专利名称：抑制补体激活的修饰的蛋白酶的制作方法
技术领域：
本发明提供了调节补体系统的方法及化合物。本发明特别提供了抑制补体激活的化合物及促进补体激活的化合物。所述化合物由于其对于补体系统的作用而是治疗剂。 因此，抑制补体激活的化合物可用于治疗缺血性和再灌注疾病，包括心肌梗塞和中风、脓毒症、自身免疫疾病、炎症疾病及具有炎症成分的疾病，包括阿尔茨海默病及其它神经变性疾病。背景补体(C)系统是免疫系统的一部分，在消除侵入的病原体和引发炎症应答中起作用。人及其它哺乳动物的补体系统包括30种以上的可溶和膜结合的蛋白质，参与一系列顺序反应，导致补体激活。血液补体系统具有与广谱宿主防御机制相关的众多功能，包括抗微生物和抗病毒作用。衍生自C成分激活的产物包括非自身识别分子C3b、C4b和C5b，以及影响多种细胞免疫应答的过敏毒素C3a、C4a和C5a。这些过敏毒素也发挥促炎剂作用。补体系统由一系列酶和非酶蛋白质及受体组成。补体激活是通过已知的“经典”途径、“旁路”途径和“凝集素”途径的三种主要模式之一而发生的(见
图1)。这些途径可以通过引发补体激活的过程而区分。经典途径是通过抗体-抗原复合物或者聚集形式的免疫球蛋白而引发的；旁路途径是通过微生物和细胞表面上的结构识别而引发的；凝集素途径是抗体非依赖性途径，通过甘露聚糖结合凝集素(MBL，也称作甘露糖结合蛋白)与碳水化合物如细菌或病毒表面上展示的那些碳水化合物的结合而引发的。该级联反应的激活导致产生参与蛋白酶解或细胞裂解的复合物以及参与调理作用、过敏反应和趋化性的肽。补体级联反应是动物免疫应答的重要成分，是不可逆的级联。许多蛋白质辅因子调节该过程。不适当的调节、典型是不适当的激活该过程是包含不适当的炎症应答(如在急性和慢性炎症疾病中观测到的那些应答)的多种病变的一方面或者可以发生这样的病变。这些疾病和病症包括自身免疫疾病，如类风湿性关节炎和狼疮，心血管疾病及其它炎症疾病，如脓毒症和缺血-再灌注损伤。由于补体途径参与许多疾病和病症，因此补体途径的成分是治疗干预的靶位，特别是抑制该途径的靶位。这种治疗的例子包括合成的和天然的小分子治疗剂，抗体抑制剂， 及重组可溶形式的膜补体调节蛋白。制备这种治疗剂的策略受到许多限制。小分子在体内具有短的半寿期，需要持续注入以保持补体抑制作用，从而限制了其作用、尤其在慢性疾病中的作用。治疗性抗体在对象中产生免疫应答，并因此可以在治疗特别是在调节免疫应答的治疗中引起并发症。因此，还需要用于治疗补体介导的疾病及其中补体激活起作用的疾病的治疗剂。这些疾病包括急性和慢性炎症疾病。因此，本发明的一个目的是提供靶向补体级联激活的这种治疗剂及提供治疗疾病的治疗剂和方法。概述本发明提供了靶向补体级联激活的治疗剂和方法及治疗疾病包括急性和慢性炎症疾病的方法。所述治疗剂是靶向补体途径底物的非补体蛋白酶。所述非补体蛋白酶包括未修饰的蛋白酶，其裂解其天然底物以及补体底物，及修饰的蛋白酶，其对于靶底物具有增加的选择性或底物特异性。所述修饰的蛋白酶对于其天然底物可呈现降低或改变的活性。本发明提供的方法是调节补体激活的方法，所述方法是将非补体蛋白酶与补体途径的任一或多种如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30或更多种靶底物接触，从而靶底物蛋白质被裂解，由此改变包含所述靶底物的途径中的补体激活。本发明还提供了蛋白酶在治疗和/或配制药物中的应用。这些方法及本文提供的任何方法和应用中的靶底物是补体蛋白质，包括Clq、C2、C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL、因子B、因子 D、因子 P、MASP-1、MASP-2、Clr、Cls、C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba、Bb 和纤维胶凝蛋白(ficolin)。所述接触可以是离体(ex vivo)、在体外和/或在体内进行。示例的靶位包括具有 SEQ ID NO』98、四9、300、302、304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、 319、320、321、322、326、328、330、332、334、335、338、340、344、660-662 任一所示氨基酸序列的那些靶位，及呈现补体途径活性的任何靶位片段，或者其等位基因或物种变体，或者具有 60、70、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高序列相同性的多肽。对于本文提供的所有方法和应用而言，所述靶底物可以存在于体液或者组织样品中，或者可以是靶底物的集合或者含有这种底物的任何其他组合物。根据靶底物，补体激活可以被抑制或激活。所述方法靶向一或多个补体途径。因此，调节的补体途径可以选自补体的经典途径、旁路途径和凝集素途径的一或多个。非补体蛋白酶与未修饰的蛋白酶或支架蛋白酶相比在任一或多个氨基酸残基如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35或更多个残基含有修饰。修饰的氨基酸残基增加了对于靶底物的特异性或者对于靶底物的活性之一或者二者。未修饰的蛋白酶或支架蛋白酶的例子包括任一种丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，例如粒酶B、粒酶A、粒酶M、组织蛋白酶G、MT_SP1、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、糜酶(chymase)、α-类胰蛋白酶、β-类胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、胶原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、蛋白质C、u_纤溶酶原激活物(u-PA)、t-纤解酶原激活物(t-PA)、纤溶酶、血浆激肽释放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、克鲁蛋白酶(cruzain)、金属蛋白酶及其等位基因变体、 同工型和催化活性部分。例如，所述支架蛋白酶包含如下任一氨基酸序列或其催化活性部分、其等位基因和物种变体及具有60、70、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高序列相同性的多肽SEQ ID NO :2、4、8、77、79、83、85、87、89、93、99、117、119、121、123、132、134、138、 142、144、146、148、162、166、168、170、172、174、176、178、180、182、190、192、194、196、198、 200、202、204、206、208、218、220、222、224、226、238、248、250、260、262、280、282、373、375、 377、379、381、383、385、387、547、549 及 551。MT-SP1 或其片段，如 SEQ ID NO :2 和 10 分别所示的多肽序列，是一种支架蛋白酶实例。补体途径的C2或C3蛋白质是MT-SPl蛋白酶、 修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的示例靶底物。MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的修饰包括在第146、224、41和/或151位的修饰(基于糜蛋白酶编号)。这种修饰的MT-SPl蛋白酶包括具有基于糜蛋白酶编号如下任一修饰的那些蛋白酶I41T/Y146D/G151L/K224F、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、及 I41T/Y146D/G151L/ Q175D/K224N、141T/Y146D/G151L/K224N, Y146D/G151L/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/ K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、 I41T/Y146D/ G151L/Q175Y/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N 及 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K2MN。特别地，修饰的 MT-SPl 含有氨基酸修饰 I41T/Y146D/G151L/K2MF。所述修饰可以是在有助于扩展的底物特异性或者相互作用的二级位点的任一或多个氨基酸中，例如，基于糜蛋白酶编号在相应于MT-SPl蛋白酶的97、146、192和2M任一或多个氨基酸位置的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分中的修饰。这种修饰的例子是基于糜蛋白酶编号的MT-SPl蛋白酶的一或多个F97、Y146、Q192和K2M的修饰，如F97D、F97E、 F97A、F97W、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Q192R、Q192V、K224A 和 K224F。这种修饰的MT-SPl蛋白酶的例子包括具有SEQ ID NO 16、18、20、22、对、26、沘、30、32、34、36、 14,38和40及405-418所示任一氨基酸序列的那些多肽。修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的其它例子包括氨基酸修饰Y146D/K224F或Y146E，如相应于具有SEQID NO :12、 404,28或412所示氨基酸序列的修饰的MT-SPl多肽的那些蛋白酶。MT-SPl蛋白酶及其催化活性部分包括含有基于糜蛋白酶编号如下一或多种修饰的多肽:F97N、F97D、F97E、F99Y、F99V、F99W、D217A、D217V、F97A、F97W、F99A、Y146N、Y146D、 Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、W215F、W215Y、Q192V、Q192R、Q192F、K224A、K224F、M180E、 Y146D/K224F、 D96A、 Y146E/K224N、 I41T/Y146E/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/K224F、 I41T/ Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/ G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/ Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/ L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/ Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、 Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/ Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/Y146D/ K224F、 I41L/Y146D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/K224F、 I41A/Y146D/K224F、 I41E/Y146D/ K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、 Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/Y146D/ Q175D/K224R、 I41T/Y146D/Q175D/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、 I41T/Y146D/ G151L/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、 I41T/Y146E/Q175D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/ Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、Y146D/ Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/G151L/ Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、 I41T/ Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/ K224N和I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K2MN。