专利名称：超氧化物歧化酶活动的测定方法
技术领域：
本发明涉及一自由基医学与生物学领域中超氧化物歧化酶活力的测定方法。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase.简称SOD)是机体清除超氧阴离子自由基的一种重要的酶，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。此酶能清除超氧阴离子自由基(O2)，保护细胞免受损伤。因而SOD活力的高低与衰老、肿瘤、炎症、自身免疫病、血液、心血管病、肾脏病等有密切的联系，对疾病的病因学探讨、诊断、治疗和观察等有重要意义。
目前，国内外测试SOD活力的方法很多，如电子顺磁波谱法与核磁共振法，由于所需仪器设备昂贵，操作复杂，一般实验室及医院很难应用，国内一般采用化学比色法，但受外界因素影响大，实验效果不稳定;YOSHIHIKO OYANAGVL的“Reevaluarion of Assay Methods and Establishment of Kit for Superoxide Dismutase Activity”一文，刊登于ANALYTICALBIOCHEMISTRY142，290-296(1984)，介绍了一种测定SOD活力的亚硝酸盐法。该方法利用黄嘌呤(XO)加黄嘌呤氧化酶(XOD)反应系统产生超氧阴离子自由基O2，在此体系中加电子受体羟胺，则O2氧化羟胺形成亚硝酸盐，再添加显色剂(对氨基苯磺酸+N-甲荼基二胺基乙烯)，则测试液呈紫红色。上述反应是在KH2PO4与Na2B4O7缓冲液体系中进行。上述方法存在的问题是1、磷酸缓液中加10-4M/L的EDTA，浓度太高，会影响铜锌-SOD活力，使测试结果不准确;2、底物黄嘌呤XO及羟胺是溶于PH8.2的KH2PO4及Na2B4O7中，①实际上XO只能溶解一部分，有一部分沉淀下来，使结果很不准确;②而且羟胺在这缓冲体系中极易氧化，使试剂的保存期缩短;③由于羟胺的自动氧化，使得试剂在不加黄嘌呤氧化酶的情况下，反应体系中会产生亚硝酸盐，即对照管与空白对照管呈色接近则此法测定价值不大;3、该方法采用的显色剂为300μg/ml对氨基苯磺酸与5μg/mlN-甲荼基二胺基乙烯及16.7%的冰醋酸混合而成，此混合显色剂显色极浅，对照管吸光度在0.080-0.090之间，一般仪器很难鉴别。
本发明的目的在于提供一种超氧化物歧化酶活力的测定方法，以提高测定的准确性，且使测试方法简便、快速、经济。
本发明的目的是这样实现的本发明的超氧化物歧化酶活力测定方法属亚硝酸盐形成法，它利用黄嘌呤(XO)加黄嘌呤氧化酶(XOD)反应体系产生超氧阴离子自由基O2，XOD氧化羟胺形成亚硝酸盐，再添加显色剂(对氨基苯磺酸加N-甲荼基二胺基乙烯)，使测试液呈紫红色，测试过程在磷酸缓冲液体系中进行，其特征在于，测定时选用PH值为8.0的磷酸缓冲液，其中EDTA浓度为2×10-5mol/L;XO溶解于碱性溶液中，充分溶解;羟胺溶解于弱酸中;采用1.65mg/ml对氨基苯磺酸及0.75mg/mlN-甲荼基二氨基乙烯和20%冰醋酸混合液作显色剂。
本发明的原理1、黄嘌呤XO可溶于碱性溶液中，溶解充分;即反应物溶液均匀，则测试结果满意;2、羟胺溶于弱酸中，使测试液稳定，保存时间长;3、磷酸缓冲液中加2×10-5mol/l的EDTA浓度适中即可络合金属离子同时又不影响SOD活力;使测定结果准确稳定;4、本发明所采用的显色剂配比可使显色稳定，过高或过低会造成吸光度过高或过低。
本发明与现有技术相比，其显著优点是1、测试液吸光度大大提高，可达0.45，一般721或722分光光度计可进行测试;2、测试结果准确、稳定，变异系数CV可达1.7%，回收率χ±SD可达103%±2.63%(n＝5);3、测试灵敏度高，ID50可达0.05μg/ml;4、测试速度快，每小时可测100例样本。本发明可广泛适用于实验室及临床检验。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
本发明的SOD测定采用XO+XOD反应体系产生O2再加羟胺及显色剂的原理，测定在对照管及测定管两支试管中进行，测定管中加入被测样本，对照管中不加样本，并按照下述步骤及条件配制试剂，取少量分别加入试管中1、Na2HPO320.5克+NaH2PO3752mg+EDTA38.7mg溶于37℃，1000ml水中;
2、70mg羟胺加到100ml的0.03N/L HCl溶液中;
3、98mgXO加到0.1N/L的Na2HPO4溶液中;
4、5单位的XOD溶于182ml的磷酸缓冲液中;
5、显色剂的配制;
①0.66克对氨基苯磺酸溶于50℃，150ml的水中;
②0.3克N-甲荼基二胺基乙烯溶于50℃，150ml的水中;
③冰醋酸100ml;
将① ② ③三种试液在测试前按3∶3∶2比例混合，每支试管取2ml显色。
权利要求
1.一种超氧化物歧化酶活力测定方法，属于亚硝酸盐形成法，它利用黄嘌呤(XO)加黄嘌呤氧化酶(XOD)反应体系产生超氧阴离子自由基O2，黄嘌呤氧化酶氧化羟胺形成亚硝酸盐，再添加显色剂(对氧基苯磺酸加N-甲萘基二胺基乙烯)使测试液呈紫红色，测试过程在磷酸缓冲液体系中进行，其特征在于1.1磷酸缓冲液PH值为8.0，其中EDTA浓度为2×10-5ml/l；1.2XO溶于碱性溶液中，充分溶解；1.3羟胺溶于弱酸中；1.4采用1.65mg/ml对氨基苯磺酸及0.75mg/mlN-甲萘基二氨基乙烯和20%冰醋酸混合液作显色剂。
2.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶活力测定方法，其特征在于XO溶解于0.1N/L Na2HPO4中。
3.根据权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶活力测定方法，其特征在于羟胺溶解于0.03N/L HCl溶液中。
全文摘要
本发明公开了一种测定超氧化物歧化酶活力的方法，该方法属亚硝酸盐形成法，利用XO加XOD反应系统产生超氧阴离子自由基O
文档编号C12Q1/26GK1082612SQ9210763
公开日1994年2月23日 申请日期1992年7月9日 优先权日1992年7月9日
发明者季岳军 申请人:季岳军, 岳成斌