专利名称：一种制备针对糖基化修饰蛋白质的单克隆抗体杂交瘤的方法
技术领域：
本发明属于免疫化学、蛋白质化学和细胞生物学领域。具体而言，本发明涉及一种制备特异识别糖基化修饰蛋白的单克隆抗体的方法。
背景技术：
蛋白质的翻译后修饰状态与蛋白质功能密切相关，其中糖蛋白发挥了多种重要的生物功用，如细胞膜上的糖蛋白参与胚胎发育、细胞移动、免疫反应以及细胞分裂等过程。另外，大部分血浆蛋白都具有不同程 度的糖基化修饰。值得注意的是，现在已知的作为各种疾病检测标记物的蛋白质都是糖蛋白，如PSA，AFP，CA125，CA153和HER-2等。多年来，关于对血浆中的生物标记物的检测的研究取得了一定的进展。其中最重要的方法就是生产针对这些蛋白的抗体，通过ELISA的方法实现对这些蛋白的检测和定量。该方法的关键即是获得特异性好、灵敏度高的抗体。目前，传统的生产抗体的方法已经相当成熟且在大多数情况下非常有效，但是对于血浆中的这些糖蛋白抗体的生产，传统的方法往往存在一定的不足，这是由于具有天然糖基化修饰的蛋白难以获得，而且糖蛋白的抗原性往往不强。原核表达的蛋白，由于不具有糖基化修饰，籍此产生的抗体往往不能很好地识别人血液中的糖蛋白。糖蛋白抗体的生产通常可以通过富集和纯化生物体内的天然糖蛋白作为抗原，采用传统的抗体生产方法进行抗体制备。但是这种方法对于那些在生物体内含量较低，或者难于纯化的糖蛋白并不合适。而且更重要的是，在一系列体外操作过程中，对糖蛋白的各种性质是否造成不同程度的影响，也是不得而知的。因此为了克服以上困难，一些科学家已经研发出新的抗体制备方法以获得特异针对糖蛋白的抗体。McKenzie采用小鼠腹腔注射在其细胞膜上稳定表达外源糖蛋白Neu的肿瘤细胞作为免疫抗原的方法，刺激机体产生并筛选出针对该蛋白的单克隆抗体。在该方法中，将Neu基因导入到NIH3T3细胞中，使其在细胞膜上稳定表达。细胞通过腹腔注射入小鼠后，该蛋白的细胞外部分即可作为抗原刺激机体产生抗体。该方法克服了膜上糖蛋白难于富集纯化的困难，而且实验结果也表明，这种方法生产的抗体比依靠合成Neu蛋白上的肽段作为抗原生产出的抗体具有更好的特异性，可以区分与其相似性极高的蛋白。Atabai也通过类似的方法将稳定表达MFGE8蛋白的人的肿瘤细胞注射到兔子体内，通过筛选获得特异性单克隆抗体。Suzuki等将heparin的糖链连接到载体蛋白KLH上作为抗原，采用传统方法注射到小鼠体内，筛选出可特异识别该糖链的单克隆抗体。但是上述研究并没有能够提供一种应用性广泛的方法，而且实验操作比较复杂。本发明人以人AGP为例，试图建立一套可生产特异识别糖基化蛋白的抗体的方案，由此生产的单克隆抗体可基本上克服糖蛋白抗原性低下和糖蛋白抗体特异性差的缺陷。将外源的糖蛋白基因通过逆转录病毒载体导入到小鼠黑色素瘤细胞B16中，经过筛选获得稳定表达株。该表达株可以持续地将外源糖蛋白分泌到细胞外。将稳定细胞株和佐剂混合后经皮下注射到C57BL/6J小鼠体内，随着细胞的不断增殖和生长，外源糖蛋白被持续分泌到小鼠体内作为抗原刺激机体产生抗体。将血清呈阳性反应的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合后，通过多次筛选，可以得到可特异识别外源糖蛋白的单克隆抗体。该方法与传统的生产糖蛋白单克隆抗体的方法相比具有明显的优势:在此过程中，细胞表达分泌的蛋白具有正确的糖基化修饰，不需对它们进行富集，而且这些抗原是持续性的分泌到小鼠体内，不断刺激机体的免疫系统，这样既解决了糖蛋白富集的难题，又解决了糖蛋白抗原性低的问题。我们采用该方法成功地生产了 AGP的单克隆抗体，这些抗体可以特异性的识别糖基化修饰的AGP，而对非糖基化的AGP几乎不具有识别能力。