这种修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的例子包括具有 SEQ ID NO :12、14、16、18、20、22、对、26、沘、30、32、34、36、38、40-69、 404-418、419-447、524-533、552-659或663-710所示任一氨基酸序列的那些多肽。特别地， 修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分是具有SEQ ID NO :596或650所示氨基酸序列的一种。对于本文提供的所有方法和应用而言，可以选择修饰以便所述修饰的蛋白酶如 MT-SPl裂解靶底物的底物识别位点。靶底物是任一的上述补体途径多肽并且为本领域技术人员所已知，包括例如C2和/或C3。例如，在靶底物是C2的情况中，所述底物识别位点包括氨基酸序列SLGR (SEQ ID NO :392)。本文提供的方法和应用中靶向的其它识别位点包括因子I底物识别位点，如 LPSR (SEQ ID NO :388)、SLLR (SEQ ID NO :389)或 HRGR (SEQ ID NO :390)。MT-SPl 蛋白酶或其催化活性部分中的修饰可以相应于基于糜蛋白酶编号的MT-SPl蛋白酶第174、217、96、 192、146或99位的任一或多个氨基酸位置，如基于糜蛋白酶编号MT-SPl蛋白酶的Q174、 D217、D96、Q192、Y146*F99的任一或多个氨基酸。这种修饰的例子是选自如下的一或多种修饰Q174H、D217Q、D217N、D217H、D96A、D96V、D96F、D96S、D96T、Q192L、Q192I、Q192F、 Y146F、F99A、F99V、F99S 及 F99G (见例如具有 SEQ ID NO :41-57 或 419-435 所示任一氨基酸序列的多肽)。另一识别位点包括氨基酸序列LPSR。针对其识别而加以修饰的修饰的蛋白酶的例子是在相应于基于糜蛋白酶编号的MT-SPl蛋白酶的第174、180、215、192或99位的任一或多个氨基酸例如基于糜蛋白酶编号在MT-SPl蛋白酶的Q174、M180、W215、Q192或F99 的任一或多个氨基酸位置的位点具有修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分。这种修饰的例子是任一或多个 Q174F、Q174V、Q174L、Q174Y、M180E、W215F、W215Y、Q192K、Q192R、 Q192Y 及 F99Y (见例如具有 SEQ ID NO :36、58、59、61、62、69、416、436、437、439、440、447 或 524-533所示任一氨基酸序列的修饰的MT-SPl多肽)。用于本发明方法中的另一底物识别位点包括氨基酸序列HRGR。具有识别这种位点的修饰的蛋白酶的例子是具有以下修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分，所述修饰是在相应于基于糜蛋白酶编号的MT-SPl蛋白酶的第215、174,217,192和99位例如基于糜蛋白酶编号在MT-SPl蛋白酶的W215、Q174、D217、Q192和F99的任一或多个氨基酸位置的修饰。所述修饰的例子是选自任一或多个W215F、W215Y、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R、Q174K、 D217A、D217V、Q192E、F99W 和 F99Y (例如相应于含有 SEQ ID NO 58-69 和 436-447 所示任一氨基酸序列的修饰的MT-SPl多肽的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分)。本发明提供了治疗补体介导的疾病和其症状通过调节补体途径而改善的疾病的方法，所述补体途径包括经典、旁路和凝集素途径的一或多个途径。在实施本发明的方法中，将一或多种非补体蛋白酶与一或多种靶底物接触，如通过在体外、体内或离体给予，从而所述非补体蛋白酶裂解补体途径的任一或多种靶底物，由此包含所述靶底物的途径中的补体激活被改变。本发明还提供了非补体蛋白酶在治疗这类疾病和病变和/或配制进行这种治疗的药物中的应用。调节包括抑制或增强(增加)补体激活。补体激活的抑制可以导致与补体介导的病变相关的炎症症状的减少。炎症疾病的例子是神经变性疾病和心血管疾病，例如但非限于脓毒症、类风湿性关节炎(RA)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、哮喘、炎症性肠病、免疫复合物(IC)-介导的急性炎症性组织损伤、阿尔茨海默病(AD)、缺血-再灌注损伤和Guillan-Barre综合征。补体介导的疾病可以是对对象进行的治疗所导致。缺血-再灌注损伤可以是选自如下的事件或治疗所引起的 心肌梗塞(Ml)、中风、血管成形术、冠状动脉旁路搭桥术、心肺转流术(CPB)及血液透析。本发明提供的治疗方法可以通过在治疗对象明显病变之前给予对象非补体蛋白酶而实现。正如所指出的，可以通过将体液或者组织样品在体外、离体或在体内与非补体蛋白酶接触而实现给予。补体介导的缺血-再灌注损伤是这种病变的一个例子。导致这种病变的治疗是血管成形术或冠状动脉旁路搭桥术。正如上文所述，在本文提供的任何方法和应用中，靶底物包括一或多种Clq、C2、 C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL、因子 B、因子 D、因子 P、MASP-1、MASP-2、Clr、Cls、 C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba、m3 和纤维胶凝蛋白，如含有 SEQ ID NO :298、299、300、302、 304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、326、328、330、332、 334、335、338、340或344所示任一氨基酸序列或其呈现补体活性的片段的底物。在这些方法和应用及本文提供的所有方法和应用中，所述非补体蛋白酶与未修饰的蛋白酶或支架蛋白酶相比较可包括在任一或多个氨基酸残基的修饰，其中修饰的氨基酸残基增加对于靶底物的特异性或者对于靶底物的活性或者这二者。未修饰的蛋白酶或支架蛋白酶包括任一种丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，如粒酶B、粒酶A、粒酶M、组织蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、糜酶、 α-类胰蛋白酶、β-类胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、胶原酶、因子XII、因子XI、因子CII、 因子X、凝血酶、蛋白质C、U-纤溶酶原激活物(u-PA)、t-纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶、 血浆激肽释放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、克鲁蛋白酶、金属蛋白酶及其等位基因变体、同工型和催化活性部分。例子是含有或具有如下任一氨基酸序列的那些蛋白酶:SEQ ID NO :2、4、8、77、79、83、85、87、89、93、99、117、119、121、123、132、134、138、 142、144、146、148、162、166、168、170、172、174、176、178、180、182、190、192、194、196、198、 200、202、204、206、208、218、220、222、224、226、238、248、250、260、262、280、282、373、375、 377、379、381、383、385、387、547、549和551及其催化活性部分。MT-SPl是本发明提供的一种支架蛋白酶实例并如上文描述。裂解可靶向于上述识别序列。本文描述的任何修饰的MT-SPl包括如上述任何MT-SPl可用于治疗方法中。用于本文提供的治疗中的修饰的 MT-SPl多肽或其催化活性部分的例子包括具有SEQ IDNO 12、14、16、18、20、22、24、26、28、 30、32、34、36、38、40-69、404-418、419-447、524-533、552-659 或 663-710 所示任一氨基酸序列的任何多肽或其催化活性部分。特别地，用于本文提供的治疗中的MT-SPl多肽或其催化活性部分具有SEQ ID NO 596或650所示氨基酸序列。在本文提供的任何或所有方法和应用中，非补体蛋白酶或其催化活性部分可以与治疗补体介导的疾病或任何其它疾病的另一种药物或治疗组合给予。所述另一种药物或治疗可以与所述非补体蛋白酶同时、相继、或交替给予。所述另一种药物可以作为单独的组合物或者与所述非补体蛋白酶于同一组合物中给予。另一种药物的例子是抗炎剂和抗凝血剂，例如但非限于任一或多种NSAID、抗代谢物、皮质类固醇、镇痛药、胞毒剂、促炎细胞因子抑制剂、抗炎细胞因子、B细胞靶向剂、靶向T抗原的化合物、粘附分子阻断剂、 趋化因子受体拮抗剂、激酶抑制剂、PPAR-Y配体、补体抑制剂、肝素、华法林、醋硝香豆素 (acenocoumarol)、苯茚二酮、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、阿加曲班(argatroban)、来匹卢定 (Iepirudin)、比伐卢定(bivalirudin)禾口希美力口群(ximelagatran)。本发明还提供了非补体蛋白酶及其它成分的组合物，如试剂、另一些药物，及给予所述蛋白酶和/或药剂及任何其它成分的装置和容器。所述组合物可以实施或实现本文提供的方法和应用。因此本发明提供的组合物成分例如包括(a)裂解补体途径的任一或多种补体靶底物的非补体蛋白酶，由此包含所述靶底物的途径中的补体激活被改变； 及(b)治疗补体介导的疾病的另一种药物，例如但非限于抗炎剂或抗凝剂，例如任一或多种NSAID、抗代谢物、皮质类固醇、镇痛药、胞毒剂、促炎细胞因子抑制剂、抗炎细胞因子、B 细胞靶向剂、靶向T抗原的化合物、粘附分子阻断剂、趋化因子受体拮抗剂、激酶抑制剂、 PPAR-Y配体、补体抑制剂、肝素、华法林、醋硝香豆素、苯茚二酮、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、 阿加曲班、来匹卢定、比伐卢定和希美加群。正如所指出的，所述组合物用于实施或实现本文所述调节补体途径的任何方法， 所述补体途径如补体的经典途径、旁路途径或凝集素途径的一或多个。靶底物和支架蛋白酶包括上述那些任何靶底物和支架蛋白酶。例如，支架蛋白酶包括表14所示任何蛋白酶及表14所示蛋白酶的等位基因变体、同工型和催化活性部分。这种蛋白酶的例子包括具有或含有如下所示任一氨基酸序列或其催化活性部分或其等位基因或物种变体的任何蛋白酶 SEQ ID NO :2、4、8、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、 109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、128、130、132、134、136、138、140、142、144、 146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、 222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、 260、262、264、266、268、269、270、272、274、276、278、280、282、284、286、287、289、291、293、 295、297、373、375、377、379、381、383、385、387、544、545、547、549 和 551。在一些实例中，所述组合物中使用的蛋白酶是MT-SPl或其催化活性部分，如SEQ ID NO :2或10所示MT-SPl， 及上述变体。