的多核苷酸的例子可以包括编码如上文描述的使目的蛋白的纯化变得容易的肽 组分的多核苷酸、编码如上文描述的增强目的蛋白的溶解度的肽组分的多核苷酸、编码起 蛋白伴侣作用的肽组分的多核苷酸、和编码作为具有另一种功能的蛋白质或蛋白质域的肽 组分或连接它们的接头的多核苷酸。包含编码另一种肽组分的多核苷酸的各种表达载体是 可用的。因此，可以利用此类表达载体来生成本发明的表达载体。例如，可以利用包括编 码使目的蛋白的纯化变得容易的肽组分的多核苷酸的表达载体（例如pET-15b、pET-51b、 pET-41a、pMAL-p5G)、包含编码增强目的蛋白的溶解度的肽组分的多核苷酸的表达载体 (例如pET-50b)、包含编码起蛋白伴侣作用的肽组分的多核苷酸的表达载体（pCold TF)、 和包含编码作为具有另一种功能的蛋白质或蛋白质域的肽组分或连接它们的接头的多核 苷酸的表达载体。为了能够在蛋白质表达后从对其添加的另一种肽组分切割出本发明的经 修饰的酶，本发明的表达载体可以包含编码在编码本发明的经修饰的酶的多核苷酸和编码 另一种肽组分的多核苷酸之间的蛋白酶切割位点的区域。
[0150] 可以使用多种原核细胞和多个真核细胞作为宿主来表达本发明的经修饰的酶， 所述原核细胞包括来自属于埃希氏菌属（Escherichia)(例如大肠杆菌（Escherichia coli))、棒杆菌属（Corynebacterium)(例如谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum))和芽孢杆菌属（Bacillus)(例如枯草芽孢杆菌）的细菌的细胞，所述真核细 胞包括来自属于酵母属（Saccharomyces)(例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))、 毕赤酵母（Pichia)(例如树干毕赤酵母（Pichia stipitis))和曲霉属（Aspergillus)(例 如米曲霉（Aspergillus oryzae))的真菌的细胞。可以使用已经缺失了某种基因的菌株作 为宿主。转化体的例子可以包括载体保留于其胞质内的转化体和目的基因整合入其基因组 中的转化体。
[0151] 可以使用给定的培养容器（例如试管、烧瓶、发酵缸（jar fermenter))在具有随 后描述的组成的培养基中培养本发明的转化体。可以适当确定培养条件。具体地，培养温 度可以是10至37°C，pH值可以是6. 5至7. 5,并且培养期可以是1至100小时。也可以在 管理溶解氧浓度的情况中实施培养。在此情况中，可以使用溶解氧浓度（D0值）作为控制 的指标。可以控制通风/搅拌条件，从而在空气中的氧气浓度是21 %时相对溶解氧浓度DO 值不低于例如1至10 %，且优选不低于3至8 %。培养可以是分批培养或补料-分批培养。 在补料-分批培养的情况中，也可以通过对培养基连续或不连续序贯添加作为糖来源的溶 液和含有磷酸的溶液继续培养。
[0152] 要转化的宿主是如上文描述的，并且详细描述了大肠杆菌，宿主可以选自大肠杆 菌K12亚种大肠杆菌JM109菌株、DH5 a菌株、HBlOl菌株、BL21 (DE3)菌株等。实施转化 的方法和选择转化体的方法已经记载于Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor press(2001/01/15)等。在下文中，仅举例而言会明确描述 生成经转化的大肠杆菌并使用此菌生成预先确定的酶的方法。
[0153] 一般可以使用用于在大肠杆菌中生成外来蛋白质的启动子作为用于表达本发明 的多核苷酸的启动子。其例子可以包括有力的启动子，诸如PhoA、PhoC、T7启动子、Iac启 动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lambda噬菌体的PR和PL启动子、和T5启动子， 并且PhoA、PhoC和Iac启动子是优选的。例如，pUC (例如pUC19、pUC18)、pSTV、pBR (例如 pBR322)、pHSG (例如 pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398)、RSF (例如 RSF1010)、pACYC (例 如 pACYCl77、pACYCl84)、pMff (例如 pMffll9、pMffll8、pMff2l9、pMff 2l8)、pQE (例如 pQE3〇)及 其衍生物可以用作载体。来自噬菌体DNA的载体也可以用作另一种载体。此外，也可以使 用包含启动子并且可以表达插入DNA序列的表达载体。优选地，载体可以是pUC、pSTV、或 PMff 0
