一种全血捕获癌细胞的石墨烯芯片及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于功能材料技术领域，生物医学材料，特别涉及用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片及其制备方法。
【背景技术】
[0002]循环肿瘤细胞(CTCs)的检测、识别和分离，对癌症干细胞标记物的识别和认识有非常重大的意义。虽然CTCs在血液中的数量非常少(几个到上百个每毫升)掺杂在大量血细胞(19个每毫升)中，但在检查癌症的转移，预测病人的诊断，监测治疗的结果中，却起着非常重要的作用。举例说明，CTCs从原发性肿瘤中分离出来然后通过血管传输到身体的不同的器官，这些活着的肿瘤派生出的上皮细胞很有可能是癌症转移的根源，这一现象已经在癌症病人上皮血液中得到了证实。也就是说，CTCs不但可以代替侵入式的活组织检查来发现，检查癌症，而且他的数目对于临床治疗有重大意义。近些年来，有很多平台，比如说微流体，免疫磁珠等已经发展起来，这些对早期癌症的检查与诊断都是必不可少的。然而，现在对CTCs的分离与计数的方法都非常复杂，而且效率很低。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种用于全血捕获癌细胞的石墨烯芯片。
[0004]本发明另一目的在于提供一种制备成本低廉、简单便捷且具有极高灵敏度的用于全血捕获癌细胞的石墨烯芯片的制备方法。
[0005]本发明通过选用新颖的石墨烯材料，来制成不同基底形貌的表面，通过生物素/生物亲和素(b1tin/streptavidin)相互作用连接上特异性的抗体anti_EpCAM.在基底拓扑作用，硬度作用和抗体特异性识别作用的协同下实现对癌细胞的高效特异性捕获。并在病人血液中达到比较高的捕获效率，为以后的临床检测提供简便可行的方法。
[0006]本发明的用于全血捕获癌细胞的石墨烯芯片，是利用石墨烯材料所形成的具有花_结构的基底，所述石墨稀表面修饰有特异性识别肿瘤细胞的抗体(Ant 1-EpCAM )。
[0007]所述石墨烯的材料为改进的还原氧化石墨烯材料，在进行氧化的过程所用的方法是氧化剥离法。
[0008]所述还原氧化石墨烯薄膜是通过真空热还原的，还原温度为真空100°C以上。
[0009]所述还原氧化石墨稀的表面修饰有特异识别肿瘤细胞的抗体(Ant 1-EpCAM )。
[0010]所述还原氧化石墨烯基底在制备过程中所用的氧化石墨烯溶液的浓度为0~7mg/mD
[0011]本发明的用于全血捕获癌细胞的石墨烯芯片具有花瓣状的微纳米结构，通过微纳米结构与循环肿瘤细胞的拓扑结构产生增强粘附效应，另外，其特有的接近于生物体系的硬度为细胞的粘附提供了更匹配的条件，同时所制备的还原氧化石墨烯的薄膜具有超亲水性，为其具有超低背景吸附提供的必备的条件。
[0012]实验结果表明，本发明的用于全血捕获癌细胞的石墨烯芯片对特异性的循环肿瘤细胞(如乳腺癌细胞MCF7、前列腺癌细胞PC3)的富集效率高达90%以上，且非特异性的细胞系(如JurkatT淋巴细胞、Daudi淋巴细胞、Hela子宫癌细胞)却极少粘附在生物芯片上，从而可以实现在生物样品(血液)中的高效循环肿瘤细胞的捕获。例如，将病人血液(只需I毫升)滴入本发明的生物芯片上，可以实现对血液样本中循环肿瘤细胞的高效和高灵敏富集，而正常细胞却极少粘附在生物芯片上。本发明的生物芯片，临床实验中，可以达到非常好的捕获效率以及极低的背景吸附。
[0013]本发明的用于全血捕获癌细胞的石墨烯芯片的制备方法包括以下步骤:
(I)将石墨粉加入到含有发烟硝酸和浓硫酸的烧瓶中，在零摄氏度的情况下加入氯酸钾，所有的过程都在通氮气的情况下。然后在室温下搅拌烧瓶内的物体。
[0014](2)将步骤(I)得到的产物加入盐酸，洗到硫酸根消除。
[0015](3)将步骤(2)得到的产物用高纯水清洗到PH值中性。
[0016](4)将步骤(3)得到的产物用高温干燥的方法，得到粉末。
[0017](5)将步骤(4)得到的粉末进行称量，配成不同配比的浓度的GO溶液。
