专利名称：一种基于金属杂化介孔材料的磷酸化肽富集方法
技术领域：
本发明涉及磷酸化肽的富集，具体地说是一种基于金属杂化介孔材料的磷酸化肽 富集方法，采用合成的Ti-HMS快速高效地富集酶解液中的磷酸化肽。
背景技术：
磷酸化修饰是非常重要的一种蛋白质的翻译后修饰。现今发现的所有蛋白质中超 过30%可被磷酸化修饰。蛋白质的磷酸化修饰与多种生物学过程密切相关，如DNA损伤修 复、转录调节、信号转导、细胞凋亡的调节等。因为蛋白磷酸化的重要性，已经开发出各种磷 酸化蛋白和磷酸化位点的测定方法。MALDI-T0F-MS以其极高的灵敏度、精确度磷酸化蛋白 的分析中得到了广泛的应用，可直接用来测定蛋白质混合物的分子量，也能被用来测定经 酶等降解后的混合物，以确定多肽的氨基酸序列。对磷酸化蛋白而言，磷酸化肽序列的测定 可以确定磷酸化蛋白序列中的磷酸化位点。MALDI-T0F-MS分析磷酸化肽时主要存在的问题是，由于非磷酸化肽的含量远远高 于磷酸化肽，混合物中磷酸化肽的信号被抑制。因此只有当磷酸化肽被分离富集后，避开大 量的非磷酸化肽的干扰，分析磷酸化肽才会变得容易。一些相应的用于质谱分析的磷酸化 肽或磷酸化蛋白质前处理技术的分离和富集方法和技术已有很大发展。由于介孔材料具有空旷的空间结构和巨大的表面积(内表面和外表面)，因而被 广泛用于催化剂和吸附载体，许多研究表明介孔材料对磷酸化蛋白和磷酸化肽也有很好的 吸附富集作用，特别是通过螯合作用固定了 Ti离子或ττ离子的介孔材料(如MCM-41)对 磷酸化肽的吸附具有很高的特异性和富集效率。主要原因是通过间隔臂固定到介孔粒子表 面金属离子，可减少空间位阻，有利于磷酸化肽的特异性键合。HMS是近年来报道的一种新型氧化硅介孔材料，它是以长链伯胺为模板剂，通过模 板剂形成的胶束与硅母体之间的氢键作用和自组装途径(S°I°模板途径)合成的，具有较厚 的孔壁、较大的织物孔道结构，因而具有较高的热稳定性和水热稳定性；同时其孔道较短、 且具有大的构造孔的特点可使分子较易进出孔道，有利于传质的进行，这使得该材料在催 化、吸附和分离等领域有着潜在的用途。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Ti杂化的HMS(Ti-HMS)的制备方法，在常温条件下， 以有机伯胺为模板剂，正硅酸乙酯(TEOS)为硅源，钛酸丁酯为金属源，通过溶胶-凝胶方法 制得。模板剂通过高温焙烧去除。本发明提供了基于上述Ti-HMS的磷酸化肽分离富集方法，可以从蛋白酶解液中 简单、高效、高选择性地分离富集出磷酸化肽，用于MALDI-T0F-MS分析。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下一种基于金属杂化介孔材料的磷酸化肽富集方法，DTi-HMS的前处理将5-20mg Ti-HMS加入l_2ml的含有体积浓度10-80% ACN和1-10% TFA的混合溶液中，振荡混勻后备用；所述Ti-HMS的前处理详细过程为A.称取 5-20mg Ti-HMS 加入 l_2ml 的含有体积浓度 10-80 % ACN 和 1-10 % TFA 的 混合溶液中，振荡离心后移走上清液；B.再加入l_2ml去离子水，振荡离心后移走上清液；C.再加入l-2ml的含有体积浓度10-80% ACN和1-10% TFA的混合溶液中，振荡 离心后移走上清液；D.再加入l-2ml的含有体积浓度10-80 % ACN和1-10 % TFA的混合溶液中，振荡 混勻后备用。2) Ti-HMS对磷酸化肽分离富集A.将蛋白酶解液样品用含有体积浓度10-80% ACN和TFA的混合溶液稀释 至 I-IOpmol/μ L ；B.取IyL稀释后的蛋白酶解液，加入到25-100 μ L的步骤1)所获得的Ti-HMS溶 液中，振荡离心后移去上清液，收集底部沉淀物；C.底部沉淀物加入50-200 μ L含有体积浓度10-80 % ACN和1-10 % TFA的混合溶 液中，混合溶液中含100-500mM NaCl，振荡离心后移去上清液，收集底部沉淀物；重复此步 骤0-1次；D.底部沉淀物再加入加入50-200 μ L含有体积浓度10-80 % ACN和0-1 % TFA的 混合溶液中，振荡离心后移去上清液，收集底部沉淀物；重复此步骤0-1次；Ε.