThrValAspMetGluThrGluValPhe15<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>PHOSPHORYLATION<222〉(1)..(9)<223><400>2ThrValAspMetGluThrGluValPhe15<210>3<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><221>PHOSPHORY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