[0018](6)将步骤(5)得到的溶液进行真空抽滤成膜，制成氧化石墨烯的薄膜。
[0019](7)将步骤(6)得到的薄膜放入真空进行加热还原，加热的温度为100°C以上。
[0020](8)将步骤(7)得到的还原氧化石墨烯(rGO)的膜放入一芘甲酸的溶液中，得到PCA-rGO 基片。
[0021 ] (9)将步骤(8)得到的PCA-rGO薄膜固定在玻璃片上，得到rGO基片。
[0022](10)将步骤(9)得到的rGO基片放置在六孔板内，加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)与1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，在室温下放置一段时间。
[0023](11)将步骤(10)得到的rGO基片置于I链霉亲和素的磷酸盐缓冲液中，室温下进行反应，将基片取出并清洗；得到HA-rG0.(12)将步骤(11)得到的HA-rGO基片加入抗体(Anti_EpCAM)，室温下放置反应，得到An t 1-Ep CAM-rGO 基片。
[0024]所述石墨烯的材料为改进的还原氧化石墨烯材料，在进行氧化的过程所用的方法是氧化剥离法。
[0025]所述还原氧化石墨烯薄膜是通过真空热还原的，还原温度为真空100°C以上。
[0026]所述还原氧化石墨稀的表面修饰有特异识别肿瘤细胞的抗体(Ant 1-EpCAM )。
[0027]所述还原氧化石墨稀基底在制备过程中所用的氧化石墨稀溶液的浓度为0~7mg/ml ο
[0028]本发明的用于全血捕获癌细胞的石墨烯芯片具有制备成本低廉，操作简单，易工业化生产等优点，并已做了临床实验，具有非常灵敏的细胞亲和性与捕获效率。本发明的生物芯片特别适用于对前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、恶性黑色素瘤、软组织腺泡状肉瘤等引起转移的血液中的往肿瘤细胞均有很好的富集效果。本发明的用于循环肿瘤细胞富集和检测的生物芯片的制备过程无有素有害物质，环境友好，稳定性好。
【附图说明】
[0029]图1.本发明所用的全血癌细胞捕获的石墨烯生物芯片的制备方法。
[0030]图2.本发明制备的用于全血捕获癌细胞的石墨烯芯片的实物照片。
[0031]图3.本发明制备的用于全血捕获癌细胞的石墨烯芯片的在捕获完细胞后的环境扫描电镜照片。
[0032]图4.本发明实施例1_3、5制备的用于全血捕获癌细胞的石墨烯芯片捕获五种细胞系(MCF7、PC3、Hela、Daud1、Jurkat)的定量数据。
[0033]图5.本发明实施例6-13制备的用于全血捕获癌细胞的石墨烯芯片捕获的人体血液中的MCF7癌细胞与正常血细胞的三色染色图。
[0034]图6.本发明实施例6_13制备的用于全血捕获癌细胞的石墨稀芯片所捕获的临床病人血液中的癌细胞的定量数据。
[0035]
【具体实施方式】
[0036]实施例1。
[0037](I)将石墨粉加入到含有发烟硝酸和浓硫酸的烧瓶中，在零摄氏度的情况下加入氯酸钾，所有的过程都在通氮气的情况下。然后在室温下搅拌烧瓶内的物体80小时以上。
[0038](2)将步骤(I)得到的产物加入盐酸，洗到硫酸根消除。
[0039](3)将步骤(2)得到的产物用高纯水清洗到PH值为中性。
[0040](4)将步骤(3)得到的产物用高温干燥的方法，得到粉末。
[0041](5)将步骤(4)得到的粉末进行称量，配成GO溶液。
[0042](6)将步骤(5)得到的溶液进行真空抽滤成膜，制成氧化石墨烯的薄膜。
[0043](7)将步骤(6)得到的薄膜放入真空进行加热还原，加热的温度为100摄氏度以上。
[0044](8)将步骤(7)得到的还原氧化石墨烯(rGO)的膜放入一芘甲酸的溶液中，室温反应，得到PCA-rGO基片。
[0045](9)将步骤(8)得到的PCA-rGO薄膜固定在玻璃片上，得到rGO基片。
