(1)概述
[0160] 使用源自人胶质瘤的U251MG细胞的实验概述在图19中说明。在传代时，将在普通 粘附性皿中培养的细胞转移到包含透明质酸（HA)的培养基中并在非粘附性皿中培养。将 细胞进一步传代以在非粘附性皿中形成球体。向裸鼠接种球体以制备荷瘤小鼠。随后，在 粘附性皿中建立原代培养（指的是U251MG-P1)。将原代培养细胞在具有HA的培养基中再 次传代并在非粘附性皿中培养。
[0161] (2)使用包含透明质酸的培养基培养
[0162] 将源自人胶质瘤的A172细胞、U251MG细胞和U251MG-P1细胞各自在非粘附性皿 中培养2至5天，该非粘附性皿具有含HA的培养基（包含100yg/ml的透明质酸钠（透明 质酸钠由WakoPureChemicalIndustries,Ltd?制造，由鸡冠制成）、10%FBS、50U/ml的 青霉素和50yg/ml的链霉素的DMEM)或者不含HA的普通培养基（包含10%的FBS、50U/ ml的青霉素和50yg/ml的链霉素的DMEM)。在不存在HA的情况下几乎观察不到细胞增殖 (在图20中仅显示U251MG-P1的结果），而形成细胞密集区域，且在存在HA的情况下在某 些部位形成球体（图20,各图的右边）。而且，鉴于这些细胞在普通粘附性皿中的增殖被证 实，则所使用的细胞被认定为处于较好条件中（图20,各图的左边）。
[0163] 将A172细胞和U251MG细胞各自在具有含HA的培养基（包含O-lOOyg/ml的透 明质酸钠、10%的FBS、50U/ml的青霉素和50yg/ml的链霉素的DMEM)的非粘附性皿中培 养5天（图21)。虽然球体的形成在各个浓度下得到证实，但是在100yg/ml的浓度下一致 地观察到球体。由于在100yg/ml与200yg/ml的浓度之间没有观察到区别，在随后的检 定中以100yg/ml的浓度加入HA。
[0164] 而且，作为在非粘附性皿中以类似方式培养2周的结果，两个细胞类型在添加HA 的情况下均形成球体，并且，在球体周围观察到粘附于皿表面的细胞（图22,具有）。虽然 在不添加HA的情况下观察到球体的形成，但是球体的数量小于在添加HA的情况下观察到 的球体的数量。而且，在球体生长到直径约200ym时，其被观察到分解或停止生长，且这在 A172细胞中是显著的（图22,不具有）。
[0165] (3)球体形成能力的证实
[0166] 将在具有HA的培养基中制备的A172细胞、U251MG细胞和U251MG-P1细胞球体悬 浮在Accutase溶液（Sigma-AldrichCorporation制造）中以分散细胞。随后，将细胞各 自在具有含HA的培养基的非粘附性皿中新培养2周（图23)。所有细胞再次形成球体， 且在球体周围观察到粘附于皿表面的细胞，表明体具有自更新能力。
[0167] (4)⑶44基因表达水平的比较
[0168] 从分别在具有普通培养基的粘附性皿中和在具有含HA的培养基的非粘附性皿中 培养的A172细胞、U251MG细胞和U251MG-P1细胞中提取RNA，且通过qPCR分析CD44基因 表达水平（图24-1至图24-3)。关于U251MG细胞和U251MG-P1细胞，还在具有普通培养基 的非粘附性皿中培养的细胞上实施RNA提取和比较。
[0169] 与在粘附性皿中的普通培养相比，⑶44基因表达通过非粘附性皿中的普通培养得 到促进。通过在具有含HA的培养基的非粘附性皿中的培养，表达水平更加提高。在U251MG 细胞中，基因表达是在具有普通培养基的粘附性皿中的培养中观察到的基因表达的约2. 2 倍。
[0170] 将U25IMG细胞和U25IMG-Pl细胞分别在具有普通培养基的粘附性皿中培养，且在 它们之间比较CD44基因表达水平（图25)。发现在U251MG-P1中的表达水平是U251MG中 表达水平的约3. 9倍。这些结果表明⑶44基因表达可以被诱导或者表达较高水平⑶44基 因的细胞可以通过本培养方法，即，通过在具有含HA的培养基的非粘附性皿中的U251MG细 胞的球状体培养，而得到选择性的生长。而且，在U251MG-P2细胞中，该细胞通过原代培养 从接种有U251MG-P1细胞的裸鼠切除的肿瘤而获得，CD44基因表达水平恒定地高于亲株细 胞（数据未显示）。
[0171] (5)在具有HA的培养基中球状体培养（ITS+，FBS-)之后U251MG细胞的肿瘤形成 能力
[0172] 将U251MG细胞在具有HA的培养基中培养5天，且然后在非粘附性皿（直 径为10mm，IOml培养基）中进行球状体培养2周（在包含100yg/m透明质酸钠和 ITS(Sigma-AldrichCorporation制造）的培养基中培养）。将所得到的细胞移植到裸鼠 Balb/c-nu/nu，雌性，4周大，且观察小鼠4周（图26)。将从一至三个皿中收集的细胞移植 到每个小鼠的左腹。在每个小鼠的右腹，移植IO7个普通培养的U251MG细胞。通过移植从 两个或更多皿中收集的细胞而生成荷瘤小鼠。移植IO7个细胞后40天的肿瘤体积（（肿瘤 宽度2X肿瘤长度）/2)为1642. 8mm3(n= 2)。基于即使当在相同条件下移植相同数量普 通培养的U251MG时也没有形成肿瘤的观察，显示出通过本发明的方法获得的细胞群具有 肿瘤形成能力。
[0173] (6)在具有HA的培养基中进行球状体培养的细胞中的CD44蛋白表达水平