发明内容
一 )本发明涉及制备特异识别糖基化修饰蛋白的单克隆抗体的方法，其中包括:
I)将含有带有RFP标签的外源基因AGP的逆转录病毒载体转染病毒包装细胞，收集病毒后感染B16细胞，并通过药物处理进行稳 定株的筛选，通过RFP抗体检测稳定株对这些糖蛋白的分泌；2)将所得的稳定株与弗氏完全佐剂混合后，经皮下注射到C57BL/6J小鼠脾脏侧的腰窝处；3)使用弗氏完全佐剂进行腹部皮下注射以增强免疫反应；4)使用人血浆蛋白和原核表达的AGP对单克隆抗体同时进行筛选，以获得特异针对糖基化修饰蛋白的单克隆抗体；5)对这些单克隆抗体的检测和评估。二)本发明选择了分泌蛋白作为抗原，该抗原可以分泌到细胞外，直接入血，刺激机体产生体液免疫反应。与传统的抗体生产方法不同，该抗原是随着细胞的生长而不断持续被分泌到细胞外的。因此，引起的刺激也是连续性的。在细胞和宿主选择方面，黑色素瘤细胞B16即是宿主C57BL/J6小鼠来源的，因此，注射了稳定株细胞的小鼠只对外源性的分泌糖蛋白有免疫反应，而不会对B16细胞自身来源的其他任何蛋白有免疫反应。这一策略保证了生产出的抗体的单一性和优越性。而B16细胞是一种易转染、对外源基因可以稳定高效表达的细胞。三)本发明对标签蛋白红色荧光蛋白RFP的引入同时考虑到了三方面的因素:1)由于RFP基因是融合在外源糖蛋白的C端，因此，它不会对蛋白的分泌产生影响，而在整个转染、感染和筛选的过程中，红色荧光可以表明转染、感染效率以及外源蛋白在细胞内的表达状况；2)在对筛选到的稳定株进行检测时，RFP抗体可以作为一个有效的工具，对外源糖蛋白的分泌进行测定；3)作为一种载体蛋白，RFP可以增加肌体对糖蛋白的免疫反应。该原理类似于在使用多肽作为免疫原时采用KLH作为载体蛋白增强免疫反应。这是由于糖蛋白上的糖链作为一种半抗原降低了糖蛋白的抗原性，因此使用分子量较大的RFP(28Kd)，而不是通常用的HIS-Tag等作为融合蛋白。四)本发明倾向于选择采用逆转录病毒作为载体将外源基因导入到B16细胞中。这是因为对一些基因长度比较大的糖蛋白来说，在与RFP基因融合后的基因长度过大不利于采用传统的直接转染的方法进行稳定株的筛选。而逆转录病毒却可以包装比较大的基因片断，而且它的感染效率往往很高，可以大大缩短筛选稳定株所需的时间。但本发明同样也涉及其他转染方法在该抗体生产过程中的应用。五)本发明采用脾脏侧腰窝处的皮下注射免疫。这主要是考虑到以下几个方面:
I)首先机体内产生免疫反应的重要器官即是脾脏；2)在众多的免疫方式中，抗原的直接脾脏免疫方式已经被证明是一种更加有效的选择。但是，这种注射方法对于机体的影响显著，很可能造成动物的死亡。在本发明中，由于B16是一种恶性程度高、易转移的肿瘤细胞，很易导致小鼠的死亡。如果将B16细胞直接注射小鼠脾脏内，则在很短时间内就可能导致小鼠的死亡，而此时有效抗体还没有大量产生。六)本发明首创佐剂与细胞混合注射。佐剂的使用在抗原呈递过程中起到关键的作用，可以大大提高抗体的产生。在本发明中，佐剂与细胞混合注射后，虽然会杀死部分细胞，但是存活的细胞一旦分泌出糖蛋白后，其周围的佐剂就会及时对这些抗原进行呈递，增加抗体的产生。我们的实验亦表明佐剂的混合注射会明显提高抗体的产出。而在细胞注射后，单独的佐剂腹下注射也是为了增强肌体的免疫反应。七)本发明所涉及的生产单克隆抗体的技术可适用于生产针对跨膜及膜外蛋白(如细胞基质类蛋白)的抗体。这是由于将这些基因转入B16细胞后，这些位于细胞外的蛋白或蛋白中的一部分可以作为抗原持续性的刺激机体产生抗体。该方法产生的抗体往往仅识别跨膜蛋白的胞外区域，具 有较强的特异性。而且这些跨膜及膜外蛋白往往也具有一定的糖基化修饰，因此，使用该方法可以生产出可特异性识别这些糖基化修饰的抗体。使用该方法也可以生产特异针对蛋白质其它修饰形式的抗体，包括磷酸化、硝基化等。只要在天然状态下会发生修饰的蛋白，通过该方法都能生产出能特异识别该修饰形式蛋白的抗体。
