获得包含癌症干细胞的细胞群的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种获得包含癌症干细胞的细胞群的方法。
【背景技术】
[0002] 癌症被认为是遗传疾病且因随时间推移基本发生在四个或更多的基因上的一系 列突变的作用的累积而形成，如"多阶段致癌理论"所提出的。根据受影响的器官或者特异 性表达的细胞表面蛋白质的不同，已经形成了数种类型的癌症；然而，每种癌症被认为是由 单一类型的癌细胞构成的同质组织。就此而言，每种抗癌剂，特别是被称为分子靶向抗癌剂 的抗癌剂，被设计为通过靶向"分子靶标"如特异性表达的蛋白质而攻击单一或有限类型的 癌细胞。通常，治疗药物和方法通过基于例如在癌细胞表面表达的蛋白质或从癌细胞中释 放并存在于体液中的生物标记物如"肿瘤标记物"而确定和诊断癌症的特异性来决定。
[0003] 作为癌症难治性的原因，提出了癌症干细胞的参与（癌症干细胞理论）。虽然已报 道从多种类型的癌症（患者组织）中分离癌症干细胞，但由于其丰度低且在培养中难以稳 定保持，癌症干细胞的分离和纯化较为困难，且这已经阻碍了大规模的研究和分析。而且， 并非所有的癌症干细胞已被分离。假定肿瘤组织中的癌细胞的类型在患者之间各不相同且 其是异质的和有限的。鉴于此并结合在把握所有种类的癌细胞中的困难，许多研究者对癌 症干细胞本身的存在以及癌症干细胞在癌症进展和恶化中所起的作用表达了否定的观点。 日本专利公开第2010-13380号（引入本文以供参考）公开了一种通过使用癌症干细胞筛 选杀死癌症干细胞的物质的方法。
[0004] 常规的使用抗癌剂的癌症疗法总是被例如癌症的复发和转移的问题所困扰。治疗 效果按照例如"五年存活率"表示，且总存活数（OS)或存活益处（survivalbenefit)被用 作终点（指标）。即，实际上，癌症难以"根治"是共识。推测很少达到癌症的"根治"是由 于以下原因。即，最终，抗癌剂，包括分子靶向药物，仅对群体中的特异性癌细胞有效，而对 剩余的呈现异质性的癌细胞或癌症干细胞无效。结果，治疗操作偶然地最终变成帮助那些 剩余的癌细胞和癌症干细胞增殖，从而引起复发和转移。因此推测几乎没有癌症被"根治" 的案例。需要的不仅是对新的治疗方法和治疗靶标的探索，还需要针对癌细胞"异质性"的 了解和措施。
[0005] 癌症干细胞可以使用标记物蛋白质例如⑶133和⑶44作为指标，通过例如使 用磁珠的分离方法（Jin等人，2008.Neuroscience;154, 541-550 (引入本文以供参考）、 MiltenyiBiotecGmbH制造的DiamondCD133IsolationKit)、涉及用流式细胞术分离 和收集的方法（Griguer等人，2008.PlosOne;3 (11)e3655(引入本文以供参考））、以及 激光显微解剖（LeicaCameraAG制造的LMD6500&LMD7000)而被浓缩。为培养和保持隔 离或分离的癌症干细胞，可以使用与透明质酸聚合的凝胶或者在透明质酸与明胶之间通 过聚合所获得的凝胶（Rehfeldt等人，2012Integr.Biol. ;4, 422-430(引入本文以供参 考），Sigma-AldrichCorporation制造的Hystem)、胶原凝胶（NipponBectonDickinson Company,Ltd.制造的Matrigel)等等。常规的用于分离表达⑶-44的细胞的技术需要昂贵 的仪器和试剂、用于安装待使用的仪器的空间以及相关的使用仪器的专业技能。此外，由于 分离的细胞须保持在聚合凝胶中或凝胶表面上，因此当细胞不表达荧光蛋白，或者无法进 行细胞染色等时，在明视场中观察细胞是极其困难的。而且，制备均一凝胶和将细胞条件保 持在恒定的水平较为困难。同时，所培养的细胞的收集和传代以及细胞分泌的因子等的收 集极其困难。此外，另一个问题是将细胞暴露于药物、生长因子、细胞因子等较为困难。
[0006] 引用列表
[0007] 专利文件
[0008] 专利文件I:JP2〇l〇-l338〇A
[0009] 非专利文件
[0010] 非专利文件IJin等人，2008.Neuroscience; 154, 541-550。
[0011] 非专利文件 2:Griguer等人，2008.PlosOne;3 (11)e3655。
[0012] 非专利文件 3:Rehfeldt等人，2012Integr.Biol. ;4, 422-430。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种获得包含癌症干细胞的细胞群（特别是，包含癌细胞的 细胞群）的方法。本发明的另一目的是提供一种浓缩表达CD44的细胞的方法。
[0014] 本发明首次涉及通过培养iPS细胞来诱导癌症干细胞。虽然所诱导的癌症干细 胞可能被区别于癌症干细胞的癌细胞所污染，但是可以在除去污染的癌细胞之后使用该癌 症干细胞。同时，已知多种癌症干细胞表达高水平的⑶44。已经发现当向培养基中加入透 明质酸以浓缩癌症干细胞时，表达高水平CD44的细胞被意外地高效浓缩，借此完成了本发 明。虽然具体实例将在以下显示，但是本发明不限于此。
[0015] 1. -种获得包含癌症干细胞的细胞群的方法，其包括在癌细胞的培养上清液的存 在下培养iPS细胞。
[0016] 2.前述1所述的方法，其中iPS细胞是人细胞。