正如上文所述，MT-SPl蛋白酶及其催化活性部分包括含有基于糜蛋白酶编号的如下一或多种修饰的多肽F97N、F97D、F97E、F99Y、F99V、F99W、D217A、D217V、F97A、 F97W、F99A、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、W215F、W215Y、Q192V、Q192R、Q192F、K224A、K224F、M180E、Y146D/K224F、D96A、Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224R、I41T/ Y146D/K224F、I41T/Y146E/Q175D/K224N、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/ K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、Q221aD、Y146E/ K224R,Y146E/Q175D/K224N,Y146D/K224R,I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F,Y146E/Q175D/ K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175L/ K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/ Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K24L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、 Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、 H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、I41T/Y146E/K224L、I41F/ Y146D/K224F、 I41L/Y146D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/K224F、 I41A/Y146D/K224F、 I41E/ Y146D/K224F、I41D/Y146D/K224L、I41D/Y146D/K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/ K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224L、I41T/ Y146D/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/Q175D/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、 I41T/ Y146D/G151L/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/ K224N、 I41T/Y146E/Q175D/K224F、 I41T/Y146E/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/G151L/K224N、 Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175R/K224N、 Y146D/Q175K/K224N、Y146D/Q175H/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F、I41T/Y146D/ G151L/Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、 I41T/Y146D/G151L/ Q175H/K2MN和I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K2MN。这种修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的例子包括具有 SEQ ID NO :12、14、16、18、20、22、对、26、沘、30、32、34、36、38、40-69、 404-418、419-447、524-533、552-659或663-710所示任一氨基酸序列的那些多肽。特别地， 修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分具有SEQ ID NO :596或650所示氨基酸序列。在一些情况中，MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分中的修饰包括有助于扩展的底物特异性或相互作用二级位点的任一或多个氨基酸的修饰。这种修饰的例子包括但非限于在相应于基于糜蛋白酶编号的MT-SPl蛋白酶第97、146、192和2 位的任一或多个氨基酸位置的修饰。这种修饰的例子是基于糜蛋白酶编号在MT-SPl蛋白酶F97、Y146、Q192和K2M的任一或多个氨基酸中的修饰，如MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分中的修饰选自任一或多个 F97D、F97E、F97A、F97W、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Q192R、Q192V、K224A、 和K2MF(例如MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分相应于具有SEQ ID NO 16、18、20、22、24、 洸、28、30、32、；34、36、14、38和40及405-418所示任一氨基酸序列的修饰的MT-SPl多肽和 /或在Y146D和K224F或Y146E位置具有修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分，如具有 SEQ ID NO :12、404、28或412所示氨基酸序列的那些修饰的MT-SPl多肽)。在本发明提供的组合物和方法及应用中，所述非补体蛋白酶可裂解靶底物的底物识别位点。识别位点的例子如上文所述。本发明还提供了特殊修饰的非补体蛋白酶。例如本发明提供了在支架蛋白酶的任一或多个氨基酸中含有修饰的非补体蛋白酶，其中所述修饰的氨基酸残基增加对于靶底物的特异性或对于靶底物的活性或者这二者，其中所述靶底物是补体蛋白质，如上述任何靶底物或其混合物及其原料。所述修饰的非补体蛋白酶包括上述任何合适的支架，如支架蛋白酶选自粒酶B、粒酶A、粒酶M、组织蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、糜酶、 α-类胰蛋白酶、β-类胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、胶原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、蛋白质C、U-纤溶酶原激活物(u-PA)、t-纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶、血浆激肽释放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、克鲁蛋白酶、金属蛋白酶及其等位基因变体、同工型和催化活性部分。靶底物包括上述任何靶底物，例如但非限于C2 和/或C3。修饰的非补体蛋白酶的例子包括基于MT-SPl支架(全长或其催化活性部分)的那些蛋白酶。所述MT-SPl支架包括一个或者至少两或多个修饰，其中基于糜蛋白酶编号， 一个修饰是在第146位，另一个修饰在第2M位，条件是(i)在蛋白酶仅包括两个修饰的情况中，所述蛋白酶不包括Y146D和K2MF作为这两个修饰；及(ii)在蛋白酶含有三个修饰的情况中，所述蛋白酶不包括F99V或I或L或T 与Y146D和K2MF。例如，这种修饰的非补体蛋白酶可含有至少两或多个修饰，基于糜蛋白酶编号，其中一个修饰在第146位，另一个修饰在第2M位，条件是(i)在蛋白酶仅包括两个修饰的情况中，所述蛋白酶不包括Y146D和K224F作为这两个修饰；及(ii)在蛋白酶含有三个修饰的情况中，所述蛋白酶不包括F99V或I或L或T与Y146D和K2MF。MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分也包括在第141位和/或第41位含有一个或者至少两或多个修饰的修饰的蛋白质。上述任何修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的例子包括含有基于糜蛋白酶编号的如下任何修饰的修饰的MT-SPl 141T/Y146D/G151L/K224F, I41T/Y146D/ G151L/Q175D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R、 和 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K2MN、141T/Y146D/G151L/K224N,Y146D/G151L/K224N, I41T/ Y146D/G151L/Q175K/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/ K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/ G151L/Q175R/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N 和 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/ K224N。这种修饰的蛋白酶的例子包括具有选自如下基于糜蛋白酶编号的任一或多个修饰的 MT-SPl 蛋白酶或其催化活性部分D96A、D96V、D96F、D96F、D96S、D96T、F99S、F99G、 Q174H、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R、Q174K、Q174L、Q174Y、Q192L、Q192I、Q192E、Q192K、 Q192Y、D217Q、D217N、D217H、K224A。例子是含有或具有 SEQ ID NO :41-51、56、57、60_64、 67,419-429,431,434,435,438-442 或 445 所示任一氨基酸序列的 MT-SPl 蛋白酶。修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分的例子还包括具有基于糜蛋白酶编号的如下任一修饰的任何MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分Y146E/K2MN、I41T/Y146E/ Q175D/K224R、 I41T/Y146D/K224F、 I41T/Y146E/Q175D/K224N、 I41T/Y146E/G151L/Q175D/ K224L、Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/ K224N、Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/ Q175D/K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/ Q175L/K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/D224L、Y146E/Q221aE/ K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/ Q175F/K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/ D217F/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/K224T、 I41T/Y146E/K224L、 I41F/Y146D/K224F、 I41L/Y146D/K224F、 I41T/Y146D/ G151L/K224F、 I41A/Y146D/K224F、 I41E/Y146D/K224F、 I41D/Y146D/K224L、 I41D/Y146D/ K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/ K224F、 I41T/Y146D/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/Q175D/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/G151L/ Q175D/K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F、及 I41T/Y146E/ Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/ G151L/K224N,Y146D/Q175R/K224N,Y146D/Q175K/K224N,Y146D/Q175H/K224N,I41T/Y146D/ G151L/Q175K/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/G151L/ Q175R/K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N 及 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N。