专利名称：靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体的制作方法
技术领域：
本发明涉及靶向性人造油体，其涉及一种通过OIeEGFR蛋白质中EGFR肽可精准地识别癌细胞表面的受体，并与脂质、脂溶性药物和/或已知荧光信号分子制成oleEGFR药物油体或oleEGFR检测油体，而达到能够专一性地识别癌化部位并能自行组装药物蛋白进行癌化部位检测、抑制及药物治疗的靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体。本发明利用油体膜蛋白连接EGFR肽而组装成oleEGFR油体，该油体能 包覆药物或是已知荧光信号分子，可以用在oleEGFR油体于靶向治疗或检测的应用。
背景技术：
癌症是目前威胁全球人类生命与健康的主要杀手，根据美国癌症协会统计，2007年全球约有760万人死于各类癌症。根据台湾卫生署统计，2008年全台湾约有38，913人死于恶性肿瘤。在十大主要死因中，恶性肿瘤连续居于首位，而十大主要癌症与死亡率顺位分别为(1)肺癌、⑵肝癌、⑶结肠直肠癌、⑷女性肺癌、(5)胃癌、(6) 口腔癌、(7)摄护腺癌、(8)子宫颈癌、(9)食道癌、(10)胰脏癌。由于癌症的闻发率与复发率,抗肿瘤药物的研发已经受到重视，依据美国药物研究与制造商协会(PhRMA)的数据显示，截至2008年3月31日为止，共有750种癌症治疗药物处于临床实验阶段，等待美国食品药品监督管理局(FDA)的批准(PhRMA，2008)。传统的癌症治疗方法大致分成下列几种，即外科手术疗法、放射疗法、化学疗法及免疫(基因)疗法。外科手术疗法主要可以直接、快速地移除恶性肿瘤，是最古老、传统且最常用的癌症治疗方式，对于肿瘤生长在身体局部一处时，直接切除方式有很好的治疗效果。若癌细胞扩散，外科手术后遗症是常需要切除肿瘤邻近组织及淋巴组织，常常因为切除过多的组织会造成病人局部功能缺损、障碍，还有手术猝死或弓I起并发症而致死等。放射疗法又称电疗，主要是使用放射线破坏癌细胞，针对癌细胞的方法有两种外在放射疗法及内在放射疗法。外在放射疗法是利用仪器将X光或Y射线释放于肿瘤上而杀死癌细胞。内在放射疗法是将放射物质以颗粒或胶囊方式置入癌症病人体内，对于不适合开刀或不宜切除的组织治疗常会选用此种放射疗法，有时放射疗法也会和外科疗法或化学疗法合并使用，此种方法的后遗症是恶心、呕吐、咳嗽或呼吸困难、吞咽困难、疲倦、掉头发和引发内脏破裂等。化学疗法化学疗法是利用化学物质或激素杀死癌细胞，此方法可以通过口服或注射方式进行治疗，化学疗法可广泛使用在各式肿瘤上。对难以控制及大范围转移或全身性的癌细胞杀死，化学疗法是唯一的、最后的选择，后遗症是全身细胞受到破坏，特别是对免疫淋巴球，治疗时间长，会引起全身细胞的抗药性。免疫疗法免疫疗法是利用病人身体不同的免疫机制作用物质如白介素、肿瘤坏死因子、单克隆抗体及疫苗等来对抗、破坏癌细胞的快速生长。免疫疗法也可以和上述三种常用的癌症治疗方法合并使用并能大幅降低副作用如疲倦、食欲不振、掉发、口腔或皮肤溃烂、恶心及牙齿掉落等大幅降低，并且可在治疗间隔期协助正常细胞慢慢修复，缓慢提升免疫力，并提升癌症的治疗效果，但是治疗时间长，效果也很有限。经过长时间的观察发现，癌细胞表面通常会带有某些特殊分子生物标记在于之前描述特性，这些年来已经发展出靶向治疗方法用于癌症的治疗。靶向治疗方法就是利用实验设计一种可以专一性地识别此类生物标记的药物方法，靶向治疗方法可以有效地阻断癌细胞的活化并且能使癌细胞生长受到抑制，而达到治疗目的。靶向治疗药物可以直接且精准地命中目标癌细胞，抑制癌细胞，对体内正常细胞的影响较小，相比于上述治疗方法，靶向治疗具有低毒性、低副作用、高效率、及施行方便等优点，已经引起大家的关注。目前靶向治疗的方法甚多，其一是利用载体组装、包覆、连结或镶嵌而成的治疗活性的药物分子，并运用各种机制将具有专一性的 活性药物分子递送到目标癌细胞进行作用，此种递送体系称为“药物递送体系”。通常会将载体与可专一性地识别癌细胞表面生物标记的物质结合，而使此载体具有靶向功能，所述物质可为蛋白质、类固醇、糖类、化合物或抗体等。载体目前有高分子聚合物颗粒、微胞(micell)、脂质体、及病毒载体等，这些载体也存在不同缺点，如载体粒径过大而不容易被人体吸收、载体容易聚集而不容易被人体吸收、具有毒性而无法排出体外、在血液或体液中不会稳定存在等，在实际运用中也很有限。而且在上述可识别癌细胞的物质与载体结合时，常常需要非常复杂耗时的化学合成步骤，往往会增加制造成本，更会对环境造成污染。所以，在药物递送体系中，也需要非常大的改良空间并改善成粒径微小、无毒性、在血液或体液中稳定、容易结合可识别癌细胞的药物载体体系。肿瘤细胞增生需要血管的新生，近年来，有关于阻断血管新生的研究证实了肺癌细胞常常有过度表达血管内皮生长因子受体(VEGFR)以及表皮细胞生长因子受体(EGFR)的情况，VEGFR及EGFR与肿瘤的恶性程度以及转移能力相当有关，检测发现肺癌病人都有高度表达的VEGFR及EGFR。本发明是利用E. coli的转基因技术生产出表皮生长因子蛋白(EGFR)，并在油体制造过程中将表皮因子(EGFR)标在纳米油体上，希望能使纳米油体来靶向肺癌细胞所高度表达的EGFR，达到肺癌肿瘤靶向的作用。本发明是利用油体做为载体并用转基因技术生产出表皮生长因子(EGFR)而形成oleEGFR，再加入脂质而组装形成oleEGFR油体，本发明试图利用oleEGFR油体包覆脂溶性药物(以下简称为包覆药物)而组成靶向人造纳米油体药物递送体系。本发明经过活体内(in vivo)及活体外(in vitro)的相关实验确认此体系毒性低、副作用低、效率高、稳定、制备过程方便及对环境造成污染甚低或是可以忽略。本发明利用靶向人造纳米油体给药体系，可以有效地运用于靶向治疗或是癌症检测，且具有高度的专一性。本发明是由不同可以合成出药物的类似物的肽或是对病症有治疗效果的肽，经过基因工程组成药物或是对病症有治疗效果的合成物或合成多蛋白，并连接上油体膜蛋白再接上EGFR肽，该油体可以包覆已知荧光信号分子并组装成自组装靶向药物油体膜蛋白，此蛋白能够专一性地识别癌化部位并能自行组装药物蛋白而进行癌化部位检测、抑制及药物治疗。纯化方式非常多，如沉淀法、分子筛层析法、电泳、亲和层析法和共价层析法是已知技术且用于细胞提取物中纯化蛋白质。而且需要表达有关蛋白酶抑制剂当作一种融合蛋白或嵌合蛋白。融合蛋白技术经常用在蛋白质的纯化过程中，提供一种"标记"或"操作"。一般而言，以这些体系表达的融合蛋白里面包含亲和标记，例如谷胱甘肽S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、纤维素结合结构域、聚组氨酸、聚半胱氨酸，蛋白A及链霉亲和素等等，所述标记共价结合于oleEGFR蛋白质的N-端或C-端。为方便亲和纯化，对此标记具有专一性的配体被固定于一个管柱的固态相上。融合蛋白结合至亲和柱，加入过量调整缓冲液(pH值)而冲提出高纯度的融合蛋白。oleEGFR蛋白从标记分子上的分离，以蛋白水解切割于其专一性接头序列。在所使用亲和柱的准备与操作上，虽然比较简便，但是价格非常昂贵，不符合经济效益。抗体固定化免疫亲和技术是利用一种表达的融合蛋白的结合方式，里面含有抗原性的寡肽标记，该标记有运用抗原性前端(antigenic head)部分及连接尾端(linking tail)部分。该抗原性部分组成是用一些可以快速引发抗原性反应的亲水性氨基酸。而连接区域可以标记在融合蛋白，从细胞分离后再融合蛋白上被切割，而得到该蛋白。使用抗体固定化免疫亲和技术对于纯化技术也很有限。本发明是利用AOB系统进行纯化，能更快速且更经济地得到融合蛋白。利用oleEGFR有专一性接头的油体，再利用蛋白水解酶切割专一性接头，可纯化出纯度高的EGFR蛋白质。
