达水平的比较。A:具有普通培养基的粘附性皿；N:具有 普通培养基的非粘附性皿；以及H:具有含HA的培养基的非粘附性皿；
[0065] 图28示出星形胶质细胞标记蛋白（GFAP)的检测；并且
[0066] 图29示出在具有HA的培养基中培养Sk0v-3细胞。
【具体实施方式】
[0067] 1.获得包含癌症干细胞的细胞群的方法
[0068] iPS细胞是源自脊椎动物的细胞，优选哺乳动物。哺乳动物的实例包括人、小鼠、 大鼠、仓鼠、兔子、狗、猫、牛、马、羊和猴子。iPS细胞优选源自灵长目动物或啮齿目动物，更 优选源自人或小鼠，且更优选源自人。作为iPS细胞，例如，可以使用iPS-MEF-Ng-20D17、 iPS-MEF-Ng-178B-5、iPS-MEF-Fb/Ng-440A-3、iPS-MEF-Ng-492B-4、iPS-Stm-FB/gfp-99-l、 iPS-Stm-FB/gfp-99-3、iPS-H印-FB/Ng/gfp-103C-l、iPS-Ll、iPS-Sl、253Gl、409B2、454E2、 HiPS-RIKEN-lA、HiPS-RIKEN-2A、HiPS-RIKEN-12A、Nips-B2 等等。
[0069] 癌细胞是源自脊椎动物的细胞，优选哺乳动物。哺乳动物的实例包括人、小鼠、大 鼠、仓鼠、兔子、狗、猫、牛、马、羊和猴子。癌细胞优选源自灵长目动物或啮齿目动物，更优 选源自人或小鼠，且更优选源自人。癌细胞的实例包括肺癌、胚胎癌、恶性黑色素瘤、乳腺 癌、结肠直肠癌、胰腺癌、脑肿瘤、肝癌、肝细胞瘤、胃肠道癌、卵巢癌、白血病和淋巴瘤的细 胞。作为癌细胞，例如，可以使用例如LLC、P19-CL6、B16-F10、BALBMC.E12、A172、U251-MG、 MDA-MB-415、MDA-MB-231、T-47D、ZR-75-1、SK-BR-3、BT-549、MCF7、HT-29、PANCl、SK0V3、 H印G2、Huh-7、PLC/PRF-5、ECC、CW-2、PMF-kol4、MY、M0LT4、KLM-1、PK8、PK59、A549、Li-7、 0VCAR-3、Lu99B、RERF-LC-KJ、0VK18 和RERF-LC-AI的细胞。在一方面，癌细胞选自LLC、 P19-CL6、B16-F10、BALBMC.E12、A172、MDA-MB-415、T-47D、BT-549、HT-29、SK0V3、MY、 M0LT4、PK59、A549、Li-7、0VCAR-3、Lu99B和RERF-LC-KJ。在一方面，癌细胞选自A172、 MDA-MB-415、T-47D、BT-549、HT-29、SK0V3、MY、M0LT4、PK59、A549、Li-7、0VCAR-3、Lu99B和 RERF-LC-KJo
[0070] 用于获得培养上清液的iPS细胞和癌细胞可以或可以不源自相同来源。例如，源 自人的iPS细胞可以在源自小鼠、大鼠或猴子的癌细胞的培养上清液的存在下培养。在一 方面，用于获得培养上清液的iPS细胞和癌细胞源自相同的来源。
[0071] 作为获得癌细胞的培养上清液的培养基，能够根据将要使用的癌细胞选择和使 用任何细胞培养基。其实例包括，但不限于DMEM、Glasgow'SMEM(GMEM)、EMEM、MEMa、 RPMI-1640、Ham'sF-10、培养基 199、Ames' 培养基、BGJb培养基、EHAA、CMRL-1066 培养基、 Fischer's培养基、頂DM、Leibovitz、McCoy's5A改良培养基、NCTC培养基、Swim'sS-77 培养基、Waymouth培养基、William's培养基E、Ham'sF-12和MCDB培养基。癌细胞的培养 上清液通过例如，洗涤已在孵箱中与新鲜培养基达到80%汇合的癌细胞，且然后将细胞在 新鲜培养基中进一步培养24小时至72小时，优选24小时至48小时而获得。用于获得培 养上清液的培养基可以或可以不包含血清。培养上清液可以在通过0. 45ym孔或0. 22ym 孔的过滤器过滤之后加以使用。由于癌症干细胞诱导因子被认为包含在癌细胞的培养上清 液的液体部分中，因此通过从培养上清液中除去大分子例如细胞碎片和外来体获得的癌细 胞的培养上清液的液体部分可以被用作本发明方法中的"癌细胞的培养上清液"。