这种蛋白酶的例子是具有如下所示任一氨基酸序列的任何蛋白酶SEQ ID NO :41-51,56,57, 60-64、67、69、419-429、431、434、435、438-442、445、524、525、527-530、532、533、552-659 或 663-710。特别地，修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分具有SEQ ID NO :596或650所示氨基酸序列。本发明提供的修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分是裂解靶底物、典型在靶底物的底物识别位点裂解靶底物的那些MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分。靶底物的例子包括C2或C3。C2的裂解可以在C2中的底物识别位点SLGR(SEQ ID NO 392)处。在支架蛋白酶的任一或多个氨基酸中含有修饰的经修饰的非补体蛋白酶中，所述修饰的氨基酸残基增加对于靶底物的特异性或者低于靶底物的活性或者这二者，其中所述靶底物是一种补体蛋白质，与不具有修饰的相对比，这种具有修饰的修饰的非补体蛋白酶不裂解VEGF或VEGFR或者呈现VEGF或VEGFR的裂解活性降低或者呈现对于靶底物如补体蛋白质较对VEGF或VEGFR更高的底物特异性或活性。例如，所述非补体蛋白酶裂解补体蛋白质较其裂解VEGF或VEGFR具有至少或大约1倍、1. 5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、 100倍、200倍、500倍、1000倍或更高的特异性或活性。所述靶底物包括补体蛋白质，例如但非限于任一或多种 Clq、C2、C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL、因子 B、因子 D、因子 P、MASP-1、MASP-2、Clr、Cls、C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba、Bb 和纤维胶凝蛋白。靴底物的例子包括但非限于含有如下所示任一个氨基酸序列或其呈现补体活性的片段的靶底物=SEQ ID NO :298、299、300、302、304、305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、 320、321、322、326、328、330、332、334、335、338、340 和 344。支架蛋白酶包括任何蛋白酶，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或者金属蛋白酶，如表14列出的任何蛋白酶，及其等位基因和物种变体、同工型和催化活性部分，及其与本文表中或别处提供的任何蛋白酶具有60、65、70、75、 80、85、90、95、96、97、98、99%或更高序列相同性的修饰的形式，如含有如下所示任一氨基酸序列的支架蛋白酶或其催化活性部分=SEQ ID NO :2、4、8、71、73、75、77、79、81、83、85、 87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、 128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、 166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、 204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、 242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、269、270、272、274、276、278、280、282、284、286、287、289、291、293、295、297、373、375、377、379、381、383、385、387、 544,545,547,549和551。所述支架可用于制备修饰的蛋白酶及用于本文所述任何方法或应用中。如上文所述，MT-SPl或其催化活性片段是这种蛋白酶的一个实例。MT-SPl蛋白酶或其一部分的一个例子具有SEQ ID NO :2或10所示氨基酸序列。修饰包括改变底物特异性或选择性的任何修饰，特别是增加底物对于补体蛋白质的特异性或选择性的那些修饰。这种修饰的例子是具有基于糜蛋白酶编号的如下任何修饰的MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分D96A、D96V、D96F、D96F、D96S、D96T、F97D、F97E、F97A、F97ff、F99A、F99S、F99G、 F99W、F99Y、Y146N、Y146D、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、Q174H、Q174A、Q174V、Q174F、Q174R、 Q174K、Q174L、Q174Y、M180E、Q192R、Q192V、Q192L、Q192I、Q192F、Q192E、Q192K、Q192Y、 W215F、W215Y、D217Q、D217N、D217H、D217A、D217V、K224A、Y146E/K224N、I41T/Y146E/Q175D/ K224R、 I41T/Y146D/K224F、 I41T/Y146E/Q175D/K224N、 I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224L、 Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N、 Q221aD、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/ K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/L224L、G147E、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/ K224L、Y146D/Q175L/K224L、Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、 Y146E/K224A、Y146D/Q175H/K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/ K224L、Y146D/Q175F/K225L、Y146D/Q221aL/K224S、I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/ K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、Y146E/ K224T、 I41T/Y146E/K224L、 I41F/Y146D/K224F、 I41L/Y146D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/ K224F、 I41A/Y146D/K224F、 I41E/Y146D/K224F、 I41D/Y146D/K224L、 I41D/Y146D/K224F、 Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/K224F、 I41T/Y146D/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/Q175D/K224N、 I41T/ Y146D/G151L/Q175D/K224F, I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L, I41T/Y146D/G151L/Q175D/ K224R、I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、I41T/Y146E/Q175D/K224F 和 I41T/Y146E/Q175D/ K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/ K224N,Y146D/Q175R/K224N,Y146D/Q175K/K224N,Y146D/Q175H/K224N,I41T/Y146D/G151L/ Q175K/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、 I41T/ Y146D/G151L/Q175Y/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/ K224N、I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N 和 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N，及其等位基因和物种变体和同工型及与其具有60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%或更高序列相同性及包括相应修饰的变体。例如，修饰的MT-SPl多肽含有SEQ ID NOS :41_51、56、57、 60-64、67、69、419-429、431、434、435、438-442、445、524、525、527-530、532、533、552-659、 或663-710所示任一氨基酸序列。本发明还提供了含有本发明提供的任何修饰的非补体蛋白酶或组合成分的药物组合物。如果需要，则所述药物组合物包括药物可接受的赋形剂及其它成分。根据任何希望的或合适的给予途径配制所述组合物，所述给予途径包括但非限于全身给予、口服、经鼻、 肺、局部(local)或表面(topical)给予。本发明提供了试剂盒。所述试剂盒可用于实施本发明方法。本发明提供了含有组合物的试剂盒。本发明还提供了含有药物组合物的试剂盒。所述试剂盒也可以含有给予所述组合物和/或蛋白酶的装置，及任选给药说明书及用于所述方法中的其它试剂和产品。本发明还提供了编码任何修饰的非补体蛋白酶的核酸分子。这些核酸分子是编码或者在中等或高度严格条件下与编码SEQ ID NO :12、14、16、18、20、22、24、洸、28、30、32、 34、36、38、40-69、404-418、419-447、524-533、552-659 或 663-710 所示任何多肽的任何核酸杂交的核酸分子。这些核酸分子还包括选自如下的那些核酸分子a)包含 SEQ ID NOS :11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、451_455、 457-462、464-479和534-538所示任一核苷酸序列的核酸分子；b)包含与 SEQ ID NO :11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、451_455、 457-462、464-479、534-538 所示核苷酸序列具有至少 60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99%序列相同性的核酸分子；c)在中等或高度严格条件下其全长的至少70%与包含SEQ ID NOS :11、13、15、 17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、451-455、457-462、464-479、534-538 所示任何核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸；d)包含a)、b)或C)的简并密码子的核酸分子；或者e)包含 SEQ ID NO :11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、451_455、 457-462、464-479、534-538或者a)_d)任一的剪接变体或等位基因变体的核酸分子，或者核酸分子选自如下之中a)包含 SEQ ID NO :480-493、495-499、501-506、508-523、539_543 所示任何核苷酸序列的核酸分子；b)包含与 SEQ ID NO :480-493、495-499、501-506、508-523、539_543 所示核苷酸序列具有至少 60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%序列相同性的核酸