发明内容
本发明提供一种融合蛋白质(下文简称为oleEGFR蛋白质)，此蛋白包含EGFR肽与油体膜蛋白的组合。本发明也提供一种油体膜蛋白载体，其包含油体膜蛋白结合EGFR肽及任何油脂，而形成专一性的纳米油体，其中该oleEGFR蛋白质与该脂质的重量/体积比值(微克/微升)为至少约1/25，且该oleEGFR油体的平均粒径为纳米等级。本发明又利用oleEGFR蛋白质包覆已知荧光分子，可以用于识别专一性癌细胞的检测使用。本发明又利用oleEGFR蛋白质包覆药物，可以用于识别专一性癌细胞的靶向治疗使用。本发明又利用oleEGFR蛋白质包覆已知荧光分子和包覆药物，可以用于识别专一性癌细胞的检测及靶向治疗使用。本发明又利用类似oleEGFR药物油体，可以用于识别专一性癌细胞的靶向治疗使用。本发明又利用oleEGFR有专一'丨生接头的油体,再利用专一丨丨生蛋白酶水解切割专一性接头，可纯化出纯度高的EGFR蛋白质的应用。
图I、油体的构造。图2、oleEGFR油体的制备过程。
图3、EGFR蛋白纯化制备过程。图4、oleEGFR药物油体的制备过程。图5、oleEGFR蛋白质组成及自主装oleEGFR油体实验观察。图6、oleEGFR油体包覆GGK黄和尼罗红的油体显荧光微镜观察。图7、oleEGFR油体进行原子力显微镜测试。图8、oleEGFR油体的不同条件组成进行荧光显微镜观察(图示标尺2微米)。图9、oleEGFR油体的不同条件组成进行稳定度测试。图10、oleEGFR油体对细胞的体外测试荧光显微镜观察_ (固定)细胞。
图11、oleEGFR油体对细胞的体外测试荧光显微镜观察_(活)细胞。图12、oleEGFR油体对A549细胞测试荧光显微镜观察-不同(浓度)。图13、oleEGFR油体对A549细胞测试荧光显微镜观察-不同(时间)。图14、oleEGFR油体作用细胞进行流式细胞仪测试-不同(浓度)。图15、oleEGFR油体作用细胞进行流式细胞仪测试-不同(时间)。图16、oleEGFR油体作用A549细胞利用共轭荧光显微镜XY轴平面观察及Z轴切面观察。图17、oleEGFR油体包覆药物的稳定度测试。图18、oleEGFR油体包覆不同浓度喜树碱的毒性实验细胞计数(第72小时)-茄
红素、姜黄素和喜树碱。图19、oleEGFR油体包覆喜树碱药物在细胞毒杀实验(4天)。图20、oleEGFR油体包覆药物对血球血溶性实验-茄红素、姜黄素和喜树碱。图21、oleEGFR油体进行油体融血实验(血球)。图22、oleEGFR油体在血清随时间粒径变化测试。图23、oleEGFR油体在小鼠体内肿瘤注射后随不同时间IVSI观察测试。图24、oleEGFR油体在小鼠注射24小时后脏器随不同时间IVSI观察测试。图25、鼠取肿瘤组织冷冻切片的荧光显微镜观察。图26、小鼠肿瘤检测组织切片利用oleEGFR油体检测观察。图27、oleEGFR油体靶向型油体治疗的肿瘤负荷鼠_肿瘤变化(尺寸cm3)。图28、oleEGFR油体靶向型油体治疗的肿瘤负荷鼠_重量变化(重量千克)。图29、靶向型oleEGFR荧光油体在小鼠肺部体内靶向功能性的体内检测。图30、靶向型oleEGFR荧光油体在不同时间小鼠肺部体内靶向功能性的体内检测的发光信号值。图31、靶向型oleEGFR荧光油体在48小时后小鼠肺部器官靶向功能性的体内检测的发光信号值。
具体实施例方式除非文中另有说明，否则本说明书中(尤其是在权利要求书中)所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式。本发明提供靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其组成包含一 oleEGFR蛋白质，该蛋白质包含一油体膜蛋白及一 EGFR肽；一脂质，该脂质加入所述oleEGFR蛋白质后制成oleEGFR油体；以及一脂质可包覆药物，称为oleEGFR药物油体。本发明利用EGFR肽与油体膜蛋白(oleosin)结合分子生物技术之后进行简易的制备过程来提供一种人造油体的载体(下文简称为oleEGFR油体)。此人造油体可以包覆或镶嵌大量的已知荧光信号分子并且能作为生物体内移动的实时(real-time)信号放大器来追踪并确认病灶，或者，用于包覆药物，以作为药物递送体系，再者也能区分油溶性药物的功能。本发明利用基因重组技术将EGFR肽与油体膜蛋白插入宿主细胞，诱导出oleEGFR蛋白质，该油体钙蛋白可以选自以下群组的植物种子的油体蛋白芝麻、橄榄、大豆、花生、麻种子、油菜、葵花、芥花、红花中的一部分或其组合；宿主细胞可以为真核宿主细胞及原核宿主细胞，真核宿主细胞选自以下群组单细胞生物体如酵母细胞、源自高等生物体如植物，昆虫或哺乳动物的不死细胞或其组合，原核宿主细胞选自以下群组杆菌、球菌、螺旋菌、弧菌或其组合，最佳为大肠杆菌，大肠杆菌当宿主细胞可为E. coli. DH5 a、E. coli.BL21(DE3)、E. coli nissle ( A G2)或其组合。