最后底部沉淀物用10_50μ L质量浓度5-20%氨水超声洗涤，离心后，收集上清 液于离心管中冻干后保存。所述金属杂化介孔材料是以C12-C18有机伯胺为模板剂，正硅酸乙酯(TEOS)为硅 源，钛酸丁酯为金属源，以上三者的质量比为1 (0.06-0.65) (1.5-5.0)，通过溶胶-凝 胶方法制得；具体制备过程如下，1)取4-8g C12-C18有机伯胺溶解于IOOg去离子水、15_25g乙醇和10_15g异丙 醇混合液中，制得溶液A ；2) 0. 5-2. 5g钛酸丁酯、10_20g正硅酸乙酯和15_25g异丙醇组成溶液B ；3)在剧烈搅拌下，将溶液B滴加到溶液A中，2-6分钟后加入l_3g三甲苯，陈化 12-30小时，抽滤、洗涤沉淀，烘干，500-600°C焙烧5_7小时得最终材料。本发明具有如下优点1.以前文献中关于介孔材料应用于磷酸化肽分离富集都采用了介孔材料衍生的 办法，就是介孔材料合成以后，通过化学试剂衍生，在材料表面螯合上Ti离子，以达到特异 吸附性磷酸化肽的目的。本发明在材料合成过程中直接在介孔材料骨架中引入Ti离子，应用于磷酸化肽 分离富集过程可起到同样的作用；其制备过程更为简便，Ti离子的螯合量更大，应用时效 果更好、更为高效。2.由于特异性吸附效果好，洗涤和洗脱过程较为简单。
图1为Ti-HMS孔径分布图；图2为Ti-HMS紫外漫反射图；图3为所合成的Ti-HMS对α -酪蛋白酶解液中的磷酸化肽的吸附效果图；图4可见，所合成的Ti-HMS对β -酪蛋白酶解液中的磷酸化肽的吸附效果图。
具体实施例方式一、Ti-HMS 的合成Ti-HMS的具体合成方法为取5g十六胺溶解于IOOg去离子水、20g乙醇和15g异 丙醇中，制得溶液A。2g钛酸丁酯、16g正硅酸乙酯和15g异丙醇组成溶液B。在剧烈搅拌 下，将溶液B滴加到溶液A中，5分钟后加入2g三甲苯。滴加完毕后，陈化24小时，抽滤、洗 涤沉淀，80°C烘干，550°C焙烧6小时得最终材料。Ti杂化的HMS (Ti-HMS)，其孔径分布如下(图1)；紫外可见漫反射(图2)表明HMS 骨架外无TiO2相，Ti离子进入HMS骨架。二、Ti-HMS对磷酸化肽分离富集1、样品溶液的制备称取Img的α -酪蛋白和Img的β -酪蛋白分别解在lmL， 50mM的碳酸氢胺溶液中(pH8. 2)，按照与胰蛋白酶的质量比40 1的比例加入胰蛋白酶进 行酶解反应，反应时间为16h，酶解温度控制在37°C，最后加入0. 5%甲酸停止反应。获得的 蛋白酶解溶液置于-30°C冰箱中保存备用。2、Ti-HMS的前处理称取IOmg上述合成的Ti-HMS加入Iml的50% ACN,6 % TFA(ν/ν)的混合溶液，振荡10分后，在13500g下离心10分钟，移走上清液；再加入Iml去 离子水，振荡10分后，在13500g下离心10分钟，移走上清液；再加入Iml的50% ACN,6% TFA(ν/ν)的混合溶液，振荡10分后，在13500g下离心10分钟，移走上清液；再加入Iml的 50% ACN,6% TFA (ν/ν)的混合溶液，振荡混勻后备用。3、磷酸化肽的富集及MALDI-T0F-MS分析将上述酶解的α -酪蛋白和β -酪蛋 白分别用50% ACN,6% TFA(ν/ν)的混合溶液稀释至lpmol/μ L ；各取1 μ L，分别加入至Ij 50 μ L的Ti-HMS溶液中，振荡30分钟，13500g离心10分钟后移去上清液；底部沉淀物加入 150 μ L 50% ACN,6% TFA(ν/ν)(含 500mM NaCl)混合液，振荡 5 分钟后，13500g 离心 10 分 钟后移去上清液；底部沉淀物再加入150 μ L 50%ACN,0. 1% TFA (ν/ν)混合液，振荡5分钟 后，13500g离心10分钟后移去上清液；最后底部沉淀物用25 μ L10%氨水超声洗涤10分 钟，13500g离心10分钟后，收集上清液至离心管中冻干后保存；在离心管中加入5 μ L含有