分子；c)在中等或高度严格条件下其全长的至少70%与包含SEQ ID NO =480-493, 495-499、501-506、508-523、539-543所示任何核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸；d)包含a)、b)或c)的简并密码子的核酸分子；或者e)包含 SEQ ID NO :480-493、495-499、501-506、508-523、539_543 或者 a) _d)任
一的剪接变体或等位基因变体的核酸分子。含有所述核酸分子的载体。载体包括真核表达载体和原核表达载体，包括哺乳动物和酵母载体。本发明还提供了含有所述核酸分子和/或载体的细胞。表达载体的例子包括但非限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、EBV、SV40、巨细胞病毒载体、痘苗病毒载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和人工染色体。本文还提供了产生或制备编码的非补体蛋白酶的方法。所述载体或核酸分子被导入细胞中并在一定条件下培养，从而表达所述蛋白酶。所述核酸分子可包括编码指导表达的蛋白酶交通(trafficking)的信号序列例如分泌信号序列的序列。可以通过本领域技术人员已知的常规方法纯化表达的蛋白酶。本发明提供了通过给予对象核酸分子、载体或细胞的治疗方法。所治疗的疾病包括由补体蛋白质或者补体途径介导或参与的任何疾病，如具有潜在炎症成分或病理学的疾病。载体包括整合进宿主细胞染色体的表达载体或者保留附加体的载体。给予可以是体内给予或离体给予。离体治疗包括将所述核酸在体外给予细胞，随后将所述细胞给予对象。所述细胞可以来自合适的(相容的)供体或者来自治疗对象如人。
本发明还提供了融合蛋白，其含有与非蛋白酶多肽融合的任何非补体蛋白酶的催化活性部分。融合可以通过在任一末端插入非蛋白酶多肽或键而实现。附图简述图1描述了经典、凝集素和旁路补体途径及终末补体复合物膜攻击复合物(MAC) 的激活。图中特别示出参与补体级联的30种以上的蛋白质、它们在该级联中的作用及在合适情况中它们在补体途径中的会聚点(points of convergence)。例如，这三个途径集中于C3转变酶的产生，其裂解C3形成C5转变酶，导致MAC复合物形成。图中还描述了许多补体裂解产物的产生。所述途径中描述的所有蛋白质均可作为靶底物。详细描述
概述
A.定义
B.靶补体
1.命名法
2.补体开始途径
a.经典途径
b.旁路途径
C.凝集素途径
3.补体介导的效应功能
a.补体介导的裂解膜攻击复合物
b.炎症
C.趋化性
d.调理作用
e.体液免疫应答的激活
4.补体受体
5.补体调节
a.因子I
6.补体介导的疾病
a.由补体激活介导的疾病
i.类风湿性关节炎
ii.脓毒症
iii.多发性硬化
iv.阿尔茨海默病
v.缺血-再灌注损伤
b.由补体缺陷介导的疾病
C.蛋白酶
1.蛋白酶的分类
a.丝氨酸蛋白酶
i. MT-SPl
ii.粒酶B
b.半胱氨酸蛋白酶
C.天冬氨酸蛋白酶
d.金属蛋白酶
e.苏氨酸蛋白酶
D.支架蛋白酶
1.修饰的支架蛋白酶
a.合理修饰
i.位置扫描库的合成及使用荧光筛选
b.经验修饰
2.评估特异性的方法
3.蛋白酶多肽
a. MT-SPl 多肽
E.评估或监测修饰的蛋白酶对补体介导的功能的活性的分析方法
a.蛋白质检测
i. SDS-PAGE
.酶免疫测定
iii.放射免疫扩散法(RID)
b.溶血反应
F.产生编码修饰的蛋白酶的核酸的方法及产生修饰的蛋白酶多肽的方法
1.载体和细胞
2.表达
a.原核生物
b.酵母
C.昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
3.纯化技术
4.融合蛋白
5.核苷酸序列
G.使用方法配制/包装/给予
1.修饰的蛋白酶多肽的给予
2.编码修饰的蛋白酶多肽的核酸的给予(基因治疗)
H.治疗应用
1.免疫介导的炎症疾病
2.神经变性疾病
3.心血管疾病
I.组合治疗
J.实施例
A.定义
除非特别指出，则本文的所有技术和科学术语均具有本发明所属技术领域技术人员通常理解的相同含义。除非特别指出，则本文提及的所有专利、专利申请、公布的申请和出版物、Genbank序列、数据库、网站及其它公开的材料均以其全部内容并入作参考。在文中的术语有多种含义的情况中，在本文中使用其常用含义。当引用URL或其他标识符或地址时，应理解这种标识符可能改变并且因特网上特定信息可能变来变去，但是相同信息可以通过搜索因特网发现。这种引用证实了这种信息的可获得性和公开传播。如本文所用，MBL (甘露糖结合凝集素)也称作甘露糖结合蛋白(MBP)。如本文所用，补体激活是指由多种激活物包括例如抗原-抗体复合物、脂多糖或者微生物多糖引发的血清成分Cl至C9的相继激活，通过任何途径而产生炎症应答。 如本文所用，“补体蛋白，，或者“补体成分”是补体系统蛋白质，其在对抗感染和炎症过程的宿主防御中发挥作用。补体蛋白构成本文提供的蛋白酶及修饰的蛋白酶的靶底物。补体蛋白是在所有脊椎动物中发现的一组相互作用血液蛋白质和糖蛋白。除了结合补体反应产物及在炎症细胞和免疫系统细胞上出现的细胞表面受体之外，有至少30种可溶的血浆蛋白质。另外，还具有保护宿主细胞免于意外补体攻击的调节性膜蛋白。补体蛋白包括在经典途径中发挥作用的那些蛋白质，例如C2 ；在旁路途径中发挥作用的那些蛋白质，例如因子B ；及在凝集素途径中发挥作用的那些蛋白质，例如MASP-1。在这些补体蛋白质中是蛋白酶参与补体途径。另外，如本文所用，补体蛋白包括任何“裂解产物”(也称作“片段”)，其是基于补体级联的激活而形成。补体蛋白还包括无活性或改变形式的补体蛋白，如 iC3 和 C3a-desArg。因此，补体蛋白包括但非限于Clq、Clr、Cls、C2、C3、C3a、C3b、C3c、C3dg、C3g、C3d、 C3f > iC3、C3a_desArg、C4、C4a、C4b、iC4、C4a_desArg、C5、C5a、C5a-des_Arg、C6、C7、C8、 C9、MASP-1、MASP-2、MBL、因子 B、因子 D、因子 H、因子 I、CRl、CR2、CR3、CR4、备解素、C1 Inh、 C4bp、MCP、DAF,⑶59 (MIRL)、簇蛋白和HRF及任何补体蛋白的等位基因变体和物种变体。如本文所用，“天然”形式的补体蛋白是在不存在补体激活的条件下可分离自生物体如脊椎动物的补体蛋白，其未在实验室中人为有意修饰。天然补体蛋白的例子包括Clq、 (11~、(18、02、03、04、因子8、因子0、备解素、05、06、07、〇6 和 C9。通常地，天然补体蛋白是无活性的，在激活的基础上获得活性。激活可需要活化裂解、成熟裂解和/或与其它蛋白质的复合物形成。一个例外是因子I和因子D，在其天然形式就具有酶活性。在一些实例中，天然补体蛋白的激活在蛋白质裂解后发生。例如，补体酶原如C2和因子B是通过蛋白酶裂解自身激活的蛋白酶，如此C2由蛋白酶Cl s裂解产生 C2b，C2b与C4b结合形成具有蛋白酶解活性的C4l32b(C3转变酶)，蛋白酶因子D裂解因子 B产生恥，其与Ob结合形成蛋白酶解活性的另一种C3转变酶，(北恥。在另一个实例中， 无活性的天然补体蛋白的裂解导致蛋白质的结构稳定性改变，导致该蛋白质激活。例如，C3 和C4含有内部硫酯键，其在天然蛋白质中是稳定的，但是在蛋白质裂解所致构象变化之后可以变为高度反应性和活性的。因此，C3和C4的裂解产物是生物学活性的。C3和C4的激活也可在无裂解的情况中自发发生。这是天然C3中硫酯键的自发转化，这是补体旁路途径的引发事件。在其它实例中，天然补体蛋白的激活在释放出抑制其它活性天然补体蛋白的活性的复合调节分子之后发生。例如，Clinh结合并失活Cls和Clr，除非它们与Clq复合。
如本文所用，成熟裂解是指酶原激活所需的任何裂解的统称。其包括导致构象变化而产生活性的裂解(即活化裂解)。其还包括其中关键的结合位点被暴露或者位阻被暴露或者抑制性节段被除去或移动的裂解。如本文所用，改变形式的补体蛋白是指以对其分子结构进行修饰获得的非天然形式存在的补体蛋白。例如，硫酯与水的C3反应可以在无转变酶裂解的条件下发生，产生称作iC3和iC4的水解无活性形式的C3和C4。在另一个实例中，过敏毒素(包括C3a、Cfe和 C4a)可以通过羧肽酶N脱精氨酸化(desarginated)为更稳定、更低活性形式。如本文所用，补体蛋白的“片段”或“裂解产物”是含有天然补体蛋白多肽序列一部分的补体蛋白亚组(subset)。补体蛋白的片段通常在任一或多个如1、2或3个补体级联激活之后获得。通常，片段得自天然补体蛋白的蛋白酶解裂解。例如，因子B由因子D酶解，产生两个片段组成B的N末端部分的Ba，组成C末端部分并含有丝氨酸蛋白酶位点的恥。补体蛋白的片段也得自补体蛋白另一片段的蛋白酶解。例如，Ob是由C3裂解产生的片段，其由因子I裂解产生片段iC!3b和C3f。通常补体蛋白的裂解产物是生物学活性产物， 发挥裂解补体系统效应分子的作用。因此，补体蛋白的片段或一部分包括补体蛋白的裂解产物，也包括保留或呈现至少一种活性的蛋白质的部分。如本文所用，“裂解效应分子”或者“裂解效应蛋白”是指由于补体系统的触发的酶级联的结果而产生的活性裂解产物。裂解效应分子、得自补体激活的片段或裂解产物可助于任一或多种补体介导的功能或活性，包括调理作用、过敏反应、细胞裂解和炎症。裂解或效应分子的例子包括但非限于C3a、C3b、C4a、C4b、C5a、C5b-9和恥。补体系统的裂解效应分子依靠参与级联而呈现活性，包括刺激炎症、促进抗原吞噬和直接裂解一些细胞。补体裂解产物促进或参与补体途径的激活。如本文所用，过敏毒素(例如C3a、Wa或C5a)是触发参与炎症应答特别是作为防御寄生虫的一部分的肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱粒(从中释放物质)的裂解效应蛋白。 如果脱粒太强，则其可导致过敏反应。过敏毒素也间接介导平滑肌细胞痉挛(如支气管痉挛)，增加毛细血管的通透性和趋化性。如本文所用，趋化性是指受体介导的白细胞向化学引诱物方向运动，典型是其浓度增加的方向，如过敏毒素浓度增加的方向。如本文所用，调理作用是指病原体或其它颗粒的表面的改变，由此其被吞噬细胞吞噬。结合或改变病原体表面的蛋白质被称作调理素。抗体和补体蛋白使胞外细菌易受调理素的作用，以被吞噬细胞如嗜中性粒细胞和巨噬细胞摄取和破坏。如本文所用，细胞裂解是指通过破坏细胞壁或细胞膜而分裂细胞。红细胞溶血是细胞裂解的一个测量标准。如本文所用，“蛋白酶”和“肽酶”可互换用于描述催化共价肽键水解的酶。这些名称包括其酶原形式及激活的单链、双链和多链形式。为清晰而见，提及蛋白酶是指所有形式。蛋白酶包括例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，根据其活性位点的催化活性和裂解靶底物的肽键的机制而定。如本文所用，酶原是指通过蛋白酶解激活的蛋白酶，所述蛋白酶解包括成熟裂解如活化裂解和/或与其它蛋白质和/或辅因子的复合物形成。酶原是蛋白酶解酶的无活性前体。这种前体通常比活性形式更大，尽管非必需更大。对于丝氨酸蛋白酶，通过特异性裂解包括催化和自身催化裂解或者通过结合激活辅因子而产生活性酶，酶原被转变为活性酶。因此，酶原是一种酶无活性的蛋白质，通过激活物的作用而被转变为蛋白酶解酶。裂解可以是自身催化实现的。许多补体蛋白是酶原，它们是无活性的，但是基于感染后补体系统引发而变为裂解和激活的。酶原通常是无活性的，通过对酶原的前区(proregion)进行催化或者自身催化裂解而可被转变为成熟活性多肽。如本文所用，“前区”、“前肽(prop印tide) ”或“前序列(pro sequence) ”是指被裂解产生成熟蛋白质的区域或节段。