[0017] 3.前述1或2所述的方法，其中培养时间为2周至2个月。
[0018] 4.前述1-3中任一项所述的方法，其中通过该方法获得的细胞群包含癌细胞。
[0019] 5.通过前述1-4中任一项所述的方法获得的细胞群。
[0020] 6. -种获得癌症干细胞的方法，其包括分离前述5所述的细胞群中包含的癌症干 细胞。
[0021] 7.通过前述6所述的方法获得的癌症干细胞。
[0022] 8. -种筛选抗癌剂的方法，其包括以下步骤：
[0023] (1)使前述5所述的包含癌症干细胞的细胞群或者前述7所述的癌症干细胞与抗 癌剂候选物相接触，以及
[0024] (2)确定候选物在细胞群或细胞上的效果。
[0025] 9.前述8所述的方法，还包括选择抑制细胞群或细胞的增殖的候选物的步骤。
[0026] 10.前述8或9所述的方法，其包括使前述5所述的包含癌症干细胞的细胞群与抗 癌剂候选物接触的步骤。
[0027] 11. -种浓缩表达⑶-44的细胞的方法，其包括在非粘附性条件下在透明质酸的 存在下培养包含表达CD-44的细胞的细胞群。
[0028] 12.前述11所述的方法，其中细胞群是人细胞群。
[0029] 13.前述11或12所述的方法，其中培养时间是2周至2个月。
[0030] 14. -种细胞群，包含通过前述11-13中任一项所述的方法浓缩的表达⑶44的细 胞。
[0031] 通过本发明能够获得包含在活体中构成肿瘤的多种癌症干细胞的细胞群以及多 种癌症干细胞。
【附图说明】
[0032] 图1示出通过miPS-LLCcm细胞的肿瘤形成；
[0033] 图2示出通过miPS-LLCcm细胞形成的肿瘤的组织学评价；
[0034] 图3示出通过miPS-LLCcm细胞形成的肿瘤的免疫染色结果；
[0035] 图4示出在Matrigel(R)中形成血管样结构的细胞；
[0036] 图5示出从源自miPS-LLCcm细胞的恶性肿瘤中分离的原代细胞培养及其悬浮培 养。原代培养显示出从在移植有miPS-LLCcm细胞的裸鼠中形成的瘤块中获得的细胞。悬 浮培养显示出通过在无血清培养基中培养miPS-LLCcm细胞而获得的球状体。左边的图片 显示出GFP表达；
[0037] 图6示出由miPS-LLCcm细胞的球状体形成的肿瘤的免疫染色结果；
[0038] 图7左）示出p53的表达，其是代表性的肿瘤抑制基因，且右）示出基质金属蛋白 酶2 (MMP2)的表达，其参与到癌症的浸润和转移；
[0039] 图8示出干细胞标记基因的表达；
[0040] 图9示出通过球形自组织映射的小鼠iPS-CSC的基因表达情况的可视化。在图中， 在顶行左起第二和第三个细胞以及底行最左边和左起第二个细胞中，主要在中央显示红色 (基因表达比在iPS细胞中水平更高），其被蓝色（基因表达比在iPS细胞中水平更低）环 绕。在顶行最右边的细胞和底行左起第二个细胞和最右边的细胞中，主要是在右边区域中 显示红色且在左边区域中显示蓝色；
[0041] 图10示出在各自独立的细胞之间基因表达的比较；
[0042] 图11-1示出在癌细胞培养上清液的存在下培养的人iPS细胞⑴；
[0043] 图11-2示出在癌细胞培养上清液的存在下培养的人iPS细胞⑵；
[0044] 图11-3示出在癌细胞培养上清液的存在下培养的人iPS细胞（3);
[0045] 图11-4示出在癌细胞培养上清液的存在下培养的人iPS细胞⑷；
[0046] 图11-5示出在癌细胞培养上清液的存在下培养的人iPS细胞（5);
[0047] 图12示出从人iPS细胞中诱导癌症干细胞；
[0048] 图13示出以rBC2LCN-FITC检测足细胞标记蛋白（podocalyxin);
[0049] 图14是显示在不添加rBC2LCN-FITC的情况下的一组图；
[0050] 图15示出在裸鼠中的肿瘤形成；
[0051] 图16示出从0CC-hiPS-29细胞中诱导干细胞；
[0052] 图17示出0CC-hiPS-29细胞的自更新能力；
[0053] 图18示出通过球形自组织映射的人iPS-CSC的基因表达情况的可视化。在图中， 在左侧黑色区域中显示蓝色（基因表达比在iPS细胞中水平更低），而在右下和左下角区域 中（在底行左起第四个细胞以及最右边的细胞中）或者在右下角区域中（在所有其他细胞 中）显示红色（基因表达比在iPS细胞中水平更高）。
[0054] 图19示意性地示出使用源自人胶质瘤的U251MG细胞的实验。
[0055] 图20示出在具有透明质酸（HA)的培养基中培养；
[0056] 图21示出对HA浓度的研究；
[0057] 图22示出非粘附性皿中的培养。具有：具有HA的培养基，不具有：不具有HA的培 养基（普通培养基）；
[0058] 图23示出细胞从球体的解离和自更新；
[0059] 图24-1示出⑶44基因表达水平的比较。A:A172细胞；
[0060] 图24-2示出CD44基因表达水平的比较。B:U251MG细胞；
[0061] 图24-3示出CD44基因表达水平的比较。C:U251MG-P1细胞；
[0062] 图25示出相对于U251MG细胞在U251MG-P1细胞中CD44基因的表达水平；
[0063] 图26示出通过在具有HA的培养基中培养的U251MG细胞的肿瘤形成；
[0064] 图27示出⑶44蛋白质表