[0046](10)将步骤(9)得到的rGO基片放置在六孔板内，加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)与1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，在室温下放置反应。
[0047](11)将步骤(10)得到的rGO基片置于链霉亲和素的磷酸盐缓冲液中，室温下进行反应，将基片取出并清洗；得到HA-rGO。
[0048](12)将步骤(11)得到的HA-rGO基片加入抗体(Ant1-EpCAM)，室温下放置反应，得到 Ant1-EpCAM-rGO 基片。
[0049](13)将步骤(12)得到的Ant1-EpCAM-rGO基片正面朝上放置在6孔板中，加入3毫升浓度为IxlO5个/ml的乳腺癌细胞MCF7悬浮液，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为0~90分钟，更优选为45分钟)，吸去乳腺癌细胞MCF7悬浮液，将生物芯片在磷酸缓冲液中充分涮洗，然后将生物芯片捕获的乳腺癌细胞MCF7用质量浓度为4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，再用0.2%体积浓度的Trit1n X-100磷酸盐缓冲液穿膜，再用10 μ g/ml的DAPI磷酸盐缓冲液染色后，在PBS中涮洗3次后用空气气流吹干，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕获效率。乳腺癌细胞MCF7捕获定量数据如图3，图4所示。
[0050](14)作为对照组1，将步骤(12)得到的Ant1-EpCAM-rGO基片正面朝上放置在6孔板中，加入3毫升浓度为IxlO5个/ml的前列腺癌细胞PC3悬浮液，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间0~90分钟，更优选为45分钟)，吸去前列腺癌细胞PC3悬浮液，将生物芯片在磷酸缓冲液中充分涮洗，然后将生物芯片捕获的前列腺癌细胞PC3用质量浓度为4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定后，再用0.2%体积浓度的Trit1n X-100磷酸盐缓冲液穿膜，再用10 μ g/ml的DAPI磷酸盐缓冲液染色后，在PBS中涮洗3次后用空气气流吹干，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的前列腺癌细胞PC3进行计数，计算捕获效率。前列腺癌细胞PC3捕获定量数据如图4所示。
[0051](15)作为对照组2，将步骤(12)得到的Ant1-EpCAM-rGO基片正面朝上放置在6孔板中，加入3毫升浓度为IxlO5个/ml的人淋巴瘤细胞Jurkat悬浮液，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为0~90分钟，更优选为45分钟)，吸去人淋巴瘤细胞Jurkat悬浮液，将生物芯片在磷酸缓冲液中充分涮洗，然后将生物芯片捕获的人淋巴瘤细胞Jurkat用质量浓度为4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定后，再用0.2%体积浓度的Trit1n X-100磷酸盐缓冲液穿膜，再用10 μ g/ml的DAPI磷酸盐缓冲液染色后，在PBS中涮洗3次后用空气气流吹干，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每次至少3个基片，每个基片选取中间10个不同的位置)，并对生物芯片上所捕获的淋巴瘤细胞Jurkat进行计数，计算捕获效率。淋巴瘤细胞Jurkat捕获定量数据如图4所示。
[0052](16)作为对照组3，将步骤(12)得到的Ant1-EpCAM-rGO基片正面朝上放置在6孔板中，加入3毫升浓度为IxlO5个/ml的人淋巴B细胞瘤细胞Daudi悬浮液，置于细胞培养箱中(优选进行反应的时间为0~90分钟，更优选为45分钟)，吸去人淋巴B细胞瘤细胞Daudi悬浮液，将生物芯片在磷酸缓冲液中