这可以包括通过掩蔽催化机制并因此阻止催化中间物形成(即通过空间位阻底物结合位点)而发挥抑制酶活性功能的节段。前区是位于成熟的生物学活性多肽的氨基末端的氨基酸序列，可以小如几个氨基酸或者可以是多结构域结构。如本文所用，活化序列是指酶原中为形成活性蛋白酶所需活化裂解或成熟裂解的部位的氨基酸序列。活化序列的裂解可以是自身催化裂解或者通过激活配偶体而裂解。活化裂解是一种成熟裂解，其中发生为活性所需的构象改变。这是一种经典的活化途径，例如，对于丝氨酸蛋白酶，其中裂解产生新的N末端，其与催化机构的保守区如催化残基相互作用，诱导为活性所需的构象改变。活化可以导致多链形式的蛋白酶产生。在一些情况中，单链形式的蛋白酶可呈现与单链相同的蛋白酶解活性。如本文所用，结构域是指分子如蛋白质或编码核酸的一部分，其与所述分子的其它部分在结构上和/或功能上不同，是可鉴别的。如本文所用，蛋白酶结构域是蛋白酶的催化活性部分。提及的蛋白酶的蛋白酶结构域包括任何这些蛋白质的单链、双链和多链形式。蛋白质的蛋白酶结构域含有所有该蛋白质蛋白酶解活性所需的所有必需性质，例如其催化中心。 如本文所用，蛋白酶的催化活性部分是指保留蛋白酶活性的蛋白酶结构域或其任何片段或一部分。显然，至少在体外，所述单链形式的蛋白酶及其催化结构域或蛋白酶解活性部分(典型C末端截短)呈现蛋白酶活性。如本文所用，“编码蛋白酶结构域或其催化活性部分的核酸”是指仅编码所述单链蛋白酶结构域或其活性部分而不编码该蛋白酶其它邻近部分作为连续序列的核酸。如本文所用，基本上由蛋白酶结构域组成的多肽是指所述多肽的仅一部分是蛋白酶结构域或其催化活性部分。所述多肽可任选及通常包括例外的非蛋白酶衍生的氨基酸序列。如本文所用，“S1-S4”是指形成底物的P1-P4残基的结合位点的氨基酸残基(见例如 Schecter and Berger (1967) Biochem Biophys Res Commun27 :157-162)。S1—S4 的每一个均含有1、2或多个残基，其可以是不连续的。这些位点从是识别位点N末端至蛋白酶解位点相继编号，称作易断裂键。如本文所用，术语“P1-P4”和“ΡΓ -P4，”是指底物肽中分别与S1-S4和Si，-S4， 残基特异性相互作用及被所述蛋白酶裂解的残基。P1-P4是指位于裂解位点N末端侧的残基位置；ΡΓ -P4’是指位于裂解位点C末端侧的残基位置。氨基酸残基从多肽底物的N末端至C末端标记(Pi，...，P3，P2，P1，P1'，P2'，P3'，. . .，Pj)。标示出各自的结合亚位点(Si，. . .，S3，S2，Si，Sl'，S2'，S3'，. . .，Sj)。所述裂解是在 Pl 与 P1，之间催化。如本文所用，“结合口袋”是指与底物上一或多个特定氨基酸相互作用的一或多个残基。“特异性口袋”是较其它口袋提供更多能量的结合口袋(最重要的或者占优势的结合口袋)。典型地，所述结合步骤在为发生催化过程必需的过渡状态形成之前。S1-S4 和Si，-S4’氨基酸组成底物序列结合口袋并通过分别与肽、多肽或蛋白质底物的P1-P4和 ΡΓ-Ρ4’氨基酸相互作用而促进底物识别。蛋白酶是否与底物相互作用是S1-S4和Sl’-S4’ 位置中的氨基酸的函数。如果任一或多个31、52、53、54、51，、52，、53，和S4’亚位点中的氨基酸与底物中P1、P2、P3、P4、P1’、P2’、P3’和Ρ4’位点中的任一或多个氨基酸相互作用或识别其，则所述蛋白酶可裂解该底物。结合口袋将靶氨基酸与蛋白酶定位在一起，以便实现肽键的催化和底物的裂解。例如，丝氨酸蛋白酶典型识别底物中Ρ4-Ρ2’位点；其它蛋白酶可具有超过Ρ4-Ρ2’的扩展识别。如本文所用，“有助于扩展底物特异性”的氨基酸是指除了特异性口袋之外在活性位点裂缝中的那些残基。这些氨基酸包括蛋白酶中的S1-S4、S1’ -S4’残基。如本文所用，相互作用的二级位点在活性位点裂缝之外。这些可有助于底物识别和催化作用。这些氨基酸包括可有助于与底物的第二和第三层相互作用的氨基酸。例如， S1-S4周围的蛋白酶结构中的环。Si，-S4，氨基酸在底物中定位Ρ1_Ρ4、ΡΓ -Ρ4’氨基酸中起作用，从而指示蛋白酶活性位点中的易断裂的键。如本文所用，蛋白酶的活性位点是指其中发生底物催化作用的底物结合位点。活性位点的结构和化学性质允许识别和结合底物及随后水解和裂解底物中的易断裂键。蛋白酶的活性位点含有有助于肽裂解的催化机制的氨基酸以及有助于底物序列识别的氨基酸， 如有助于扩展底物结合特异性的氨基酸。如本文所用，丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶的催化三元体(triad)是指丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶的活性位点中的并有助于肽裂解的催化机制的三个氨基酸组合。通常地，催化三元体在丝氨酸蛋白酶中发现，提供了活性亲核试剂和酸/碱催化作用。所述丝氨酸蛋白酶的催化三元体含有三个氨基酸，在糜蛋白酶中是ASp1(l2、HiS57和Ser195。这些残基对于丝氨酸蛋白酶的催化效力是关键的。如本文所用，“底物识别位点”或“裂解序列”是指由蛋白酶裂解的蛋白酶的活性位点识别的序列。典型地，例如对于丝氨酸蛋白酶而言，裂解序列由底物中的P1-P4和 ΡΓ-Ρ4’氨基酸组成，其中在Pl位置后发生裂解。典型地，丝氨酸蛋白酶的裂解序列的长度为6个残基以匹配许多蛋白酶的扩展的底物特异性，但是根据蛋白酶而可以更长或较短。 例如，为自身催化所需的MT-SPl的底物识别位点或裂解序列是RQARVV，其中R在P4位置，Q 在P3位置，A在P2位置，R在Pl位置。MT-SPl中的裂解发生在位置R后，后面是序列VVGG。如本文所用，靶底物是指由蛋白酶裂解的底物。典型地，靶底物是由蛋白酶在其底物识别位点裂解。靶底物最低限度地包括组成裂解序列的氨基酸。任选地，靶底物包括含有所述裂解序列及任何其它氨基酸的肽。含有蛋白酶识别的裂解序列的全长蛋白质、其等位基因变体、同工型或其任何部分是该蛋白酶的靶底物。例如，对于本发明补体失活之目的而言，靶底物是含有由蛋白酶识别的裂解序列的任一或多种如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、 30,40或更多种补体蛋白，或者其任何部分或片段。这种靶底物可以是纯化的蛋白质，或者可以存在于混合物中，如在体外的混合物或在体内的混合物。混合物可包括例如血液或血清或者其它组织液。另外，靶底物包括含有不影响蛋白酶对底物的裂解的其它部分的肽或蛋白质。例如，靶底物可包括与荧光部分连接的四个氨基酸的肽或者全长蛋白质。所述蛋白酶可以被修饰为呈现对于靶底物的更高的底物特异性。
如本文所用，裂解是指蛋白酶对肽键的破坏。蛋白酶的裂解位点基序包括易断裂键的N和C末端残基(分别为imprimed和primed侧，蛋白酶的裂解位点称作...P3-P2-P1-P1' -P2' -P3'...，裂解在Pl与P1，残基之间发生)。典型地，底物的裂解是活化裂解或抑制性裂解。活化裂解是指多肽从无活性形式至活性形式的裂解。这种裂解包括例如酶原至活性酶的裂解，和/或前生长因子至活性生长因子的裂解。例如，MT-SPl 可以通过在RQAR的P1-P4序列裂解靶底物而自身激活。活化裂解也是其中蛋白质被裂解为一或多个自身具有活性的蛋白质的裂解。例如，补体系统是不可逆的蛋白酶解事件级联，其最终导致刺激炎症、促进抗原吞噬作用及直接裂解一些细胞的多种效应物分子的形成。因此，C3由转变酶裂解为C3a和Ob是活化裂解。如本文所用，抑制性裂解是蛋白质裂解为一或多个无功能的降解产物的裂解。抑制性裂解导致蛋白质活性的降低或减少。典型地，蛋白质活性的降低减少了该蛋白质参与的途径或过程。在一个实例中，是抑制性裂解的任一或多种补体蛋白的裂解导致补体的经典途径、凝集素途径或旁路功能性途径的任一或多种途径的伴随减少或抑制。抑制性是指与天然形式的蛋白质相比，所述裂解使得活性降低至少大约10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、 60%,70%,80%,90%,95%,99. 9%或更高。为抑制性裂解所需的蛋白质裂解百分比根据蛋白质而不同，但是可以通过分析蛋白质的活性而确定。如本文所用，裂解VEGF或VEGFR的蛋白酶是指经修饰为裂解VEGF或VEGFR或者以其天然形式裂解VEGF或VEGFR的蛋白酶，从而降低或者失活VEGF或VEGFR复合物的信号化，特别是可以表明如血管发生、特别是不希望的血管发生的生物学作用的细胞增殖信号化。VEGF或VEGFR由蛋白酶的裂解可以通过使用本领域技术人员已知的评价VEGF或VEGFR 功能的方法和检验分析VEGF或VEGFR的活性而确定。如本文所用，不裂解VEGF或VEGFR的蛋白酶(修饰或未修饰的)是指不降低或失活VEGF或VEGFR复合物的信号化的蛋白酶。特别地，在本文中所述蛋白酶与含有相应裂解序列(即RRVR)的VEGF或VEGFR蛋白或者肽底物相比具有对于靶底物(即补体蛋白)更高的底物特异性或活性，例如大约1倍、1. 5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、 300倍、400倍或更高倍数。对于本发明，补体蛋白与VEGF或VEGFR蛋白或肽底物的裂解对比是在与蛋白酶裂解补体蛋白的相同反应条件下进行。如本文所用，“支架”或“蛋白酶支架”是指可以加以修饰以改变其靶特异性的原型蛋白酶。支架包括野生型蛋白酶，其等位基因变体和同工型。它们可以作为修饰的起始物， 以产生具有靶向特异性的蛋白酶。如本文所用，“修饰的蛋白质”或者“突变蛋白酶”是指与支架蛋白酶相比在一级序列中具有一或多个修饰的蛋白酶多肽(蛋白质)。所述一或多个突变可以是一或多个氨基酸置换(取代)、插入、缺失及其任何组合。修饰的蛋白酶多肽包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个修饰位置的那些蛋白酶。修饰的蛋白酶可以是全长支架蛋白酶，或者可以是修饰的全长支架蛋白酶的催化活性部分以及在改变蛋白酶活性或底物特异性区域含有修饰的蛋白酶及所述蛋白酶是蛋白酶解活性的。通常地，这些突变改变了支架蛋白酶裂解任一或多个补体蛋白的特异性和活性。除了含有改变蛋白酶的底物特异性的区域中的修饰之外，修饰的蛋白酶也可容许为蛋白酶的底物特异性非必需的区域中的其它修饰。因此，修饰的蛋白酶与相应的野生型或支架蛋白酶的氨基酸序列典型具有 60%,70%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 更高的序列相同性。修饰的蛋白酶的修饰的全长蛋白酶或其催化活性部分可包括作为融合蛋白的蛋白酶，只要所述融合自身不改变蛋白酶的底物特异性即可。如本文所用，糜蛋白酶编号是指SEQ ID NO :8所示成熟糜蛋白酶多肽的氨基酸编号。可以用糜蛋白酶产生另一种蛋白酶的蛋白酶结构域排列，例如MT-SPl蛋白酶结构域。 在这种情况中，相应于糜蛋白酶的氨基酸的MT-SPl氨基酸并给予糜蛋白酶氨基酸的编号。 本领域技术人员使用人工排列或者使用众多可利用的排列程序(例如BLASTP)通过这种排列可以确定相应位置。相应位置也可以基于结构排列，例如使用蛋白质结构的计算机模拟排列。相应于揭示的序列中的氨基酸的多肽的氨基酸是指基于使用标准排列算法如GAP算法，排列具有所述揭示的序列的多肽以最大化相同性或同源性(其中排列对比保守的氨基酸)时鉴别的氨基酸。例如，基于MT-SPl (SEQ ID NO=IO)丝氨酸蛋白酶结构域与成熟糜蛋白酶的排列对比，在MT-SPl中第1位的V在糜蛋白酶中编号为V16。由此对随后的氨基酸进行编号。在一个实例中，在全长MT-SPl (SEQ ID NO : 第708氨基酸位置或者在MT-SPl (SEQ ID NO 10)的蛋白酶结构域的第94位置的的F基于糜蛋白酶编号相应于F99。在一个残基在蛋白酶中存在而在糜蛋白酶中不存在的情况中，所述氨基酸残基以字母符号表示。例如， 糜蛋白酶中是具有第60位(基于糜蛋白酶编号)氨基酸的环的一部分但插入MT-SPl序列中的残基例如称作Asp60b或Arg60c。如本文所用，“抑制补体激活”或者“补体失活”是指通过蛋白酶减少或降低任一或多个补体途径补体介导的功能或活性，或者补体途径中任何蛋白质的活性减少和降低。补体的功能或活性可以在体外或体内发生。在本文可以检验和描述的补体的功能的例子包括溶血反应及测量任一或多种补体效应物分子的检验，如通过SDS PAGE及随后的Wfestern印迹或者考马斯亮蓝染色或者通过ELISA进行。蛋白酶可以抑制补体激活S^UO^JO^、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在其它实施方案中，与不存在蛋白酶的条件下补体的活性相比，补体激活被蛋白酶抑制40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、85 %、90 %、 95%或 99. 