周后， 观察到在肺中形成的肿瘤。根据公知方法通过原代培养所形成的肿瘤而建立miPS-LLCcm LMT细胞。将细胞保持在DMEM培养基（包含15%FCS、0.ImM的NEAA、2mM的L-谷氨酰胺、 0.ImM的2-巯基乙醇、50U/ml的青霉素和50U/ml的链霉素）中。使用RNeasy试剂盒（50) (QIAGENGmbH)，从miPS细胞、miPS-LLCcm球状体、miPS-LLCcmLMT球状体和LLC细胞中纯 化RNA，且通过RT-PCR比较p53基因与MMP2基因之间的表达水平。
[0122] 肺转移通过将本发明的细胞群注射到裸鼠的臀脉中而引起。与miPS细胞相比，作 为癌症抑制基因的P53的表达在由miPS-LLCcm细胞形成的球状体细胞中减少（图7,左）。 同时，通过原代培养在肺中形成的肿瘤而建立的癌症干细胞系miPS-LLCcmLMT显示出明显 高水平的基质金属蛋白酶2 (MMP2)表达，其参与到癌症的浸润和转移中（图7,右）。这些 结果表明表达高水平MMP2基因的癌症干细胞存在于miPS-LLCcm细胞中，且其优先浸润至 肺和形成的肿瘤。
[0123] (10)干细胞标记物的表达
[0124] 干细胞标记基因的表达通过RT-PCR在miPS细胞（在具有或不具有饲养细胞的情 况下培养）、miPS-LLCcm细胞、miPS-LLCcm原代细胞、和miPS-LLCcm球状体以及由这些细 胞形成的畸胎瘤和恶性肿瘤中进行检定。使用RNeasy试剂盒（50)(QIAGENGmbH)(由细胞 纯化）和TRIzol(InvitrogenCorporation)(由组织纯化）。关于干细胞性（sternness)标 记基因，检定那些Takahashi和Yamanaka报道（Cell126,663to676, 2006,引入本文以供 参考）中提出的标记基因。作为对照，检定在用作饲养细胞的MEF细胞中的表达。结果，证 实了干细胞性标记基因在通过本发明获得的细胞组中表达，且与畸胎瘤相比多个基因在肿 瘤样品中显示出增加的表达（图8)。
[0125] (11)通过微阵列的基因表达分析
[0126]通过使用RNeasy试剂盒（50)(QIAGENGmbH)或使用TRIzol(Invitrogen Corporation)从本实验获得的细胞群中提取RNA。随后，以脱氧核糖核酸酶I处理50yg 或更少的RNA并通过RNeasy试剂盒（50)(QIAGENGmbH)再次纯化。
[0127] 由 7. 5yg的RNA，通过逆转录使用SuperScriptII(InvitrogenCorporation)在 2mM的寡聚（oligo)dT、ImM的dATP、ImMdCTP、ImM的dGTP、0. 2mM的dTTP和 0? 8mM的氨基 烷基化dUTP的存在下合成cDNA。合成后，以核糖核酸酶H处理cDNA。由此合成的cDNA通 过乙醇沉淀而被收集并将其溶解在6. 7y1 0.IM的NaHCO3(pH8. 0)中。将等量的（6. 7y1) Cy3染料加入到溶液中，并在25°C下在暗处反应120分钟。通过QIAquick柱（QIAGENGmbH) 纯化Cy3标记的cDNA。使Cy3标记的cDNA与本发明人制备的小鼠细胞表面蛋白基因阵列 片（slide)在 55°C杂交 15 小时。随后，通过FLA8000 扫描仪（FujifilmCorporation)和 GenePix(R)Pro5. 1软件（Axoninstrument)检测并分析焚光强度。
[0128] 由通过微阵列检测的Cy3荧光强度，各个细胞中的基因表达水平表示为关于miPS 细胞中表达水平的相对值，其群集在球面自组织映射上，且使与miPS细胞相比呈现很大不 同的基因可视化（图9)。结果，发现所映射的包含生成的癌症干细胞的细胞群存在数种模 式的表型（图9)。这些结果表明即使当使用相同的iPS细胞时，根据所应用的条件，生成具 有不同功能和特性的癌症干细胞。
[0129] 为在各自独立的细胞之间进行比较，通过使微阵列所检测的荧光强度标准化并绘 制待比较的细胞的值的对数来创建散点图，且对基因表达模式进行比较（图10)。在通过 miPS-MC.E12co(通过将miPS细胞与BALBMC.E12细胞共培养而获得的细胞群）形成肿瘤 之前和之后（图10,左），以及在miPS-LLCcm和miPS-LLCcmLMT之间（肺转移miPS-LLCcm 细胞：假定是具有高转移潜能的iPS-CSC)(图10,右）还观察到基因表达的变化。
[0130] 实施例2.由人iPS细胞诱导癌症干细胞
[0131] (1)癌细胞的培养上清液的制备（条件培养基）
[0132] 将表2中所列的癌细胞系在具有DMEM培养基或RPMI1460培养基的粘附性培养皿 (直径为 100mm，TPPtechnoplasticproductsAG制造）中在 37°C和5%CO2的条件下培 养，其中DMEM培养基或RPMI1460培养基包含10%的FBS和1 %的青霉素/链霉素。
[0133]表2-1
[0147] 从达到80 %汇合的皿中移除培养基，且将细胞用包含5%FBS的DMEM或RPMI1460 培养基洗涤一次，且然后在相同的培养基中培养。培养基交换后24小时，收集培养上清液 并将其在300Xg、10分钟和4°C的条件下离心。将培养上清液在2000Xg、10分钟和4°C的 条件下进一步离心并通过〇. 22ym-孔的过滤器过滤，并且将所得的培养上清液用作条件 培养基。
[0148] (2)不具有饲养细胞的人iPS细胞的培养