图1:表示稳定株分泌蛋白的免疫印迹检测结果，结果显示带有RFP融合标签的糖蛋白被顺利地分泌到细胞外，且从目标蛋白的分子量变化上也表明AGP发生了明显的糖基化修饰。抗RFP多抗浓度为1: 1000。图2:表示B16-RFP-AGP稳定株的荧光镜检测结果，具体而言，B16-RFP-AGP的荧光显微照片表明红色荧光仅分布在胞质区域，这也证实了 AGP糖蛋白的分泌性质。图3:注射免疫B16-RFP-AGP稳定株细胞的小鼠抗血清的免疫印迹检测结果，具体可见，免疫了 B16-RFP-AGP稳定细胞系的小鼠抗血清中已经包含了对蛋白糖基化修饰有特异性的识别倾向的多克隆抗体。抗血清稀释比例为1: 2000。图4:表示BP1-AGP单克隆抗体和Sigma-AGP单克隆抗体对不同修饰状态AGP抗原的免疫印迹差异识别的实验结果，具体而言，BP1-AGP单克隆抗体对糖基化蛋白特异识别，而对原核表达的无糖基化修饰的AGP没有识别，对脱糖后AGP蛋白的识别也明显的减弱。而Sigma-AGP单克隆抗体对这两种不同修饰形式的蛋白的识别没有偏向性。图5:表示BP1-AGP单克隆抗体和Sigma-AGP单克隆抗体对不同修饰状态AGP抗原的ELISA检测结果的差异的实验结果，具体而言，BP1-AGP单克隆抗体只对糖基化AGP有特异的结合，而对原核表达的非糖基化AGP几乎无结合。而Sigma-AGP单克隆抗体对两者的结合均没有明显的差异。左图以糖基化AGP作为抗原，右图以原核细胞表达的重组AGP蛋白作为抗原。图6:表示BP1-AGP单克隆抗体和Sigma-AGP单克隆抗体的免疫组化实验结果，该结果表明=BP1-AGP单克隆抗体对人肝脏组织中的糖基化AGP的识别的特异性高于Sigma-AGP单克隆抗体对人肝脏组织中的糖基化AGP的识别。所用单克隆抗体的浓度均为I: 500。
具体实施方式
实施例1糖蛋白的基因克隆本发明人根据已公布的人AGP的基因序列(SEQ ID N0.1)设计PCR引物:AGP 5，正向引物5，-GCCAAGCTTATGGCGCTGTCCTGGGTTCT-3’ (SEQ ID 0N.2)AGP 3’反向引物5，-GGCGGATCCTAGGATTCCCCCTCCTC-3’ (SEQ ID 0N.3)以人肝cDNA文库为模板，PCR扩增出全长AGP基因，(PCR参数:95 °C 5分钟；94°C 30s 54°C 30s 72°C I 分钟，共 40 个循环；72°C后延伸 10 分钟)经 Hind III 和 BamH I双酶切后与PLNCX2-RFP质粒连接(RFP基因来自于pDsRed2质粒，从该质粒上用Hind III和Not I内切酶将RFP基因切下后，连接到经同样双酶切的PLNCX2质粒上)，化学转化感受态细胞E.ColiDH5a，挑单克隆提取质粒进行测序，验证序列无误。实施例2稳定表达并分泌外源 糖蛋白的细胞株的构建、筛选和验证从E.coli DH5 α中提取构建好的pLNCX2_RFP_AGP质粒和编码逆转录病毒包膜蛋白的质粒 pVSV-G,按照 DNA 和转染试剂 Lipofectamine 2000 (11668-019, Invitrogen)的量为1: 5的比例进行两种质粒的共转染。