[0072] 作为用于培养iPS细胞的培养基，可以使用任何干细胞培养基，且其实例包括，但 不限于，DMEM、R印roFF2或者R印roStem(R印roCELLInc.)、和包含非必需氨基酸、200mM 的L-谷氨酰胺、KSR和0.IM的2-巯基乙醇/PBS的DMEM-F12培养基。
[0073] 将iPS细胞在癌细胞的培养上清液的存在下培养约2周至2个月，优选约4周至 2个月。例如，每一至四天将一部分（例如，一半）或全部的iPS细胞培养基换成癌细胞的 培养上清液。可以基于在裸鼠中形成恶性肿瘤的能力，具体通过样本的病理诊断（对于活 性细胞分裂、非典型细胞、血管生成等等的存在或不存在），确认癌症干细胞在获得的细胞 群中的存在。还可以通过例如在体外形成血管结构的能力评价、如由P53表示的肿瘤抑制 因子的基因表达的变化、以及已知癌症干细胞标记物例如CD44的表达来确认在获得的细 胞群中癌症干细胞的存在。
[0074] 癌症干细胞是具有分化潜能的细胞，其最终变成终末分化的癌细胞。癌症干细胞 位于iPS细胞与癌细胞之间，且存在处于不同分化阶段的多种癌症干细胞。通过本发明方 法获得的细胞群是包含多种癌症干细胞的异质细胞群，且其还可以包含癌细胞。通过本发 明方法获得的细胞群可以通过细胞分类器等等分成处于不同分化阶段的各自独立的癌症 干细胞，且其还可以根据公众已知的技术分成单个的细胞。同时，鉴于癌症干细胞被认为通 过单个细胞的自更新而形成球状体，还可以通过球状体培养进行单个细胞克隆，然后将球 状体分成单个细胞。
[0075] 根据本发明，包含多种在活体中构成肿瘤的癌症干细胞的细胞群可以在体外由多 能iPS细胞制备。由于通过本发明获得的细胞群在充分短的时间内从iPS细胞中被诱导， 因此不认为引入了基因突变。即，根据本发明，可以广泛地诱导没有积聚基因突变的多种类 型的癌症干细胞。使用通过本发明获得的细胞群和癌症干细胞，可以广泛和系统地分析和 研究活体中出现的细胞和癌症干细胞。例如，通过例如下一代测序仪、表观遗传分析、蛋白 质组分析、以及代谢组分析进行的广泛的基因表达分析所获得的研究发现可以被编缉成作 为细胞信息的数据且被用于抗癌剂的开发。
[0076] 通过本发明的方法获得的细胞群或癌症干细胞可以用在筛选抗癌剂的方法中。为 了使通过本发明方法获得的细胞群或癌症干细胞与抗癌剂候选物接触，可以将抗癌剂候选 物加入到通过本发明方法获得的细胞群或癌症干细胞的培养基中。
[0077] 候选物的实例包括有机低分子量化合物、核酸、糖、脂类、氨基酸、蛋白质、抗体、通 过组合化学技术制备的化合物库、通过固相合成或噬菌体展示法制备的随机肽库、以及天 然成分（例如，源自微生物、动物、植物或海洋有机体的成分）。候选物在培养基中的浓度可 以为约Ippb至1 %，优选约Ippm至0. 1 %。当候选物具有低水溶性时，其可以被溶解在合 适的有机溶剂例如乙醇和DMSO中，或以候选物与无毒酸或碱的盐形式溶解在培养基中。
[0078] 候选物的效果可以基于例如细胞增殖而确定。抑制通过本发明方法获得的包含癌 症干细胞的细胞群或癌症干细胞的细胞增殖的候选物可以被选为可用作抗癌剂的物质。细 胞增殖可以通过在显微镜下对活细胞进行计数，或通过MTT检定、台盼蓝拒染检定、细胞内 ATP测定法、使用刃天青的代谢活性检定（QBlue检定）、或者AlamarBlue检定而确定。例 如，比对照抑制细胞增殖10 %或更多、优选20 %或更多、更优选50 %或更多的候选物被选 为可用作抗癌剂的物质。