该脂质可以选自以下群组甘油三酯、橄榄油、芝麻油、大豆油、花生油、矿物油、亚麻油、红花油、或其组合；其中，oleEGFR蛋白质与该脂质的重量/体积比值(微克/微升)为至少约1/25，且该calEGFR油体的平均粒径为纳米等级。通过上述组成，由于oleEGFR蛋白质中的EGFR肽可精准地识别癌细胞表面的受体，使之成为具有专一性的递送载体，以提供一主动靶向药物递送体系。植物油体是一种中性脂肪分子，主要有三个重要的成分，甘油三酯(TAG)、磷脂质(PL)及油体蛋白，并能够稳定油体结构。而油体蛋白主要有油体膜蛋白(oleosin)及微量的油体I丐蛋白(caleosin)与油体固醇蛋白(steroleosin),如图I所示。本发明是利用oleEGFR油体中的oleEGFR蛋白质，所包含的油体蛋白为植物种子油体蛋白，但不限于此，植物种子若有油体蛋白都能进行组合，例如芝麻、橄榄、大豆、花生、油菜、葵花、芥花、亚麻、红花(safflower)、及其它植物油体蛋白的组合。而本发明利用芝麻种子的油体蛋白构建oleEGFR蛋白质，而油体膜蛋白质氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。油体膜蛋白平均大小为50至200纳米。本发明作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，oleEGFR蛋白质可再包括脂质包覆药物，以分子生物学技术并组装成oleEGFR药物油体，该药物可以选自以下群组的药物茄红素、姜黄素、喜树碱、抗生素、葫芦素、温诺平(vinorelbine，商品名为Navelbin)、紫杉醇(Paclitaxel)、西药、中草药或其组合；或calEGFR蛋白质可再包括脂质包覆药物和脂质包覆已知荧光信号分子，以分子生物学技术组装成oleEGFR荧光药物油体，该药物可以选自以下群组的药物茄红素、姜黄素、喜树碱、抗生素、葫芦素、温诺平、紫杉醇、西药、中草药或其组合；以及，该已知荧光信号分子可以选自以下群组铯化镉量子点(quantum dot)、异硫氰酸突光素(FITC)、菌素黄(AlizarineYellow R, 5-[ (p-nitrophenyl) azo] salicylic acid sodium salt)、尼罗红(Nile Red,9-diethylamino-5H-benzo [ a ]phenoxazine-5-one)或其组合；或 calEGFR 药物蛋白质可再包括脂质包覆已知荧光信号分子，以分子生物学技术组装成oleEGFR荧光药物油体，该已知荧光信号分子可以选自以下群组铯化镉量子点、异硫氰酸荧光素(FITC)、茜素黄(Alizarine Yellow R)、尼罗红(Nile Red)或其组合；上述其一,如图2所示。
本发明oleEGFR油体的oleEGFR蛋白质，包含EGFR肽，使oleEGFR油体成为具有专一丨I"生的递送载体，又称祀向载体，而且oleEGFR油体也能包覆药物组成主动祀向药物递送体系(下文简称为oleEGFR药物油体)。而EGFR肽能精准地识别癌细胞表面的受体，由此可知，油体膜蛋白结合EGFR肽并且包覆药物的人造油体直接投递至癌变部位或作用于癌细胞，会大大的提升癌变部位或癌细胞区域的给药浓度，而不会影响到正常细胞。也可以刺激癌细胞对oleEGFR油体进行吞噬作用与融合作用，使抗癌药物快速进入癌细胞，能够达到治疗及避免产生药物的抗药性，如图2所示。在治肺腺癌时，可以用EGFR蛋白质受体的配体肽。而EGFR蛋白质受体是表皮细胞生长因子受体，存在于许多癌细胞表面，做为癌细胞表面的生物标记。前人研发出一种可专一性地和EGFR蛋白质受体键结的肽，称为EGFR肽。EGFR肽包含98个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，分子量约为7至15千道尔顿，比单克隆抗体的分子量(150千道尔顿)还小，由此可知，EGFR肽容易穿透细胞膜。本发明的oleEGFR油体可作为一种被动祀向药物递送体系(passive targeting drug delivery system),即，不具专一丨I"生的药物递送体系。其中，经由结合油体蛋白与上述细胞配体肽来提供一 oleEGFR蛋白质，并利用细胞配体肽可携带多种物质，而且可以直接穿过细胞膜而进入细胞，使oleEGFR油体不需经由受体而进入细胞，达成被动靶向给药。本发明的oleEGFR油体可以下述制备方式制备，但不以此为限利用基因重组技术在表达载体上结合油体蛋白的EGFR肽，再将oleEGFR油体送入宿主细胞内进行表达，并制备含有油体膜蛋白及EGFR肽的oleEGFR蛋白质。然后加入缓冲液混合该oleEGFR蛋白质与脂质，再利用超声处理器振荡混合物，就可以制造出人造oleEGFR油体，如图2所示。本发明oleEGFR油体所包含的脂质并无限制，举例说明，脂质可以利用甘油三酯、橄榄油、芝麻油、大豆油、花生油、矿物油、亚麻油、红花油、及其它植物种子脂质的组合；作用比较稳定的是甘油三酯、芝麻油或大豆油的组合，最佳为芝麻油的组合。本发明利用调整oleEGFR蛋白质与脂质的比例，并能制备出大小不同平均粒径的oleEGFR油体。oleEGFR油体的平均粒径与oleEGFR蛋白质与脂质的比例成反比，oleEGFR油体量固定，脂质成分愈少，oleEGFR油体的平均粒径愈小。于本发明oleEGFR油体中，oleEGFR蛋白质与脂质的重量/体积比值(微克/微升)通常为至少约1/25，较佳至少约1/1。本发明作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，oleEGFR蛋白质可再包括脂质包覆药物，以分子生物学技术组装成oleEGFR药物油体；*oleEGFR蛋白质可再包括脂质包覆的药物和脂质包覆已的已知荧光信号分子，以分子生物学技术组装成oleEGFR荧光药物油体；上述其一，如图2所示。本发明利用含有油体膜蛋白及EGFR肽的oleEGFR蛋白质。然后加入不同pH值缓冲液混合该oleEGFR蛋白质与脂质，再利用超声处理器振荡混合物，缓冲液的pH值会影响制造的oleEGFR油体的平均粒径与稳定性。经实验证明，缓冲液的pH值较佳在7. 5以上，更佳为约7. 5至约9. O。在本发明用较佳结果中，采用以下条件组合以制备oleEGFR油体(I)使用芝麻种子的油体膜蛋白及EGFR肽来构建oleEGFR蛋白质；(2)以橄榄油作为脂质；(3)采用oleEGFR蛋白质与脂质的重量/体积比值(微克/微升)为约20/1 ;及(4)缓冲液的pH值为约7. 5。本发明比先前技术更方便、稳定且调整oleEGFR油体的粒径大小，并可以提供适用于各种脂溶性药物和不同脂质的oleEGFR油体。本发明oleEGFR油体平均粒径非常稳定，大小可达数十纳米至次微米的尺寸，较易于为人体吸收。制备具注射剂型的oleEGFR油体时,并能控制其平均粒径为约20纳米至约300纳米的粒径。本发明是提供一种具优异递送特性，并且用于疾病的靶向治疗或检测的组合，本发明使用oleEGFR油体检测EGFR信号分子，结合不同药物及不同脂质的组合，而形成oleEGFR药物油体。本发明组合可以包含任何药物，并不限于抗癌药物，最佳是含有脂溶性药物。组合药物例如茄红素、姜黄素、喜树碱、抗生素、葫芦素、温诺平、紫杉醇、西药、中草药及其它不同药物的组合，也能加入复合式药物或其它药物的组合。本发明是利用茄红素、姜黄素及喜 树碱进行组装oleEGFR油体,如图2所示。本发明的组装oleEGFR油体也可结合任何已知的信号分子(下文简称为oleEGFR信号油体)，并能达成检测目的。信号分子可选自以下群组铯化镉量子点、异硫氰酸荧光素(FITC)、茜素黄(Alizarine Yellow R)、尼罗红(Nile Red)及其它已知能发出不同波长荧光信号的信号分子。例如铯化镉量子点在应用上，利用不同波长的光来激发不同尺寸的铯化镉量子点时，会散射出不同波长的荧光，所以可以利用特性铯化镉量子点来制备发射不同荧光颜色的oleEGFR油体。