[0174] 将A172细胞和U251MG细胞分别在具有普通培养基（A)的粘附性皿、具有普通培 养基（N)的非粘附性皿、以及具有含HMH)的培养基的非粘附性皿中培养，并通过蛋白质印 迹比较CD44蛋白质表达水平（图27)。使从各种细胞中提取的总蛋白质（IOiig)进行电 泳。作为一抗，使用抗⑶44小鼠单克隆抗体（KatayamaChemicalIndustriesCo.，Ltd?制 造）和HRP标抗的抗小鼠IgG抗体（CellSignalingTechnologyJapan，K.K?制造）。同 时，使用抗(6-肌动蛋白抗体（CellSignalingTechnologyJapan,K.K?制造）和HRP标 抗的抗兔IgG抗体（CellSignalingTechnologyJapan,K.K?制造），检测到作为构成性表 达的蛋白的内部指标的(6-肌动蛋白。
[0175] 在两种细胞系中，通过在非粘附性皿中的培养，CD44蛋白质的表达水平提高，且该 表达水平通过用具有HA的培养基培养而进一步提高。
[0176] (7)U251MG_P1中星形胶质细胞标记蛋白的检测
[0177] 为证实U25IMG-P1细胞源自胶质瘤，将U25IMG细胞、U25IMG-P1细胞和U251MG-P2 细胞（通过原代培养从接种有U251MG-P1细胞的裸鼠中切除的肿瘤而获得的细胞）在具 有普通培养基的粘附性皿中培养，并通过蛋白印迹检测作为星形胶质细胞的标记蛋白质的 GFAP蛋白质（图28)。另外，将从不表达GFAP的细胞（源自人卵巢癌的SkOv-3细胞）中 提取的蛋白质用作阴性对照。将从各种细胞中提取的总蛋白质（IOyg)进行电泳，且然后 使用抗GFAP抗体（SantaCruzBiotechnology,Inc?制造）和HRP标抗的抗小鼠IgG抗体(CellSignalingTechnologyJapan,K.K?制造）进行检测。检测到作为构成性表达的蛋 白的内部指标的肌动蛋白。
[0178] 关于以上各种细胞系，在图28中将U251MG细胞标示为0,将U251MG-P1细胞标示 为P1，将U251MG-P2细胞标示为P2,且将Sk0v-3细胞标示为Sk0v-3。证实U251MG-P1和 U251MG-P2细胞当在粘附性皿中培养时表达GFAP。
[0179] (8)Sk0v-3细胞的HA培养
[0180] 就U251MG细胞而言，将Sk0v-3细胞和SkOv-3-Pl细胞（通过原代培养从接种有 SkOv-3细胞的小鼠中切除的癌症而获得的细胞）分别在具有含HA的培养基（包含100yg/ ml的透明质酸钠（透明质酸钠由WakoPureChemicalIndustries,Ltd.制造，由鸡冠制 成）、10%的FBS、50U/ml的青霉素和50μg/ml的链霉素的RPMI1640)的非粘附性皿中或者 在具有普通培养基（包含10%的？85、501]/1111的青霉素和50 1^/1111的链霉素的1?^11640) 的非粘附性皿中培养4天（图29)。
[0181] 关于SkOv-3细胞，虽然在具有HA的培养基中观察到球体，但在不具有HA的培养 基（HA-，普通培养基）中未观察到球体。关于SkOv-3-Pl细胞，在存在HA的情况下球体尺 寸生长，且存在许多粘附于球体周围的皿表面的细胞。在不具有HA的培养基中（普通培养 基），少量粘附于皿表面的细胞形成小球；然而，与用具有HA的培养基的培养相比，该生长 较慢且球体的尺寸较小。在粘附性皿中，在存在或不存在HA之间几乎没有差别，且球体正 常生长（数据未显示）。
【主权项】
1. 一种获得包含癌症干细胞的细胞群的方法，其包括在癌细胞的培养上清液的存在下 培养iPS细胞。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述iPS细胞为人细胞。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中培养时间为2周至2个月。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中通过所述方法获得的细胞群包含癌细 胞。5. -种细胞群，通过权利要求1-4中任一项所述的方法获得。6. -种获得癌症干细胞的方法，其包括分离权利要求5所述的细胞群中包含的癌症干 细胞。7. 通过权利要求6所述的方法获得的癌症干细胞。8. -种筛选抗癌剂的方法，其包括以下步骤： (1) 使权利要求5所述的包含癌症干细胞的细胞群或者权利要求7所述的癌症干细胞 与抗癌剂候选物接触，以及 (2) 确定所述候选物对所述细胞群或所述细胞的效果。9. 根据权利要求8所述的方法，还包括选择抑制所述细胞群或所述细胞的增殖的候选 物的步骤。10. 根据权利要求8或9所述的方法，其包括使权利要求5所述的包含癌症干细胞的细 胞群与抗癌剂候选物接触的步骤。11. 一种浓缩表达CD44的细胞的方法，其包括在透明质酸存在下在非粘附性条件下培 养包含表达CD44的细胞的细胞群。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞群是人细胞群。13. 根据权利要求11或12所述的方法，其中培养时间为2周至2个月。14. 一种细胞群，包含通过权利要求11-13中任一项所述的方法浓缩的表达⑶44的细 胞。
【专利摘要】本发明涉及一种获得包含癌症干细胞的细胞群的方法，其包括在癌细胞条件培养基的存在下培养iPS细胞。
【IPC分类】C12N5/095, C12Q1/02
【公开号】CN105102614
【申请号】CN201480016815
【发明人】妹尾昌治, 水谷昭文, 笠井智成
【申请人】国立大学法人冈山大学, Lsip基金运营联合公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年3月19日
【公告号】US20150079626, WO2014148562A1