[0154] 还有，可以在本发明的多核苷酸下游连接作为转录终止序列的终止子。此类终止 子的例子可以包括T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素抗性基因的终止子、和大 肠杆菌trpA基因的终止子。
[0155] 优选地，用于将本发明的多核苷酸导入大肠杆菌中的载体是所谓的多拷贝类型， 并且其例子可以包括具有来自ColEl的复制起点的质粒，诸如基于pUC的质粒、基于pBR322 的质粒或其衍生物。在这里，"衍生物"意指那些已经对质粒给予核苷酸的修饰（诸如取代、 缺失、插入和/或添加）的。
[0156] 为了选择转化体，载体优选具有标志物，诸如氨苄青霉素抗性基因。具有有力启动 子的表达载体以此类质粒（例如基于pUC的（从Takara Bio Inc.供应）、基于pPROK的 (从Clontech供应）、基于pKK233_2的（从Clontech供应））商品化。
[0157] 可以通过使用本发明的所得表达载体转化大肠杆菌并培养此大肠杆菌获得本发 明的经修饰的酶。
[0158] 可以使用一般用于培养大肠杆菌的培养基（诸如M9/酪蛋白氨基酸培养基和LB 培养基）作为培养基。培养基可以含有预先确定的碳源、氮源、和辅酶（例如盐酸吡哆醇）。 具体地，可以使用蛋白胨、酵母提取物、NaCl、葡萄糖、MgSO 4、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸铁、 硫酸锰等。根据载体中的标志物和启动子的类型和要使用的宿主等，适当选择培养条件和 生产诱导条件。
[0159] 可以通过下述方法回收本发明的经修饰的酶。可以通过收集本发明的转化体，随 后粉碎（例如超声处理或匀浆化）或裂解（例如用溶酶体处理）微生物细胞以经粉碎或裂 解的产物获得本发明的经修饰的酶。可以通过使此类经粉碎或裂解的产物经受诸如提取、 沉淀、过滤和柱层析等技术获得本发明的经修饰的酶。
[0160] 本发明还提供了分析甘氨酸的方法。本发明的分析方法可以包括使用本发明的经 修饰的酶测量测试样品中含有的甘氨酸。
[0161] 测试样品没有特别限制，只要怀疑样品含有甘氨酸，并且其例子可以包括生物样 品（例如血液、尿液、唾液、泪液等）及食物和饮料（例如营养饮料和氨基酸饮料）。测试样 品中的甘氨酸可以为低浓度（例如小于ImM，诸如I yM以上且小于ImM的浓度）或高浓度 (ImM以上，诸如ImM以上且小于IM的浓度）。
[0162] 本发明的分析方法没有特别限制，只要可以使用本发明的经修饰的酶测量甘氨 酸。方法可以检测形成的乙醛酸，或者可以检测与乙醛酸形成一起作为副产物生成的见1 3或 H202。或者，可以偶联另一种反应以检测共辄反应（conjugate reaction)的产物。此类共 辄反应的例子可以包括下述共辄反应。
[0163] 甘氨酸氧化反应：由甘氨酸氧化酶催化的反应
[0164] 甘氛酸 +H20+02-乙酸酸 +NH 3+H202
[0165] 共辄反应：由过氧化物酶催化的反应
[0166] 2H202+4-氨基安体比林（Aminoantipyrine) +酸一醌亚胺（Quinoneimine)染料 +4H20
[0167] 在利用上述共辄反应时，在本发明的经修饰的酶外，可以使用4-氨基安体比林和 酚及过氧化物酶实施甘氨酸的测量。具体地，如下测量甘氨酸，即混合测试样品与4-氨基 安体比林和酚及水性溶液（例如缓冲液）中的过氧化物酶，然后使混合的样品经受上述 酶促反应，最终检测形成的醌亚胺染料的吸光度（约500nm)。可以定性或定量实施测量。 测量可以基于在使全部底物起反应前一直实施测量的端点方法或者基于评级法（rating method)(起始速率法（initial rate method))实施。氧化反应需要的氧气量非常小，并且 需要的氧气量被反应系统中的溶解氧覆盖。如此，一般地，没有必要对反应系统强制供应氧 气或含有氧气的气体。