在氯奎的帮助下，将两种质粒转入逆转录病毒包装细胞GP2-293中。8小时后进行换液以清除氯奎对细胞的毒性作用。撤除氯奎后的48小时后，收集GP2-293的培养基上清，此时的培养基中被释放出的含有外源基因的逆转录病毒颗粒最多。通过长时间的高速离心(4°C，50，000g，90分钟)富集沉淀下来的逆转录病毒颗粒。将这些病毒进行复性后，加入到目标细胞B16的培养基中，在Polybrene (H9268，Sigma)试剂的帮助下，这些病毒即可感染B16细胞，同时将外源基因导入到目标细胞中。感染后的细胞，在G418的筛选作用下，经过大约2周的时间，即可获得单克隆稳定株细胞。采用免疫印迹的方法对筛选得到的稳定株进行验证。方法如下:将稳定株细胞的完全培养基吸出后，用生理盐水洗细胞3次，然后换成无血清培养基继续培养12小时。收集这些无血清培养基，通过截留分子量为30kD的Amicon Filter (UFC803008, Millipore)进行培养基中蛋白质的浓缩。浓缩40倍后的培养基即可直接用于免疫印迹检测。图1显示了稳定株分泌到细胞外的糖蛋白的免疫印迹检测结果以及图2显示的稳定株(B16-RFP-AGP)的荧光显微照片。从图1中可以看出带有RFP融合标签的糖蛋白被顺利的分泌到细胞外，且从目标蛋白的分子量变化上也表明AGP发生了明显的糖基化修饰。从图2中可以看出，B16-RFP-AGP的荧光显微照片表明红色荧光仅分布在胞质区域，这也证实了 AGP糖蛋白的分泌性质。实施例3AGP重组抗原的制备根据已公布的人AGP的基因序列设计PCR引物:AGP 5’正向引物5，-GCCGGATCCATGGCGCTGTCCTGGGTTCT-3’ (SEQ ID 0N.4)AGP 3’反向引物5，-GGCAAGCTTCTAGGATTCCCCCTCCTC-3’ (SEQ ID 0N.5)以人肝cDNA文库为模板，PCR扩增出全长AGP基因，经胶回收后进行BamH I和HindIII双酶切，回收后，与同样双酶切的pET28a载体进行连接，化学转化感受态细胞E.coli DH5ci，经过双酶切验证以及质粒测序选取阳性克隆菌株。将选取的阳性克隆的质粒化学转化感受态细胞BL21 (DE3)。接种可表达AGP的BL21菌株，当菌液的OD值达到0.6左右时，加入lmmol/LIPTG诱导4小时。诱导以后的菌株经超声后离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果显示表达的产物为包涵体蛋白。大量培养细菌，IPTG诱导4小时后进行收菌，超声破碎、离心、弃上清，在沉淀中加入含8M尿素的提取液溶解表达的包涵体蛋白。再次离心后，上清即可用于纯化。使用N1-NAT亲和层析柱对表达的AGP蛋白进行纯化，柱子经平衡、上样、淋洗后，使用10、20、50mM咪唑进行分段洗脱，去除其中的杂蛋白，最后采用IOOmM咪唑洗脱目的蛋白。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，检测AGP蛋白的纯化效果。其他所用的重组蛋白的制备，如RFP也经历了相同的表达和纯化过程。实施例4抗人AGP单克隆抗体杂交瘤细胞系(BP1-AGP，保藏日2009年I月14日，保藏号为CGMCC2868，保藏地中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，北京市朝阳区北辰西路I号院3号)的制备稳定分泌表达RFP-AGP的B16细 胞经胰酶消化并终止后，离心收集细胞。这些细胞经PBS洗涤三次后，用无血清的培养基重悬，进行细胞计数。