因此，组装人造油体也结合任何已知的信号分子，并能达到在活体内及活体外检测目的，在使本发明组合具有靶向检测的功能，以用于标定癌细胞或病灶的位置，如图2所示。本发明靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，油体膜蛋白可先接上一个切割单一序列的专一丨I"生接头(linker)再接上EGFR肽至宿主细胞,并且组装形成有专一丨I"生接头的oleEGFR蛋白，加入脂质并组装成有专一丨丨生接头的oleEGFR油体,经过离心有专一性接头的oleEGFR油体会悬浮在溶液表面，可以很轻易地回收，利用专一性蛋白酶水解切割使专一性接头断裂，使EGFR蛋白从油体膜蛋白分离，经离心并回收，得到EGFR蛋白(能识别EGFR表达的蛋白)，制备方式如图3所示。本发明靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，油体膜蛋白接上EGFR肽至宿主细胞，并且组装形成oleEGFR蛋白，加入包覆药物的脂质和包覆已知荧光信号分子的脂质，并组装成01 eEGFR检测和药物油体，将包覆有抗癌药物的o I eEGFR检测和药物油体直接投递至癌变部位或作用于癌细胞，可以利用不同激发波长检测oleEGFR检测和药物油体结合癌化部位，能清楚对癌化部位的识别，还能提高区域性的药物浓度，而不致影响正常细胞。此外，通过上述机制，亦可刺激癌细胞对oleEGFR药物油体的吞噬作用与融合作用，使抗癌药物进入癌细胞，以达到治疗及避免产生抗药性的目的。本发明靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，由不同的可以合成出药物的类似物的肽或是对病症有治疗效果的肽(上述肽称为药物肽)，经过基因工程，此合成蛋白为例如姜黄素、艾利诺得甘、茄红素、3胡萝卜素、脚黄素、虾红素、玉米黄质素、水蛭素、胰岛素、抑制病症的蛋白质、使病症细胞自我凋亡的肽或/和用分子生物学组成的抗病症药物肽、抗病症药的肽或其组合)并连接上油体蛋白再接上EGFR肽至宿主细胞并且组装形成类似oleEGFR药物蛋白，加入脂质并组装成自组装成类似oleEGFR药物油体。该油体能够专一性地识别癌化部位并能自行组装药物蛋白，可在活体内及活体外检测癌化部位，进行癌化部位抑制及药物治疗，制备过程如图4所示。本发明组装oleEGFR油体可以精准地标定癌细胞，能够实时性地用在活体内癌化部位的检测，也可以包覆药物组装成oleEGFR药物油体，并能准确地递送药物，以达到精准杀死癌细胞而减少正常细胞被杀死的副作用，因此本发明具有实时性地检测监控与治疗的功效。本发明组装oleEGFR药物油体及oleEGFR荧光药物油体的药物或药物肽不局限于上述药物，能具有抑制病症细胞、毒杀病症细胞、插入/改变/去除一个或多个基因使病症细胞基因突变而无法正常或快速分裂引发病症细胞 萎缩或自我凋亡、使病症细胞制成步骤中断而无法进行细胞周期的分裂、在病症细胞内产生抑制或破坏病症细胞生长条件的物质而无法进行细胞周期的分裂及使病症细胞无法感染正常细胞的物质都能与该油体进行组装或结合，具有专一性地识别癌化部位抑制及药物治疗的效果。本发明作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，oleEGFR蛋白质利用基因工程技术接上专一性接头，并组装成oleEGFR专一性接头油体，oleEGFR专一性接头油体能利用专一性蛋白酶水解切割，可纯化出纯度高的EGFR蛋白质的应用，该法简单又方便并不会影响蛋白的性质，如图3所示。本发明该油体膜蛋白为包含由SEQ ID NO :I所列的氨基酸序列及SEQ ID NO :3所列的DNA序列的油体膜蛋白；EGFR肽为包含由SEQ ID NO :2所列的氨基酸序列及SEQ IDNO 4所列的DNA序列的油体膜蛋白。而组装oleEGFR药物油体及oleEGFR荧光药物油体的药物或药物肽的药物，能具有抑制病症细胞、毒杀病症细胞、插入/改变/去除一个或多个基因使病症细胞基因突变而无法正常或快速分裂引发病症细胞萎缩或自我凋亡、使病症细胞制成步骤中断而无法进行细胞周期的分裂、在病症细胞内产生抑制或破坏病症细胞生长条件的物质而无法进行细胞周期的分裂及使病症细胞无法感染正常细胞的物质都能与该油体进行组装或结合，具有专一性地识别癌化部位抑制及药物治疗的效果。值得一提的是，本发明作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，作为宿主细胞的E. coli nissle ( A G2)为一种益生菌的大肠杆菌，并对糖尿病、胃部疾病、心脏病或其疾病有治疗效果。本发明使用oleEGFR油体，具有简易操作性及优异的载体特性，因此可以广泛应用在蛋白纯化、植物组培、中草药、西药、医学检验、生物医学材料、动物疫苗、生物科技等产业。以下列具体实验说明，进一步地叙述本发明。实施例I、制备oleEGFR油体按照图2所示的制备流程构建本发明的oleEGFR油体。〈步骤一、构建表达载体〉利用基因重组技术将以下基因构建于表达载体上油体膜蛋白(N端)-EGFR肽(C端)oleEGFR蛋白质的基因以一芝麻种子的油体膜蛋白基因(包含SEQ ID NO 3所示核苷酸序列)结合EGFR蛋白质的配体肽(即EGFR肽)的基因(包含SEQ ID NO :4所示核苷酸序列)。详细的操作步骤如下。首先，利用芝麻种子进行基因重组，纯化及提取，并得到油体钙蛋白肽)，以組装成PET-油体钙蛋白肽，纯化PET-油体膜蛋白肽，以作为模板DNA，再利用引物经由PCR来获得一油体膜蛋白基因片段。接着，以Nde I限制酶酶切该基因片段，并将其接至一 pET_29a(+)载体(购自Novagen公司)上，再将所制得的重组载体转化至E. coli.DH5a (购自财团法人食品工业发展研究所(FIRDI))宿主细胞中。于卡那霉素(购自Sigma公司)的LB(Luria-Bertani)固态培养基中，培养该宿主细胞，并进行筛选，以获得一包含pET-29a-油体膜蛋白基因的重组载体的转化株。再来，纯化pBlue-EGFR NS载体以当作模板DNA，再利用引物经由聚合酶链式反应(PCR)获得EGFR基因片段。接着，以EcoR V限制酶酶切EGFR基因，并将其连接至一pBluescript II (SK-)(购自Novagen公司)载体上，将制得的重组载体转化至E. coli.DH5 a宿主细胞中。于一含有青霉素及X-gal (购自Sigma公司)的LB固态培养基中培养该宿主细胞，并进行筛选，其中，挑选白色菌株以获得pBluescript II-EGFR重组载体的转化株。