9%o如本文所用，对于靶底物的特异性是指蛋白酶对于靶底物较另一底物(非靶底物)优先裂解。特异性以特异性常数表示(k。at/Km)，，是蛋白酶对于其底物的亲和性和该酶的效力的一种测量标准。如本文所用，裂解的特异性常数为(k。at/Km)，其中Km是Michaelis-Menton常数 (一半Vfflax时的[S])，kcat是Vfflax/ [Ετ]，，其中Et是最终酶浓度。参数kcat、Kffl和kcat/Km可以根据底物浓度倒数相对于底物裂解速度倒数的曲线图计算，拟合为Lineweaver-Burk等式 (1/速率=(Km/Vmax)(l/[S])+1/Vmax ；其中Vmax= [ET]k。at)。可以使用确定在存在不同浓度底物的条件下随着时间出现的裂解增加的速度的任何方法计算特异性常数。例如，将底物与基于蛋白酶裂解而被释放的荧光部分连接。通过确定在不同酶浓度下裂解的速度，可以对于特定的蛋白酶确定k。at。特异性常数可用于确定蛋白酶的任一或多个S1-S4 口袋中的氨基酸较底物中伴随的P1-P4氨基酸的位点特异性优选性，这使用本领域标准方法进行， 如位置扫描组合库(positional scanning combinatorial library，PS-SCL)。另外，特异性常数也可以用于确定蛋白酶对于一种底物相对于另一底物的优选性。如本文所用，底物特异性是指蛋白酶对于一种底物相对于另一底物的优选性。底物特异性可以作为特异性常数的比率(ration)进行测量。如本文所用，底物特异性比率是特异性常数的比率，可用于比较两或多种蛋白酶或者蛋白酶对于两或多种底物的特异性。例如，蛋白酶对于竞争底物的底物特异性或者竞争蛋白酶对于底物的底物特异性可以通过比较k。at/Km而进行对比。例如，对于靶底物具有 2X106M-1sec-1特异性常数及对于非靶底物具有ZXlO^sec—1特异性常数的蛋白酶对于所述靶底物更具特异性。使用上述特异性常数，所述蛋白酶对于靶蛋白酶具有100的底物特异性比率。如本文所用，对于靶底物的优选性或底物特异性可以底物特异性比率表示。反映优选性的特定比值是底物与有争议的蛋白酶的函数。大于1的底物特异性比率表示对于靶底物的优选性，底物特异性小于1表示对于非靶底物的优选性。通常地，至少或大约为1的比率反映被考虑作为候选治疗剂的蛋白酶的显著差异。如本文所用，改变的特异性是指与起始的支架蛋白酶相比，修饰的蛋白酶的底物特异性的改变。通常地，特异性的改变反映与支架蛋白酶的野生型底物(在本文称作非靶底物)相比，修饰的蛋白酶对于靶底物的优选性的改变。典型地，本发明提供的修饰的蛋白酶与支架蛋白酶的底物特异性相比呈现对于任一或多种补体蛋白的底物特异性增加。例如，对于靶底物和非靶底物的底物特异性比率为100的修饰的蛋白酶与底物特异性比率为 10的支架蛋白酶相比呈现特异性增加10倍。在另一个实例中，底物特异性比率为1的修饰的蛋白酶与比率为0.1的相比呈现底物特异性增加10倍。为与支架蛋白酶相比呈现增加的特异性，修饰的蛋白酶对于任一或多种补体蛋白具有1. 5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100 倍、200倍、300倍、400倍、500倍或更高的底物特异性。如本文所用，当描述蛋白酶从竞争底物的混合物中选择及裂解一种靶底物时，“选择性”可以与特异性互换应用。可以确定蛋白酶对于一种靶底物较任何其它一或多种靶底物的选择性增加，例如通过比较蛋白酶对靶底物裂解的特异性常数而确定。例如，如果蛋白酶对于一种靶底物的裂解特异性常数为ZXlO6M-1Sec-1及对于任何其它一种底物的特异性常数为ZXlOfbec—1，则所述蛋白酶对于前者靶底物更具选择性。如本文所用，活性是指与全长(竞争)蛋白质相关的多肽或其一部分的功能活性或活性。功能活性包括但非限于生物学活性、催化或酶活性、抗原性(结合或与多肽竞争抗多肽抗体结合的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力，及特异性结合多肽的受体或配体的能力。如本文所用，补体蛋白的功能活性是指补体介导的功能，包括但非限于过敏反应、 调理作用、趋化性或者细胞裂解。检测补体活性的非限制性的检验方法包括红细胞溶血反应，及通过ELISA或SDS-PAGE检测补体效应物分子。如本文所用，催化活性或裂解活性是指检测选择的底物的蛋白酶解的体外蛋白酶解分析中评价的蛋白酶活性。裂解活性可以通过评价蛋白酶的催化效力而测定。如本文所用，对于靶底物的活性是指蛋白酶对于靶底物的裂解活性和/或功能活性，或者反应蛋白酶活性的其它测量法。蛋白酶对于补体蛋白靶底物的功能活性可以通过在补体分析中评价IC50而测量，所述补体分析例如是红细胞裂解反应或者本领域技术人员已知的或者本发明提供的评价补体活性的其它这种分析。裂解活性可以通过评价蛋白酶的催化效力而测量。对于本发明而言，如果与不存在所述蛋白酶的条件下相比，蛋白酶呈现较高的蛋白酶解或裂解靶底物活性和/或调节(即激活或抑制)补体蛋白的功能活性，则表示活性增加。如本文所用，丝氨酸蛋白酶或丝氨酸内肽酶是指一类肽酶，其特征在于在所述酶的活性中心存在丝氨酸残基。丝氨酸蛋白酶参与机体多种功能，包括凝血和炎症，以及在原核生物和真核生物中作为消化酶。丝氨酸蛋白酶的裂解机制基于丝氨酸对靶向的肽键的亲核攻击。半胱氨酸、苏氨酸或与天冬氨酸或金属结合的水分子也可发挥这种作用。丝氨酸、 组氨酸和天冬氨酸的侧链排列在一起形成大多数丝氨酸蛋白酶共有的催化三元体。丝氨酸蛋白酶的活性位点形成所述多肽底物结合的裂缝。如本文所用，补体蛋白酶是指参与任何途径途径中补体级联反应的产生和扩大的蛋白酶。这些蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶因子I、因子D、MBL-相关丝氨酸蛋白酶(MASP)-2、 MASP-U Cls, Clr、因子B、C2及转变酶，及在补体途径中出现的影响补体激活的任何其它蛋白酶。特别地，补体蛋白酶是任何未修饰的补体蛋白酶，包括因子I、因子D、MASP-2、 MASP-l、Cls、Clr、因子 B 和 C2。如本文所用，非补体蛋白酶是任一或多个补体途径中非正常一部分的任何蛋白酶。如本文所用，MT-SPl是指丝氨酸蛋白酶，基于kr、His和Lys活性位点残基的位置是丝氨酸蛋白酶的Sl肽酶家族的一部分(也含有胰蛋白酶和糜蛋白酶)。MT-SPl特征在于一个跨膜结构域、两个CUB结构域、四个LDLR重复及一个丝氨酸蛋白酶结构域(或肽酶Sl结构域)，所述丝氨酸蛋白酶结构域在丝氨酸蛋白酶的肽酶Sl家族的所有成员中是高度保守的，例如糜蛋白酶。示例的MT-SPl的序列示于SEQ ID NO :2。所述蛋白酶结构域在第615-邪4位氨基酸之间发生。MT-SPl蛋白酶包括全长MT-SPl或其任何催化活性部分，包括等位基因变体和物种变体及由剪接变体编码的变体。MT-SPl蛋白酶作为单链酶原及作为激活的双链多肽发生。所述MT-SPl包括其活性的单链和双链形式。特别感兴趣的是哺乳动物包括人源的 MT-SPl蛋白酶。MT-SPl蛋白酶也可包括大鼠或小鼠来源的那些。本领域技术人员通常意识到多肽的非必需区域中的单一氨基酸取代基本上不改变生物学活性(见例如Watson et al. Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987, The Benjamin/Cummings Pub. CO.，p. 224)。人源MT-SPl蛋白酶和/或其催化活性结构域的编码核酸分子的序列及编码的氨基酸序列示于SEQ ID N0:l、2、9和10。非人源的MT-SPl多肽是具有如小鼠(Mus musculus，SEQ ID NO :449)禾口大鼠(Rattus norvegicus, SEQ ID NO :450)中氛基酸序列的那些多肽。在本发明中，MT-SPl蛋白酶可以是支架MT-SP1。如本文所用，MT-SPl蛋白酶的“催化活性部分”是指保留蛋白酶活性的蛋白酶结构域或者其任何片段或一部分。例如MT-SPl的催化活性部分可以是MT-SPl蛋白酶结构域， 包括分离的单链形式蛋白酶结构域或活化的双链形式。如本文所用，修饰的MT-SPl蛋白酶是指与支架或未修饰的形式相比呈现改变的活性如改变的底物特异性的蛋白酶。这种蛋白酶与支架MT-SPl相比包括1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个修饰(即氨基酸变化)，由此MT-SP1蛋白酶裂解补体蛋白的活性如底物特异性或选择性被改变。修饰的MT-SPl可以是全长支架 MT-SP1，或者可以是全长支架蛋白酶的一部分，只要所述修饰的蛋白酶在一些区域中含有改变所述蛋白酶的活性或底物特异性的修饰及所述蛋白酶是蛋白酶解活性的即可。修饰的MT-SPl蛋白酶也可以在一些区域中包括不影响所述蛋白酶的底物特异性的其它修饰。 因此，修饰的MT-SPl蛋白酶典型地与野生型或支架MT-SPl的相应氨基酸序列具有60%、 70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列相同性。修饰的全长MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分可包括是融合蛋白的蛋白酶，只要所述融合蛋白具有所述靶特异性即可。如本文所用，人蛋白质是由人基因组中存在的核酸分子如DNA编码的一种蛋白质，包括其所有等位基因变体和保守变体。如果所述修饰基于人蛋白质的野生型或主流 (prominent)序列，则蛋白质的变体或修饰物是一种人蛋白质。如本文所用，天然发生的α-氨基酸的残基是自然发现的那些20种α-氨基酸的残基，通过具有其人体中同源mRNA密码子的荷电的tRNA分子的特异性识别而被掺入蛋白质中。如本文所用，非天然发生的氨基酸是指不是遗传编码的氨基酸。如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当是指探针或引物时，其任选被标记，如用可检测的标记物如荧光或放射性标记物标记，预期是单链分子。这种分子典型是其靶位在统计学上是唯一的这样的长度或者拷贝数较低(典型为少于5个，通常少于3个)以探查或引发(priming)文库。 探针和引物通常含有与感兴趣的基因互补或相同的至少14、16或30个连续核苷酸的序列。 探针和引物的长度可以是10、20、30、50、100或更多个核酸。如本文所用，肽是指长度为2至40个氨基酸的多肽。如本文所用，在本发明提供的各个氨基酸序列中出现的氨基酸根据其已知的三个字母或一个字母的缩写标示(表1)。在各个核酸片段中出现的核苷酸根据本领域通用的标准单字母命名法命名。如本文所用，“氨基酸”是含有氨基基团和羧酸基团的一种有机化合物。多肽含有两或多个氨基酸。对于本发明而言，氨基酸包括20种天然发生的氨基酸、非天然氨基酸及氨基酸类似物(即其中α-碳具有侧链的氨基酸)。如本文所用，在本文出现的各个氨基酸序列中出现的“氨基酸”是根据其熟知的三字母或单字母缩写标示的(见表1)。在各个DNA片段中出现的核苷酸以本领域通用的标准单字母命名法命名。如本文所用，“氨基酸残基”是指基于多肽在其肽键处的化学消化(水解)而形成的氨基酸。本文描述的氨基酸残基假定是“L”异构体形式。也如此命名的“D”异构体形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基，只要保留所述多肽希望的功能性质即可。NH2是指在多肽的氨基末端存在的游离氨基基团。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游离羧基基团。 与 J. Biol. Chem.，243 :3552-3559(1969)及采用的 37 C. F. R. § § 1. 821-1. 822 中描述的标准多肽命名法一致，氨基酸残基的缩写示于表1。表1-对应表
权利要求
1.修饰的非补体蛋白酶或其催化活性部分在制备调节补体激活的药物中的应用，其中所述非补体蛋白酶或其催化活性部分与未修饰的或者支架蛋白酶相比包含氨基酸修饰；所述修饰的一或多个氨基酸残基使得对于靶底物的特异性增加或对于靶底物的活性增加或者这二者增加，其中所述靶底物是补体蛋白，以及所述非补体蛋白酶或其催化活性部分当与补体途径的任一或多个靶底物接触时，导致所述靶底物蛋白的裂解，由此包含所述靶底物的途径的补体激活被改变。
2.一种药物组合物，其包含用于调节补体激活的修饰的非补体蛋白酶或其催化活性部分，其中所述非补体蛋白酶或其催化活性部分与未修饰的或者支架蛋白酶相比包含氨基酸修饰；所述修饰的一或多个氨基酸残基使得对于靶底物的特异性增加或对于靶底物的活性增加或者这二者增加，其中所述靶底物是补体蛋白，以及所述非补体蛋白酶或其催化活性部分当与补体途径的任一或多个靶底物接触时，导致所述靶底物蛋白的裂解，由此包含所述靶底物的途径的补体激活被改变。