按照等体积(IOOyL: IOOyL)的比例将5-10万个细胞与弗氏完全佐剂反复吹打几次，混匀。混匀后的混合物经注射器注射到小鼠脾脏侧腰窝处的皮下。以后，每隔7天在小鼠腹部皮下注射弗氏完全佐剂进行免疫加强。一个月后，通过眼眶取血，对血液中的抗血清进行免疫印迹检测。选择原核细胞表达的AGP，人血中的糖基化修饰的AGP(G9885，Sigma)，B16稳定表达株分泌的糖基化的RFP-AGP蛋白以及原核细胞表达的RFP和RFP-AGP作为抗原检测注射肿瘤细胞后的小鼠抗血清的效价。每种蛋白上样约200ng，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后立即进行电转移，过程如下:将PVDF膜置于5mL甲醇中，处理5分钟；加入4倍体积(20mL)水，慢加快摇，将甲醇逐级稀释到20%，倒去液体；再用转膜缓冲液(20%甲醇，25mM Tris-base,192mMGlycine)平衡15分钟。将凝胶浸泡于含有0.01% SDS的转膜缓冲液中，10分钟。按照黑板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜一滤纸-海绵-白板的顺序，做好三明治夹，放入装有 0.01% SDS 转膜缓冲液的 Trans-Blot Cell 转膜仪中(Bio-Rad, Hercules, U.S.A.),350mA，转膜2小时。PVDF膜的进一步处理过程如下:膜以PBST浸湿，加PBST配制5%脱脂奶粉封闭，室温摇床上摇2小时，4°C过夜，PBST洗膜后加入1: 2000稀释的小鼠抗血清，室温下孵育2小时，洗膜后加入1: 4000的羊抗鼠IgG的二抗(用HRP标记)，孵育I小时，再次PBST洗膜，使用ECL增强型免疫印迹检测试剂盒(RPN2132，GE Healthcare)发光，X片曝光。图3是注射了稳定株细胞后的小鼠血清的免疫印迹检测结果。免疫印迹实验结果(图3)显示:在注射免疫了稳定株细胞的小鼠血清中已经产生了可识别标签蛋白RFP以及RFP-AGP原核表达的融合蛋白的抗体，同时，该多克隆抗体还可特异识别糖基化修饰蛋白，包括B16-RFP-AGP分泌到胞外的发生了糖基化修饰的AGP以及人血中天然存在的发生了糖基化修饰的AGP。而该抗体却对原核表达的无糖基化修饰的AGP没有识别。这表明该多克隆抗体具有了对糖基化修饰的蛋白有特异性的识别倾向。用Western blot的方法检测小鼠多抗血清的效价，如在1: 2000稀释或稀释比例更高的情况下可以检测0.5 μ L人血浆中的AGP即可用于进一步融合实验。取免疫效价达到要求的C57BL/6J小鼠的脾脏，放在细胞筛上碾碎，按5: I的比例与SP2/0细胞经PEG1500进行融合。既融合后的细胞用甲基纤维素半固体培养基培养，经HAT进行筛选，挑出500个单克隆细胞在96孔板中继续培养。使用原核表达纯化的RFP以及去除了白蛋白和免疫球蛋白的人血清蛋白(Albumin/IgG Removal Kit,Cat.122642，CALBIOCHEM)分别作为抗原包板，对这些单克隆细胞的培养基上清进行ELISA筛选出分别识别不同抗原的抗体。得到的阳性克隆细胞先注射小鼠生产腹水，然后进行冻存。实施例5单克隆抗体的纯化从_80°C冰箱或液氮罐中迅速取 出冻存管；迅速放入水浴锅中快速搅动，使冻存液在2分钟内全部融化成液体。用75%酒精擦拭冻存管。往15mL离心管中加入3mL血清培养基，将冻存液吸入离心管，1500转/分钟，离心5分钟。弃上清，用完全培养基悬起细胞，培养于6孔板或瓶中。6孔板中培养基为3mL，第二天换液，再补足3mL ;培养瓶培养基为5mL。