最后，以Nco I及HindIII限制酶酶切该重组载体上的EGFR基因片段，并将其接至一包含PJol-油体膜蛋白基因的重组载体上，即可制得一包含PJol-油体膜蛋白基因-EGFR的表达载体，称为口见1-016￡6 1 (简称016￡6 1 ，2011年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，CGMCC No. :4959,分类命名大肠埃希氏菌(Escherichia coli))。 完成构建上述表达载体后，分别将其转化至大肠杆菌宿主细胞(E. coliBL21(DE3)(购自Novagen公司)，与E.coli nissle (入G2))(购自财团法人食品工业发展研究所(FIRDI))内，并提取质粒以确认表达载体的核苷酸序列。上述实验方法可参见Sambrook et al. , The CondenSEQ Protocols FromMolecular Cloning A Laboratory Manual 2006,该文献全文并入本文以供参考。<步骤二、表达oleEGFR蛋白>以异丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG，0. 05毫摩尔浓度(购自USB公司))诱导步骤一中所制得的宿主细胞，使其大量表达oleEGFR蛋白，并收集菌液。以6，500转/分钟的转速离心菌液10分钟，再以约1/10倍菌液体积的TE缓冲液(TE (Tris-EDTA) buffer (购自Sigma公司))悬浮经离心沉淀的宿主细胞，接着，将其加入至十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品缓冲液(SDS-PAGE 4X sample buffer(购自Sigma公司))中并混合均匀，最后95°C加热约10分钟后，进行蛋白质电泳分析。结果如图5所示。<步骤三、添加脂质及信号分子>将步骤二中所制得的oleEGFR蛋白质(50毫克)加入至一试管中，并添加50毫克甘油三酯、150微克的磷脂质及2. 5微克荧光染剂(茜素黄，(购自怀德生物科技公司)或是尼罗红(购自Sigma公司))，利用超声样品处理器(型号=Sonics VCX130)以数分钟的间隔振荡五次(条件为10秒，20amplitude,0. 5pulser),以进行油体重组并组装出oleEGFR荧光油体，使该油体通过0. 22毫米的滤膜，利用荧光显微镜(型号=Nikon 104)观察制备结果，结果如图6所不。可利用一般生化检验分析方法测定oleEGFR油体中的三种基本成分。于此，经由检测酯键及计算而获得甘油三酯含量；使用BioRad公司的检测试剂(BCA protein assay)计算获得蛋白质含量。实施例2、oleEGFR油体的原子力显微镜测试将云母片(购自佑鸿企业股份有限公司)用水清洗三次，每次三分钟，再用0. 02M的MgCl泡制2-3分钟，并用清水清洗一次。将步骤二中所制得的oleEGFR蛋白质(50毫克)加入至一试管中，并添加50毫克甘油三酯、150微克的磷脂质并组装成oleEGFR油体，使该油体通过0. 22毫米的滤膜，再将过滤后的油体加入至云母片上静置2小时，使靶向型人造油体吸附在云母片上，之后用双蒸水清洗两次，放置于37°C烘箱中干燥，最后用原子力显微镜(Atomic Force Microscope, AFM)(型号NS4/D3100CL/MultiMode)观察油体型态和大小,结果如图7所示。实施例3、脂质与oleEGFR蛋白质的比例的影响在100微克oleEGFR\蛋白质(pjo I-oleEGFR)中添加950微升的磷酸钠缓冲液(0. 01摩尔浓度，pH 7. 5)(购自Sigma公司)及50微升的橄榄油(购自Sigma公司)，得到含有oleEGFR蛋白质/脂质(橄榄油)的重量/体积比值(微克/微升)为2/1的混合物。然后，超声振荡混合物(混合物置于冰上，功率15%，时间20秒，run :0. 5秒，rest 0. 5秒，振荡三次)，得到所要的oleEGFR油体。重复前述操作，但分别使用400、200、100及100微克oleEGFR蛋白质，且对应使用20、20、100及500微升橄 榄油，以得到oleEGFR蛋白质/脂质(橄榄油)的重量/体积比值(微克/微升)分别为20/1、10/1、1/1、及1/5的oleEGFR 油体。利用Nikon 104型光学显微镜观察不同条件oleEGFR油体的形态(如图8所示)及浊度(如图9所示，计算方法如以下实施例6所述)，并使用粒径分析仪(BeckmanCoulter,N4Plus)分析oleEGFR油体的粒径。其中，将离子强度固定为0. 1，并于25°C下以粒径分析仪的动态光散射(dynamic light scanning, DLS) (Il激光束633纳米；散射角90° ;分析方法Contin)分析粒径大小及粒径分布,结果如表I所示。表I、oleEGFR油体在不同条件粒径测试。
(a)(b)(e)
油/蛋白比平均粒径PH平均粒径油平均粒径
(w/w) (Btm)(am)(nm)
^73O7411nm73d5
2:1 31.27.0501.9大豆油438.7
1:1 417.47.5403.8花生油567.1
1:5 311.88.0269.7橄榄油428.8
1:10_1918_9.0228.7_芝麻油_211.4实施例4、pH值的影响将oleEGFR蛋白质(100微克oleEGFR)加入至950微升的不同pH值(pH 6. 5,pH7.0,pH 7. 5、pH 8.0、或pH 9.0)的磷酸钠缓冲液(0.01摩尔浓度)中，再添加50微升的橄榄油，超声振荡混合物(混合物置于冰上，功率15%，时间20秒，run :0. 5秒，rest :0. 5秒，振荡三次)，以制备oleEGFR油体。利用Nikon 104型光学显微镜观察oleEGFR油体的形态(如图8所示)及浊度(如图9所示)；以粒径分析仪分析oleEGFR油体的粒径(如表I所示)。实施例5、脂质种类的影响将oleEGFR蛋白质(100微克pjol-oleEGFR)加入至950微升的磷酸钠缓冲液(0. 01摩尔浓度，pH 7. 5)中，再添加50微升的不同脂质(芝麻油(购自Sigma公司)、橄榄油、大豆油(购自Sigma公司)、花生油(购自Sigma公司)、或矿物油(购自Sigma公司))，超声振荡混合物(混合物置于冰上，功率15%，时间20秒，run :0. 5秒，rest :0. 5秒，振荡三次)，以制备oleEGFR油体。利用Nikon 104型光学显微镜观察oleEGFR油体的形态(如图8所示)及池度(如图9所示)；以粒径分析仪(型号Zetasizer Nano,Malvern#ZS90)分析oleEGFR油体的粒径(如表I所示)。图8及表I所示，所制得oleEGFR油体的平均粒径介于10至2，000纳米之间，且随着脂质与oleEGFR蛋白质的比例降低而变小。因此，可调整脂质与oleEGFR蛋白质的比例以制备出不同平均粒径的oleEGFR油体。此外，oleEGFR油体的平均粒径于碱性环境下相对较小。