3.权利要求1或2的药物组合物或应用，其中补体激活被抑制。
4.权利要求1-3任一项的药物组合物或应用，其中所述非补体蛋白酶与补体途径的任一或多个靶底物的接触在体外、体内或离体发生。
5.权利要求1-4任一项的药物组合物或应用，其中所述补体途径选自补体的经典途径、旁路途径和凝集素途径的一个或多个。
6.权利要求1-5任一项的药物组合物或应用，其中所述靶底物是如下任一或多种 Clq、C2、C3、iC3、C4、iC4、C5、C6、C7、C8、C9、MBL,因子 B、因子 D、因子 P、MASP-1、MASP-2、 Clr、Cls、C4b、C4a、C2b、C2a、C3b、C3a、Ba、Bb 和纤维胶凝蛋白。
7.权利要求1-6任一项的药物组合物或应用，其中所述靶底物包含如下任一个氨基酸序列或者包含所述氨基酸序列的呈现补体活性的片段SEQ ID NO :298,299,300,302,304, 305、306、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、326、328、330、332、334、 335、338、340、344 和 660-662。
8.权利要求1-7任一项的药物组合物或应用，其中所述未修饰的或支架蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或金属蛋白酶中的任一种。
9.权利要求1-8任一项的药物组合物或应用，其中所述未修饰的或支架蛋白酶选自粒酶B、粒酶A、粒酶M、组织蛋白酶G、MT-SP1、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、糜酶、α-类胰蛋白酶、β-类胰蛋白酶I或II、糜蛋白酶、胶原酶、因子XII、因子XI、因子CII、因子X、凝血酶、 蛋白质C、U-纤溶酶原激活物(u-PA)、t-纤解酶原激活物(t-PA)、纤溶酶、血浆激肽释放酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、克鲁蛋白酶、金属蛋白酶及其等位基因变体、同工型和催化活性部分。
10.权利要求1-9任一项的药物组合物或应用，其中所述支架蛋白酶包含如下任一个氨基酸序列或其催化活性部分:SEQ ID NO :2、4、8、77、79、83、85、87、89、93、99、117、119、 121、123、132、134、138、142、144、146、148、162、166、168、170、172、174、176、178、180、182、·190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、218、220、222、224、226、238、248、250、260、 262、280、282、373、375、377、379、381、383、385、387、547、549 和 551。
11.权利要求9的药物组合物或应用，其中所述支架蛋白酶是MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分。
12.权利要求11的药物组合物或应用，其中MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分包含SEQ ID NO 2或10所示的氨基酸序列或是其等位基因或物种变体。
13.权利要求11或12的药物组合物或应用，其中所述靶底物是C2或C3。
14.权利要求11-13任一项的药物组合物或应用，其中所述MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分中的一或多个修饰选自在选自基于糜蛋白酶编号的41、97、146、151、192和2M位置的位置上具有修饰的蛋白酶。
15.权利要求11-14任一项的药物组合物或应用，其中所述MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分中的多个修饰在有助于扩展的底物特异性或者相互作用的二级位点的任一或多个氨基酸中。
16.权利要求11-15任一项的药物组合物或应用，其中所述MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分包含选自如下的修饰I41T、Ι41Α、I41F、I41D、Ι41Ε、R60cD、R60cW、D96A、D96V、 D96F、D96F、D96S、D96T、F97D、F97E、F97A、F97W、F99A、F99S、F99G、F99Y、F99V、F99W、H143V、 Y146N、Y146D、Y146F、Y146E、Y146A、Y146W、Y146R、G147E、G151L、L172N, Q174H、Q174A、 Q174V、Q174F、Q174R、Q174K、Q174L、Q174Y、Q175D、Q175E、Q175H、Q175L、Q175F、Q175W、 Q175Y、Q175R、Q175K、M180E、Q192A、Q192F、Q192L、Q192I、Q192E、Q192K、Q192Y、Q192R、 Q192V、W215F、W215Y、D217A、D217F、D217V、D217Q、D217N、D217H、Q221aD、Q221aL、Q221aE、 K224A、K224L、K224R、K224N、K224T、K224Y、K224S 和 K224F。
17.权利要求11-16任一项的药物组合物或应用，其中所述MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分包含选自如下的基于糜蛋白酶编号的多个修饰Y146D/K2MF、Y146E/K224N, I41T/ Y146E/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/K224F、 I41T/Y146E/Q175D/K224N、 I41T/Y146E/G151L/ Q175D/K224L、Y146E/Q221aE/K224F、I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R、I41T/Y146E/G151L/ Q175D/K224N、Y146E/K224R、Y146E/Q175D/K224N、Y146D/K224R、I41T/Y146E/G151L/Q175D/ K224F、Y146E/Q175D/K224R、Y146E/K224L、Y146D/Q175D/K224R、Y146D/Q175L/K224L、 Y146D/Q175W/K224L、Y146D/K224L、Y146E/Q221aE/K224R、Y146E/K224A、Y146D/Q175H/ K224L、Y146D/Q175Y/K224L、Y146E/K224Y、Y146D/Q175F/K224L、Y146D/Q221aL/K224S、 I41E/Y146D/K224L、Y146D/D217F/K224L、H143V/Y146D/K224F、Y146E/K224F、Y146A/K224F、 Y146E/K224T、 I41T/Y146E/K224L、 I41F/Y146D/K224F、 I41L/Y146D/K224F、 I41T/Y146D/ G151L/K224F、 I41A/Y146D/K224F、 I41E/Y146D/K224F、 I41D/Y146D/K224L、 I41D/Y146D/ K224F、Y146N/K224F、I41T/Y146D/Q175D/K224F、Q192F/K224F、Y146D/Q192A/K224F、Q192V/ K224F、 I41T/Y146D/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/Q175D/K224R、 I41T/Y146D/Q175D/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224L、 I41T/Y146D/G151L/ Q175D/K224R、 I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N、 I41T/Y146E/Q175D/K224F、 I41T/Y146E/ Q175D/K224L、I41T/Y146D/G151L/K224N、Y146D/Q175D/K224N、Y146D/G151L/K224N、Y146D/ Q175R/K224N, Y146D/Q175K/K224N, Y146D/Q175H/K224N, I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F, I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F、 I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N、 I41T/ Y146D/G151L/Q175H/K224N、 I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N、 I41T/Y146D/K224N、 Y146D/ K224N 和 I41T/Y146D/K224L。
18.权利要求11-17任一项的药物组合物或应用，其中所述修饰的MT-SPl蛋白酶具有 SEQ ID NO :12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40-69、404-418、419-447、 524-533、552-659或663-710任一所示的氨基酸序列。
19.权利要求11-18任一项的药物组合物或应用，其中MT-SPl蛋白酶或其催化活性部分中的一或多个修饰是Y146D/K2MF或Y146E。
20.权利要求19的药物组合物或应用，其中所述修饰的MT-SPl多肽具有SEQID NO 596或650所示的氨基酸序列。
21.权利要求11-20任一项的药物组合物或应用，其中所述MT-SPl蛋白酶在底物识别位点裂解靶底物。
22.权利要求21的药物组合物或应用，其中所述靶底物是C2或C3。
23.权利要求22的药物组合物或应用，其中靶底物是C2，所述底物识别位点包括氨基酸序列 SLGR (SEQ ID NO :392)。
24.权利要求1-15任一项的药物组合物或应用，其中调节补体激活实现对患有补体介导病变的对象的治疗。
25.权利要求对的药物组合物或应用，其中补体激活的抑制导致与补体介导病变相关的炎症症状减少，所述补体介导病变选自炎症性疾病、神经变性疾病及心血管疾病。
26.权利要求25的药物组合物或应用，其中所述补体介导病变选自脓毒症、类风湿性关节炎(RA)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)、多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、哮喘、炎症性肠病、免疫复合物(IC)-介导的急性炎症性组织损伤、阿尔茨海默病(AD)、缺血-再灌注损伤及Guillan-Barre综合征。
27.权利要求沈的药物组合物或应用，其中所述缺血-再灌注损伤是由于选自如下的事件或治疗所致心肌梗塞(Ml)、中风、血管成形术、冠状动脉旁路搭桥术、心肺转流术 (CPB)及血液透析。
28.权利要求M-27任一项的药物组合物或应用，其中所述非补体蛋白酶或其催化活性部分与治疗补体介导病变的另一种药物组合配制用于施用。
29.权利要求观的药物组合物或应用，其中所述另一种药物是抗炎剂或抗凝剂。
30.权利要求四的药物组合物或应用，其中所述另一种药物选自如下任一或多种 NSAID、抗代谢药、皮质类固醇、镇痛药、胞毒剂、促炎细胞因子抑制剂、抗炎细胞因子、B细胞靶向剂、靶向T抗原的化合物、粘附分子阻断剂、趋化因子受体拮抗剂、激酶抑制剂、 PPAR-Y配体、补体抑制剂、肝素、华法林、醋硝香豆素、苯茚二酮、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、 阿加曲班、来匹卢定、比伐卢定和希美加群。
全文摘要
本发明提供了调节补体系统的方法和化合物。特别地，本发明提供了抑制补体激活的化合物及促进补体激活的化合物。所述化合物通过其对补体系统的作用而是治疗剂。因此，抑制补体激活的化合物可用于治疗缺血-再灌注疾病，包括心肌梗塞和中风、脓毒症、自身免疫疾病、炎症疾病及具有炎症成分的疾病，包括阿尔茨海默病及其它神经变性疾病。
文档编号A61P11/06GK102430117SQ20111032728
公开日2012年5月2日 申请日期2006年10月20日 优先权日2005年10月21日
发明者C·D·塔诺斯, E·L·麦迪逊, J·阮, S·W·拉格尔斯 申请人:催化剂生物科学公司