对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起；计数大约5X 105，lmL。悬浮的细胞腹腔注射小鼠。一般7-10天后便可开始收集腹水，每隔2、3天可重复取，最终可收集1-1OmL/只。每次取出的腹水4000转，10分钟离心，中间为腹水。小心吸出腹水收集于离心管中，4°C保存。将腹水在4°C条件下，10000转离心10分钟，去除脂类物质。离心后吸取上清，并用偶联缓冲液以1: 3 (腹水，偶连液比)稀释，过0.22 μ m膜，用HiTrap ProteinAFF(17-5079-01,GE Healthcare)纯化单克隆抗体。用5-10柱体积的偶联缓冲液平衡柱子后上样。再用5倍柱体积的偶联缓冲液洗柱。在收集管中加入60-200 μ L中和液，利于维持抗体的生物活性，避免抗体失活。用5倍柱体积洗脱缓冲液洗脱抗体，并收集在步骤6的收集管中。可以得到纯化较高的单克隆抗体。这些抗体被命名为BP1-AGP抗体。实施例6单克隆抗体亲和常数的测定包被免疫用人血清中纯化出的糖基化AGP(G9885，Sigma)以及原核表达纯化的AGP，包被浓度为2 μ g/mL，100 μ L/孔，4°C包被过夜，I XPBST洗3次。每孔加200 μ L封闭液37°C封闭2小时，IXPBST洗3次。抗AGP单克隆抗体(BP1-AGP)以及商品单克隆抗体(A5566，Sigma)，从1: 200开始2倍梯度稀释，最后I孔留空白对照，37°C孵育I小时，IXPBST洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1: 20000稀释，每孔100 μ L，37°C孵育I小时，I XPBST洗3次。显色液100 μ L/孔显色10分钟，50 μ L/孔终止液终止反应。用酶标仪测定吸光值。亲和常数
权利要求
1.一种制备单克隆抗体的方法，其特征在于制备特异性识别糖基化修饰的蛋白的抗体。
2.权利要求1所述的单克隆抗体的备方法，其特征在于其免疫方法将带有外源目的基因稳定细胞株与弗氏完全佐剂混合后，经皮下注射到C57BL/6J小鼠脾脏侧的腰窝处。
3.权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所使用的注射免疫用细胞株是近亲动物来源的肿瘤细胞。
4.权利要求1所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述外源基因带有RFP标签。
5.权利要求1所述单克隆抗体的制备方法，其包括分泌蛋白和那些位于细胞质膜上，虽然不能被分泌到胞外，但有部分序列伸出到胞外的蛋白。
6.权利要求1所述单克隆抗体的制备方法中，其包括除糖基化蛋白质之外的其他翻译后修饰形式蛋白质的特异性单克隆抗体的生产。
7.权利要求1所述单克隆抗体的制备方法中，其包括使用该思路通过除C57BL/6J小鼠之外的其他动物生产特异性抗体的方法。
全文摘要
本发明旨在提供一个制备针对糖基化修饰蛋白质的单克隆抗体杂交瘤的方法。该方法通过将稳定表达外源目的基因的细胞株免疫与宿主细胞同来源的小鼠，使用糖基化和非糖基化的目的蛋白对单克隆抗体同时进行筛选，以获得特异针对糖基化修饰蛋白的单克隆抗体杂交瘤。
文档编号C07K16/18GK103102411SQ201210499609
公开日2013年5月15日 申请日期2009年6月11日 优先权日2009年6月11日
发明者任艳, 韦汉福, 潘秦, 刘玲, 徐宁志, 刘国振, 吴 琳, 刘斯奇 申请人:北京华大蛋白质研发中心有限公司