实施例6、测定oleEGFR油体的稳定度以下列三种方式测定oleEGFR油体的稳定度 A、观察负电斥力可通过观察oleEGFR油体表面的负电斥力或蛋白质覆盖的立体屏障效应而测得其稳定度，其中，可通过降低溶液的PH值来观察负电斥力逐渐消失所导致的油体聚集。因此，将oleEGFR油体放置于不同pH值的磷酸缓冲液中，并于室温下静置12小时，再以光学显微镜观察其变化。由图8可看出，于pH 7. 5下放置12小时后，皆仍保持完整性。B、测量浊度如果oleEGFR油体是完整的，则表面为亲水性，而且能有效地与水互溶而呈悬浮状态。若oleEGFR油体是不完整的，则其表面上的蛋白质会因无法正确折叠导致oleEGFR油体间彼此聚合，使oleEGFR油体浮在溶液表面。因此，可以由测定溶液底层的浊度可间接地了解oleEGFR油体的完整性。因此，首先将I毫升的oleEGFR油体置于一次性测量管内，并将管口密封且避免震动，静置于室温下140分钟后，以吸收波长600纳米测量浊度。相对浊度表示为T/T0 = IOA/1OAO = 10A/102. 0，其中AO为2. O。由图9可看出，经140分钟后，oleEGFR油体仍然保持完整性，这说明oleEGFR油体具有极佳的稳定性。C、测量zeta电位将oleEGFR油体分散于不同环境(不同脂质与oleEGFR蛋白质的重量/体积比例、pH值、或脂质种类)之下，并利用表面电位分析仪(Zetasizer Nano,Malvern #ZS90)测量人造oleEGFR油体的表面zeta电位的变化，测量结果如表2所示，oleEGFR油体的稳定度随着脂质与oleEGFR蛋白质的比例降低而提升，且于碱性环境下相对较为稳定。表2、oleEGFR油体在不同条件表面电位分析仪测试。_^
油/蛋白比zeta电位pHzeta电位油zeta电位
(w/w)(mV)(mV)(mV)
IoTl63矿物油
2:1-47.57.0-48.3大豆油-43.1
1:1-44.17.5-443花生油-46.9
1:5-41.98,0-42.2橄榄油-42.4
1:10_-405_9.0-40.3芝麻油-40.5
实施例7、oleEGFR油体的靶向功能性体外测试-固定肿瘤细胞测试将5X IO4个细胞NCI-H520(人肺鳞癌细胞)、A431 (皮肤腺癌细胞)和A549 (肺腺癌细胞)种入至一 24孔培养盘中，并置于37°C的细胞培养箱(含有5体积％二氧化碳)中培养24小时。隔日，再以pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS buffer)(购自Sigma公司)清洗数次，以2.5重量/体积％甲醛(购自Sigma公司)于室温下固定20分钟，再以pH 7.4的磷酸盐缓冲液清洗。将包覆茜素黄oleEGFR油体(包含2. 5微克pJol-oleEGFR/每毫升磷酸盐缓冲液)加入至经固定的细胞，于PH 7.4的磷酸盐缓冲液中，在25°C下反应I小时后，以pH 7.4的磷酸盐缓冲液(包含l/1000Tween-20(购自USB公司))清洗三次，再以pH 7. 4的磷酸盐缓冲液清洗三次。之后，添加封闭溶液(3%重量/体积的胎牛血清白蛋白(BSA)(购自Sigma公司)溶于磷酸盐缓冲液中)，并于室温下反应I小时，将抗-EGFR一级抗体(9G6, Santa Cruz Biotechnology 公司，Santa Cruz,加州，美国)以 I : 500 的比例稀释后，再于室温下反应至少I小时。再以磷酸盐缓冲液清洗三次后，再利用Ab30(以I : 500 的比例稀释，Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司，West Grove,宾夕法尼亚州，美国)进行反应I小时，再次以磷酸盐缓冲液清洗。细胞核染色则使用15，000倍的DAPI (diamidino-2-phenylindole)进行染色并清洗三次,染色完成后封片，并利用突光显微镜(型号01ympus, 1X71)进行观察。实验结果如图10所示，oleEGFR油体可以专一性地标定用甲醛固定而且经过量表达的EGFR受体的A431、A549及NCI-H520细胞。实施例8、oleEGFR油体的靶向功能性体外测试-肿瘤活细胞测试将5X104个细胞NCI-H520(人肺鳞癌细胞)、A431(皮肤腺癌细胞)和A549(肺腺癌细胞)种入至一 24孔培养盘中，并置于37°C的细胞培养箱(含有5体积％二氧化碳)中培养24小时。隔日，以DMEM/F12培养液(GIBC0 Invitrogen Corporation,纽约，美国)清洗后，将包覆茜素黄oleEGFR油体(包含2. 5微克pJol-oleEGFR/每毫升磷酸盐缓冲液)加入至经固定的细胞，并于DMEM/F12培养液中，于37°C的培养箱(含有5体积％二氧化碳)中进行反应2小时，再以pH 7. 4磷酸盐缓冲液清洗三次。然后，以2.5重量/体积％甲醛于室温下固定细胞30分钟后，以pH 7. 4磷酸盐缓冲液清洗，再添加封闭溶液(3%重量/体积胎牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液中)，并于室温下反应I小时。将抗-EGFR —级抗体(9G6, Santa Cruz Biotechnology 公司,Santa Cruz,加州,美国)以 I : 500 的比例稀释后，于室温下反应至少I小时。然后，以磷酸盐缓冲液清洗三次后，以Ab30(以I : 500的比例稀释，Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司，West Grove,宾夕法尼亚州，美国)反应I小时，用磷酸盐缓冲液清洗三次。最后细胞核染色则是使用15，000倍DAPI进行染色并清洗三次，完成染色后予以封片，并利用荧光显微镜(Olympus，1X71)进行观察。实验结果如图11所示，oleEGFR油体可以专一性地标定用甲醛固定而且经过量表达的EGFR受体的 A431、A549 及 NCI-H520 细胞。实施例9、oleEGFR油体与肿瘤细胞的最适作用浓度将5X104个细胞NCI-H520(人肺鳞癌细胞)、A431(皮肤腺癌细胞)和A549(肺腺癌细胞)种入至一 24孔培养盘中，并置于37°C的细胞培养箱(含有5体积％二氧化碳)中培养24小时。隔日，以DMEM/F12培养液(GIBCO Invitrogen Corporation,纽约，美国)清洗后，利用包覆不同浓度茜素黄oleEGFR油体与细胞的感染剂量值(MOI值，multiplicityof infection) (MOI 100、MOI 200、MOI 400)，来测定两者间的最适作用浓度。因此，使用的细胞株为过量表达EGFR受体的皮肤腺癌细胞株A431、无过量表达EGFR受体的人肺鳞癌细胞株NCI-H520、及过量表达EGFR受体的肺腺癌细胞株A549，加入至经固定的细胞，并于DMEM/F12培养液中，于37°C的培养箱(含有5体积％二氧化碳)中进行反应2小时，再以PH 7. 