[0079] 2?浓缩表达⑶44的细胞的方法
[0080] ⑶44是用于透明质酸的I型跨膜糖蛋白受体。其在癌细胞例如胶质瘤的表面高 度特异性地表达，且已知为人胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等等的癌症干细胞标记物。CD44的 功能包括例如细胞聚集、细胞外周基质的保持、基质_细胞信号传导、以及基质金属蛋白酶 (MMP)的取向控制（细胞迀移和浸润）。
[0081] 包含表达CD44的细胞的细胞群是源自脊椎动物优选哺乳动物的细胞群。哺乳动 物的实例包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、狗、猫、牛、马、羊和猴子。包含表达CD44的细胞的 细胞群优选源自灵长目动物或啮齿目动物，更优选源自人或小鼠，且更优选源自人。优选的 是包含表达CD44的细胞的细胞群包含以较高水平表达CD44的细胞，使得CD44在蛋白质水 平通过蛋白印迹、免疫染色等可测。在一方面，表达CD44的细胞是癌症干细胞。作为包含 表达CD44的细胞的细胞群，可以使用例如U251MG细胞和A172细胞（人胶质瘤）、SkOv-3 细胞（人卵巢癌）、4T1细胞（小鼠乳腺癌）、MDA-MB-231细胞（人乳腺癌）、AsPC-I细胞 (人胰腺癌）和PC-3细胞（人前列腺癌）。
[0082] 透明质酸由二糖重复单元构成，二糖由N-乙酰葡糖胺和葡糖醛酸组成。本发 明中使用的透明质酸的分子量为约500-2, 000, 000,优选约1，000-1，500, 000,更优选约 3, 000-1，000, 000。根据本发明的方法，可以原样使用天然出现的透明质酸，还可以使用通 过以酶（透明质酸酶）降解或以酸水解获得的具有降低的分子量的低分子量透明质酸。
[0083] 在本说明书中，术语"透明质酸"既包括高分子量透明质酸也包括低分子量透明质 酸。"高分子量透明质酸"指的是具有100, 〇〇〇或更高分子量的透明质酸，优选300, 000或 更高，更优选500, 000或更高，更优选700, 000或更高，且特别是1，000, 000或更高。天然 出现的透明质酸归入上述具有高分子量的"透明质酸"（即，高分子量透明质酸）内。
[0084] 本发明中使用的"低分子量透明质酸"可以通过以酶、酸、碱等化学处理透明质酸 以降低透明质酸的分子量而获得，或者通过从天然出现的透明质酸中分离分子量等于或低 于预定值的透明质酸而获得。"低分子量透明质酸"指的是具有1〇〇, 〇〇〇或更低分子量的透 明质酸，且分子量的上限为约100, 〇〇〇、70, 000、50, 000、30, 000、10, 000或5, 000,而分子量 的下限为约 500、1，000、2, 000 和 3, 000。
[0085] 透明质酸可以源自动物，例如，源自鸡冠和脐带。透明质酸还可以源自微生物例如 乳酸菌和链球菌。
[0086] 将透明质酸以约0.Iyg/ml-5000yg/ml的浓度加入培养基中，优选约Iyg/ ml-3000yg/ml，更优选约 5yg/ml-1000yg/ml，且更优选约 10yg/ml-200yg/ml。
[0087] 包含表达CD44的细胞的细胞群可以根据各个细胞类型以常规培养方法和培养条 件培养。可以将透明质酸加入至任何细胞培养基中，且细胞培养基的实例包括，但不限于， DMEM、Glasgow'sMEM(GMEM)、EMEM、MEMa、RPMI-1640、Ham'sF-1