磷酸的2，5-二羟基苯甲酸(10-50mg/mL)溶液，取0. 5 μ L溶液沉积于MALDI靶上，形成 共结晶，进行MALDI-T0F-MS分析。4、分析结果由图3和图4可见，所合成的Ti-HMS对α-酪蛋白和β-酪蛋白酶解 液中的磷酸化肽具有很好吸附效果，而非磷酸化肽则很容易地被洗脱，说明Ti杂化的HMS 可高特异性地分离纯化磷酸化肽。表1在α -酪蛋白酶解液中检测到的磷酸化肽 表2在β _酪蛋白酶解液中检测到的磷酸化肽磷酸化序号[Μ+Η] +位点数β 1 2064. 718 1β 2 2558. 549 1β 3 3123.077 4磷酸化肽富集.ST25. txtSEQUENCE LISTING<110>中国科学院大连化学物理研究所<120> 一种基于金属杂化介孔材料的磷酸化肽富集方法<130><160>15<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>9<212>PRT <213>α-酪蛋白 <220>
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20
权利要求
一种基于金属杂化介孔材料的磷酸化肽富集方法，其特征在于1)Ti HMS的前处理将5 20mg Ti HMS加入1 2ml的含有体积浓度10 80％ACN和1 10％TFA的混合溶液中，振荡混匀后备用；2)Ti HMS对磷酸化肽分离富集A.将蛋白酶解液样品用含有体积浓度10 80％ACN和1 10％TFA的混合溶液稀释至1 10pmol/μL；B.取1μL稀释后的蛋白酶解液，加入到25 100μL的步骤1)所获得的Ti HMS溶液中，振荡离心后移去上清液，收集底部沉淀物；C.底部沉淀物加入50 200μL含有体积浓度10 80％ACN和1 10％TFA的混合溶液中，混合溶液中含100 500mM NaCl，振荡离心后移去上清液，收集底部沉淀物；重复此步骤0 1次；D.底部沉淀物再加入加入50 200μL含有体积浓度10 80％ACN和0 1％TFA的混合溶液中，振荡离心后移去上清液，收集底部沉淀物；重复此步骤0 1次；E.最后底部沉淀物用10 50μL质量浓度5 20％氨水超声洗涤，离心后，收集上清液于离心管中冻干后保存。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述Ti-HMS的前处理详细过程为Α.称取5-20mg Ti-HMS加入l_2ml的含有体积浓度10-80% ACN和1-10% TFA的混合 溶液中，振荡离心后移走上清液；B.再加入l_2ml去离子水，振荡离心后移走上清液；C.再加入l_2ml的含有体积浓度10-80%ACN和1-10% TFA的混合溶液中，振荡离心后移走上清液；D.再加入l_2ml的含有体积浓度10-80%ACN和1-10% TFA的混合溶液中，振荡混勻后备用。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述金属杂化介孔材料是以C12-C18 有机伯胺为模板剂，正硅酸乙酯为硅源，钛酸丁酯为金属源，以上三者的质量比为 1 (0. 06-0. 65) (1.5-5.0)，通过溶胶-凝胶方法制得。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于具体制备过程如下，1)取4-8gC12-C18有机伯胺溶解于IOOg去离子水、15_25g乙醇和10_15g异丙醇混 合液中，制得溶液A ；2)0. 5-2. 5g钛酸丁酯、10-20g正硅酸乙酯和15_25g异丙醇组成溶液B ；3)在剧烈搅拌下，将溶液B滴加到溶液A中，2-6分钟后加入l_3g三甲苯，陈化12-30 小时，抽滤、洗涤沉淀，烘干，500-600°C焙烧5-7小时得最终材料。
全文摘要
本发明涉及磷酸化肽的富集，具体地说是一种基于金属杂化介孔材料的磷酸化肽富集方法，1)将Ti-HMS加入含有ACN和TFA的混合溶液中，振荡混匀后备用；2)将蛋白酶解液样品用含有ACN和TFA的混合溶液稀释与步骤1)所获得的Ti-HMS溶液中，振荡离心后移去上清液，收集底部沉淀物；3)去除沉淀物中未被吸附的蛋白，离心后，沉淀物用氨水超声洗涤，离心后，收集上清液于离心管中冻干后保存。本发明可以从蛋白酶解液中简单、高效、高选择性地分离富集出磷酸化肽，用于MALDI-TOF-MS分析。
文档编号C07K7/08GK101906131SQ20091001185
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月5日 优先权日2009年6月5日
发明者吴仁安, 张宇, 徐杰, 邹汉法, 陈晨 申请人:中国科学院大连化学物理研究所