4磷酸盐缓冲液清洗三次。然后，以2.5重量/体积％甲醛于室温下固定细胞30分钟后，以pH 7.4磷酸盐缓冲液清洗，以下荧光显微镜观察和流式细胞仪测试的实验步骤均不 同，分别说明。荧光显微镜观察作用oleEGFR油体的细胞株，再添加封闭溶液(3%重量/体积胎牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液中)，并于室温下反应I小时。将抗-EGFR —级抗体(9G6, Santa Cruz Biotechnology 公司,Santa Cruz,加州，美国)以 I : 500 的比例稀释后，于室温下反应至少I小时。然后，以磷酸盐缓冲液清洗三次后，以Ab30(以I : 500的比例稀释，Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司，West Grove,宾夕法尼亚州，美国)反应I小时，用磷酸盐缓冲液清洗三次。最后细胞核染色则使用15，000倍DAPI进行染色并清洗三次，完成染色后予以封片，并利用荧光显微镜(型号01ympus，1X71)进行观察。流式细胞仪测试作用oleEGFR油体的细胞株，再添加pH 7. 4磷酸盐缓冲液并利用流式细胞仪(BD FACSCanto (Argon-Ion Laser 488nm, He-Ne Laser 633nm))测试。其中，MOI值定义为oleEGFR油体数目与细胞数目的比值，且其可依下式转换为浓度单位MOI 100 = I. 25 XKT2 微克 / 毫升MOI 200 = 2. 5 X 1(T2 微克 / 毫升MOI 400 = 5 X 1(T2 微克 / 毫升实验结果如图12所示，在荧光显微镜下观察，发现包含EGFR肽的oleEGFR油体对过量表达EGFR受体的细胞株具有专一性的识别能力，而且oleEGFR油体进入细胞的数目随着MOI值增加而有提升的趋势，而到MOI值为200时则呈现饱和情形。利用荧光显微镜观察oleEGFR油体是否进入细胞及MOI值的影响。结果显示，oleEGFR油体确实已进入细胞内，且其进入细胞的数量同样随着MOI值的提升而增加。流式细胞仪测试结果，如图14所示(其中，细胞与oleEGFR油体的结合百分率定义为经结合oleEGFR油体的细胞数目/10，000个细胞X 100)，上述实验结果，荧光显微镜观察与流式细胞仪的分析一致。实施例10、oleEGFR油体与肿瘤细胞的最适作用时间以与实施例9相同的方法来观察oleEGFR油体与肿瘤细胞的最适作用时间，其中MOI值固定为200，使用的细胞株为经过量表达EGFR受体的A549细胞、A431细胞，以及未经过量表达EGFR的NCI-H520细胞，并于不同时间点(O、15、30、60、120和240分钟)进行作用。结果如图13所示，在荧光显微镜下均发现包含EGFR肽的oleEGFR油体对过量表达EGFR受体的细胞株具有专一性的识别能力，且oleEGFR油体进入细胞的数目随著作用时间增加而有提升的趋势，而到作用时间为2小时时则呈现饱和情形。利用荧光显微镜观察oleEGFR油体是否进入细胞及作用时间的影响。结果显示，oleEGFR油体进入细胞的数量随作用时间的增加而提升，且于2小时呈现饱和的情形。流式细胞仪测试结果，如图15所示(其中，细胞与oleEGFR油体的结合百分率定义为经结合oleEGFR油体的细胞数目/10，000个细胞X 100)，上述实验结果，荧光显微镜观察与流式细胞仪的分析一致。实施例11、oleEGFR油体侵入肿瘤细胞以与实施例8相同的方法来观察oleEGFR油体侵入肿瘤细胞，其中MOI值固定为200，时间固定为2小时，使用的细胞株为经过量表达EGFR受体的SK0V3细胞进行作用。结果如图16所示，利用共轭荧光显微镜(型号Leica TCS SP2)取X、Y与Z轴，均发现包含 EGFR肽的oleEGFR油体具专一性的识别能力而且能侵入细胞里面。实施例12、oleEGFR药物油体的组成、大小及zeta电位将步骤二中所制得的oleEGFR蛋白质(50毫克)加入至一试管中，再添加50微升包覆不同药物的脂质，再利用超声样品处理器(型号=Sonics VCX130)以数分钟的间隔振荡五次(条件为10秒，20amplitude,0. 5pulser),以进行油体重组。组装出oleEGFR药物油体。利用粒径分析仪分析oleEGFR药物油体的粒径，如表3所示。将oleEGFR药物油体利用表面电位分析仪(Zetasizer Nano)(型号Malvern #ZS90)测量人造oleEGFR药物油体的表面zeta电位的变化，测量结果如表3所示，oleEGFR药物油体的稳定度，如图17所
/Jn o如果oleEGFR药物油体是完整的，则表面为亲水性，而且能有效地与水互溶而呈悬浮状态。若oleEGFR药物油体是不完整的，则其表面上的蛋白质会因无法正确折叠导致oleEGFR药物油体间彼此聚合，使oleEGFR药物油体浮在溶液表面。因此，可以由测定溶液底层的浊度可间接地了解oleEGFR药物油体的完整性。因此，首先将I毫升的oleEGFR油体置于一次性测量管内，并将管口密封且避免震动，静置于室温下140分钟后，以吸收波长600纳米测量浊度。相对浊度表示为T/T0 = IOA/1OAO = 10A/102. 0，其中AO为2. O。由图17可看出，经24小时后，oleEGFR油体仍然保持完整性，这说明oleEGFR油体具有极佳的稳定性。表3、oleEGFR油体包覆药物尺寸和表面电位分析仪测试_茄红素、姜黄素和喜树碱。
权利要求
1.一种作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其组成包括 oleEGFR蛋白质，其是利用基因重组技术将EGFR肽与油体膜蛋白插入宿主细胞所诱导出，该油体膜蛋白可以选自以下群组的植物的种子油体蛋白芝麻、橄榄、大豆、花生、麻种子、油菜、葵花、芥花、红花的一部分或其组合，所述宿主细胞可以为真核宿主细胞及原核宿主细胞，真核宿主细胞选自以下群组单细胞生物体如酵母细胞、源自高等生物体如植物，昆虫或哺乳动物的活细胞或其组合,原核宿主细胞选自以下群组杆菌、球菌、螺旋菌、弧菌或其组合，最佳为大肠杆菌，大肠杆菌当宿主细胞可为E. coli. DH5 a、E. coli. BL21 (DE3)、E. coli nissle ( A G2)或其组合； 脂质，其加入所述oleEGFR蛋白质后制成oleEGFR油体；该脂质可以选自以下群组甘油三酯、橄榄油、芝麻油、大豆油、花生油、矿物油、亚麻油、红花油、或其组合；其中，oleEGFR蛋白质与该脂质的重量/体积比值(微克/微升)为至少约1/25，且该oleEGFR油体的平均粒径为纳米等级； 通过上述组成，成为具有专一性的递送载体，以提供一主动靶向药物递送体系，由于oleEGFR蛋白质中的EGFR肽可精准地识别癌细胞表面的受体。