[0168] 本发明的经修饰的酶与除甘氨酸外的氨基酸（例如L- a -氨基酸）不起反应或者 与其具有低反应性。因此，即使在测试样品中不仅含有甘氨酸而且还含有其它氨基酸时，可 以通过使用本发明的经修饰的酶特异性评估测试样品中的甘氨酸的量。
[0169] 可以使用本发明的经修饰的酶通过使用过氧化氢电极特异性评估测试样品中的 甘氨酸的量。
[0170] 此外，本发明包括用于分析甘氨酸的试剂盒，其包含（A)本发明的经修饰的酶。
[0171] 本发明的试剂盒可以进一步包含下列至少一项：(B)用于反应的缓冲溶液或缓冲 盐，（C)用于检测过氧化氢的试剂，⑶用于检测氨的试剂，和（E)用于检测乙醛酸的试剂。
[0172] (B)使用用于反应的缓冲溶液或缓冲盐来保持适合于目的酶促反应的反应溶液中 的pH值。
[0173] (C)在例如通过颜色显现或荧光检测到过氧化氢时使用用于检测过氧化氢的试 剂。例子可以包括过氧化物酶与可以变为其底物的颜色产生剂的组合。具体的例子可以包 括但不限于辣根过氧化物酶与4-氨基安体比林和酚的组合。
[0174] (D)用于检测氨的试剂的例子可以包括组合酚与次氯酸的吲哚酚法。
[0175] (E)用于检测乙醛酸的试剂的例子可以包括非专利文献6中描述的试剂的组合。
[0176] 本发明还提供了用于分析甘氨酸的检测系统，其包含（a)装置和（b)本发明的经 修饰的酶。
[0177] 本发明的经修饰的酶可以作为独立于能够在使用后的装置中被供应的微装置的 单元存在，或者可以先前在装置中注射，对装置固定化或保留于装置上。优选地，以先前在 装置中注射、对装置固定化或保留于装置上的形式提供本发明的经修饰的酶。将经修饰的 酶直接或间接固定化于装置或保留于装置上。例如，适当地，可以使用微装置（诸如包含通 道的微通道芯片）作为装置。
[0178]用于分析本发明的甘氨酸的检测系统可以进一步包含（C)用于反应的缓冲溶液 或缓冲盐、用于检测过氧化氢的试剂、用于检测氨的试剂、和用于检测乙醛酸的试剂中的至 少一种组分。用于分析本发明的甘氨酸的检测系统可以以组分（C)已经完全容纳于装置 中的形式，或者以组分（C)已经部分容纳于装置中并且剩余部分尚未容纳于装置中的形式 (例如在不同容器中容纳的形式）提供。在此情况中，在测量靶物质时，未容纳于装置中的 组分（C)可以通过将其注射入装置中使用。
[0179] 装置的例子可以包括（1)装置，其包含通过混合样品与组分（C)制备混合溶液的 第一部分和通过使制备的混合溶液于本发明的经修饰的酶接触来检测甘氨酸的第二部分 (在不同部分中实施混合步骤和检测步骤的装置）；（2)装置，其包含用于混合样品和组分 (C)与本发明的经修饰的酶以通过本发明的经修饰的酶检测甘氨酸的部分（在同一部分中 实施混合步骤和检测步骤的装置）；及（3)装置，其包含使样品和组分（c)(以及在有必要 时本发明的经修饰的酶）能够混合的通道和通过本发明的经修饰的酶检测甘氨酸的部分 (装置，其中在注射的入口中注射样品时，将样品送过通道以自动混合样品等，并且在检测 部分中自动检测所得的混合溶液中的甘氨酸）。装置（3)(特别是微通道装置形式的装置 (3))就自动化而言是优选的。在装置（3)中，本发明的经修饰的酶可以在通道中运行的发 送溶液中提供或者可以以对检测部分固定化或保留的形式提供，并且优选以对检测部分固 定化或保留的形式提供。
[0180] 本发明还提供了用于分析甘氨酸的酶传感器，其包含（a)检测电极和（b)固定化 或保留于检测电极上的本发明的经修饰的酶。本发明的经修饰的酶直接或间接固定化或保 留于电极上。
[0181] 例如，有可能使用用于检测过氧化氢的电极作为前述检测电极。更具体地，例子可 以包括用于检测过氧化氢的酶电极和用于检测过氧化氢的分开膜电极。在此情况中，可能 通过检测在甘氨酸被甘氨酸氧化活性氧化时生成的过氧化氢分析甘氨酸。已知传感器中采 用的构造可以直接利用或者通过适当修饰作为与上文描述的那些构造