[0149]将人iPS细胞（201B,RIKENBioResourceCenter) (Takahashi,K.等 人,Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsby definedfactors.Cell131:861to872(2007)，引入本文以供参考）接种在以层粘连蛋 白-5(ReproCELLInc?制造）涂覆的皿（直径为 60mm，TPPtechnoplasticproductsAG 制造）上，并用包含5ng/mlbFGF的R印roFF2培养基（R印roCELLInc?制造）在37°C和 2%CO2的条件下培养。直到细胞在不存在饲养细胞的情况下达到稳定的未分化状态，每天 交换整个培养基，并将细胞以每周一次的频率传代。
[0150] (3)癌症干细胞的诱导
[0151] 将从各个癌细胞系收集的条件培养基与ReproFF2或ReproStem(ReproCELL Inc.制造）或无bFGF的人iPS干细胞培养基（包含非必需氨基酸、200mML-谷氨酰胺、 KSR、和0.IM2-巯基乙醇/PBS的DMEM-F12培养基）以1 :1的比例混合以制备分化诱导培 养基。将处于未分化状态的稳定的人iPS细胞暴露于各种诱导培养基以诱导分化。在分化 诱导过程中，每天交换一半培养基且将细胞每两周传代一或两次。分化诱导的时间为至少 28天，且至多2个月。培养在37°C和2% 0)2的条件下进行。
[0152] 在倒置显微镜1X81(OlympusCorporation)下观察28天分化诱导后的细胞并通 过MetaMorph使用数码显微相机DP71(OlympusCorporation)采集图像（图11-1至图 11-5)。OCC-hiPS-1即使在28天诱导后，仍在保持干细胞性的同时继续增殖，而且还在SCID 小鼠中形成肿瘤，如将在以下所述。基于以上观察，证实了由〇CC-hiPS-l的癌症干细胞诱 导。类似地，0CC-hiPS-3、5、8、10、12、19、20以及23-28即使在28天诱导后，仍在保持干细 胞性的同时继续增殖。这表明癌症干细胞诱导的效率根据条件培养基而变化（图12)。
[0153] 癌症干细胞诱导之后的细胞系干细胞性使用rBC2LCN-FITC(WakoPureChemical Industries,Ltd.制造）进行检定。通过rBC2LCN-FITC检测的足细胞标记蛋白是对人多 能干细胞特异的糖蛋白配体。检测根据rBC2LCN-FITC的操作方案进行。检测到通过与 rBC2LCN反应而显示绿色荧光的细胞（图13,右），表明细胞系在癌症干细胞诱导之后具有 干细胞性。同时，当不加入rBC2LCN时，未检测到绿色荧光（图14)。
[0154] 将由人iPS细胞（OCC-hiPS-1)诱导的细胞群悬浮在HBSS中并移植到Balb/c-nu/ nu裸鼠和CB17scid小鼠的睾丸中。从移植有OCC-hiPS-1细胞的CB17scid小鼠中切除肿 瘤，其中OCC-hiPS-1细胞被证实在小鼠中形成肿瘤，且由肿瘤建立原代培养（图15)。将肿 瘤的一部分用4%的多聚甲醛磷酸缓冲溶液固定。
[0155] 将原代培养细胞系（OCC-hiPS-29细胞）在具有分化诱导培养基的层粘连蛋白-5 涂覆的皿中在37°C和2%CO2的条件下培养，其中分化诱导培养基使用A172细胞的培养上 清液制备。将细胞以每三至四天一次的频率传代。同时在〇CC-hiPS-29细胞中，检测到与 rBC2LCN-FITC反应的干细胞样细胞（图16)。将0CC-hiPS-29细胞在具有分化诱导培养基 的非粘附性皿中培养2至5天，其中分化诱导培养基使用A172细胞的培养上清液制备。形 成细胞密集区域，且在某些部位，形成球体。
[0156]将OCC-hiPS-29 细胞球体用Accutase溶液（Sigma-AldrichCo.LLC?制造）处 理并分散在包含胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基补充剂（Sigma-AldrichCo.LLC. 制造）、非必需氨基酸（Sigma-AldrichCo.LLC.制造）和200mML-谷氨酰胺（Nacalai Tesque,Inc?制造）的无血清培养基DMEM-F12 (Sigma-AldrichCo.LLC?制造）中，并且使 用相同的培养基，在非粘附性皿（直径为l〇mm，l〇ml培养基）中进行球状体培养10天。结 果，形成球体，表明细胞具有自更新能力（图17)。
[0157] 从通过使用RNeasy试剂盒（50)(QIAGENGmbH)的方法或者使用 TRIzol(InvitrogenCorporation)的方法的本实验获得的OCC-hiPS-6、OCC-hiPS-lO、 0CC-hiPS-12、0CC-hiPS-16、0CC-hiPS-17、0CC-hiPS-19、0CC-hiPS-20、0CC-hiPS-25和 0CC-hiPS-27中提取RNA。通过Agilent表达阵列分析（一色法）（通过TakaraBioInc. 按合同分析）实施微阵列。根据通过微阵列检测到的Cy3荧光强度，将各种细胞中以相对值 表示的表达水平群集在球面自组织映射上以使各种细胞中的基因表达水平可视化。结果， 发现所映射的包含生成的癌症干细胞的细胞群存在数种模式的表型（图18)。这些结果表 明，对于小鼠，即使当使用相同的iPS细胞时，也根据所应用的条件生成具有不同功能和特 性的癌症干细胞。
[0158] 实施例3.使用透明质酸的表达⑶44的细胞的浓缩
[0159]