2.如权利要求I所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，可进一步包括脂质包覆已知荧光信号分子，以分子生物学技术组装成oleEGFR荧光油体，该已知荧光信号分子可以选自以下群组铯化镉量子点、异硫氰酸荧光素、茜素黄、尼罗红或其组合； 通过上述组成，成为具有专一性的递送载体，以提供一主动靶向药物递送体系，由于01 eEGFR蛋白质中的EGFR肽可精准地识别癌细胞表面的受体，因此透过o I eEGFR检测油体，将包覆有已知荧光信号分子的oleEGFR检测油体直接投递至癌变部位或作用于癌细胞，并能专一性地检测及识别病变部位，而不致影响正常细胞；此外，亦可刺激癌细胞对oleEGFR荧光油体的吞噬作用与融合作用，使荧光分子进入癌细胞，以达到靶向专一性地检测癌细胞的目的。
3.如权利要求I所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，oleEGFR蛋白质可进一步包括脂质包覆药物，以分子生物学技术组装成oleEGFR药物油体，该药物可以选自以下群组的药物茄红素、姜黄素、喜树碱、抗生素、葫芦素、温诺平、紫杉醇、西药、中草药或其组合； 通过上述组成，成为具有专一性的递送载体，以提供一主动靶向药物递送体系，由于01 eEGFR蛋白质中的EGFR肽可精准地识别癌细胞表面的受体，因此透过o I eEGFR药物油体，将包覆有抗病症药物的oleEGFR药物油体直接投递至癌变部位或作用于癌细胞，提高区域性的药物浓度，而不致影响正常细胞；此外，亦可刺激病症细胞对oleEGFR药物油体的吞噬作用与融合作用，使抗癌药物进入癌细胞，以达到检测治疗及避免产生抗药性的目的。
4.如权利要求I所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，oleEGFR蛋白质可进一步包括脂质包覆药物和脂质包覆的已知荧光信号分子，以分子生物学技术组装成oleEGFR荧光药物油体，该药物可以选自以下群组的药物茄红素、姜黄素、喜树碱、抗生素、葫芦素、温诺平、紫杉醇、西药、中草药或其组合；以及，该已知荧光信号分子可以选自以下群组铯化镉量子点、异硫氰酸荧光素、茜素黄、尼罗红或其组合； 通过上述组成，成为具有专一性的递送载体，以提供一主动靶向药物递送体系，由于oleEGFR蛋白质中的EGFR肽可精准地识别癌细胞表面的受体，因此透过oleEGFR荧光药物油体，将包覆有抗病症药物的oleEGFR荧光药物油体直接投递至癌变部位或作用于癌细胞，提高区域性的药物浓度，而不致影响正常细胞；此外，亦可刺激病症细胞对01 eEGFR荧光药物油体的吞噬作用与融合作用，使抗癌药物进入癌细胞，以达到检测治疗及避免产生抗药性的目的。
5.如权利要求I所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，oleEGFR蛋白质利用基因工程技术接上药物肽，并组装成oleEGFR药物蛋白质，以分子生物学技术组装成oleEGFR药物油体，该药物肽并无任何限制可以选自以下群组姜黄素、艾利诺得甘、茄红素、3胡萝卜素、脚黄素、虾红素、玉米黄质素、水蛭素、胰岛素、抑制病症的蛋白质、使病症细胞自我凋亡的肽或/和用分子生物学组成的抗病症药物肽、抗病症药的肽或其组合； 通过上述组成，成为具有专一性的递送载体，以提供一主动靶向药物递送体系，由于01 eEGFR蛋白质中的EGFR肽可精准地识别癌细胞表面的受体，因此透过o I eEGFR药物油体，将包覆有抗病症药物的oleEGFR药物油体直接投递至癌变部位或作用于癌细胞，提高区域 性的药物浓度，而不致影响正常细胞；此外，亦可刺激病症细胞对oleEGFR药物油体的吞噬作用与融合作用，使抗癌药物进入癌细胞，以达到检测治疗及避免产生抗药性的目的。
6.如权利要求5所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，oleEGFR药物蛋白质可进一步包括脂质包覆已知荧光信号分子，以分子生物学技术组装成oleEGFR荧光药物油体，该已知荧光信号分子可以选自以下群组铯化镉量子点、异硫氰酸荧光素、茜素黄、尼罗红或其组合； 通过上述组成，成为具有专一性的递送载体，以提供一主动靶向药物递送体系，由于01eEGFR蛋白质中的EGFR肽可精准地识别癌细胞表面的受体，因此透过o I eEGFR荧光药物油体，将包覆有抗病症药物的oleEGFR荧光药物油体直接投递至癌变部位或作用于癌细胞，提高区域性的药物浓度，而不致影响正常细胞；此外，亦可刺激病症细胞对01 eEGFR荧光药物油体的吞噬作用与融合作用，使抗癌药物进入癌细胞，以达到检测治疗及避免产生抗药性的目的。
7.如权利要求I所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，oleEGFR蛋白质利用基因工程技术接上专一性接头，并组装成oleEGFR专一性接头油体，oleEGFR专一性接头油体能利用专一性蛋白酶水解切割，可纯化出纯度高的EGFR蛋白质的应用，该法是简单又方便并不会影响蛋白的性质。
8.如权利要求1、2、3、4、5、6及7所述的作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其中，该油体膜蛋白为包含由SEQ ID NO: I所列的氨基酸序列及SEQ ID NO :3所列的DNA序列的油体膜蛋白；EGFR肽为包含由SEQ ID NO :2所列的氨基酸序列及SEQ IDNO 4所列的DNA序列的油体膜蛋白，而组装oleEGFR药物油体及oleEGFR荧光药物油体的药物或药物肽的药物，能具有抑制病症细胞、毒杀病症细胞、插入/改变/去除一个或多个基因使病症细胞基因突变而无法正常或快速分裂引发病症细胞萎缩或自我凋亡、使病症细胞制成步骤中断而无法进行细胞周期的分裂、在病症细胞内产生抑制或破坏病症细胞生长条件的物质而无法进行细胞周期的分裂及使病症细胞无法感染正常细胞的物质都能与该油体进行组装或结合，具有专一性地识别癌化部位抑制及药物治疗的效果。
全文摘要
本发明公开了一种靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体，其组成包含一oleEGFR蛋白质，该oleEGFR蛋白质包含一油体膜蛋白及一EGFR肽；一脂质、一脂质包覆脂溶性药物及一脂质包覆已知荧光分子，并制成oleEGFR油体、oleEGFR药物油体及oleEGFR荧光油体，以提供一主动靶向药物递送体系及检测系统。
文档编号A61K47/42GK102743326SQ20111032710
公开日2012年10月24日 申请日期2011年10月25日 优先权日2010年12月21日
发明者朱宝美, 陈顺基 申请人:陈致融