多系统萎缩症风险的检测方法、检测试剂盒以及多系统萎缩症的治疗或预防药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多系统萎缩症的发病风险的检测方法等。
【背景技术】
[0002] 多系统萎缩症（Multiple System Atrophy ;MSA)是一种难以治疗的神经变性疾 病。平均发病年龄为57. 5±7. 2岁，临床表现以小脑性共济失调、帕金森病、自律神经失调 症候、锥体束障碍症候的各种组合出现。具代表性的包括以小脑性共济失调为主要症状 的MSA-C以及以帕金森病为主要症状的MSA-P这两种临床分型，MSA-C对应橄榄体脑桥小 脑萎缩症，MSA-P对应纹状体黑质变性症。此外，存在以自律神经失调障碍为主要症状的 Shy-Drager综合征。日本人中，与MSA-P相比MSA-C的发病率较高，而欧美人中MSA-P的发 病率更高。
[0003] 病理学上，神经胶质细胞胞衆包涵体（glial cytoplasmic inclusion ;GCI)为特 征，a-突触核蛋白为主要成分。
[0004] MSA被视为具代表性的散发性神经变性疾病，虽然非常罕见，但是目前为止已发现 多个MSA多发家系（非专利文献1-3)，启示着存在遗传性因素的参与。
[0005]目前为止，MSA的发病机理完全没有阐明，作为治疗实施着对应症状的对症治疗 法。
[0006] 现有技术文献
[0007] 非专利文献
[0008]非专利文献 I: Hara K 等人 Arch Neurol 2007 ;64:545-51.
[0009]非专利文献 2:WulIner U 等人 J Neurol Neurosurg Psychiatry 2009; 80:449-50.
[0010]非专利文献 3:Hohler AD 和 Singh VJ. J Clin Neurosci 2012 ;19:479-80.
【发明内容】
[0011] 技术问题
[0012] 本发明的目的在于通过确定MSA的致病基因而阐明发病机理，进而寻找出其治疗 方法。
[0013] 技术方案
[0014] 本发明的发明者们为解决上述技术问题，反复研究的结果发现MSA多发家系中存 在对羟基苯甲酸酯聚戊稀转移酶（Para-hydroxybenzoate-polyprenyltransferase)基因 (以下有时将？3抑-117(11'(?5^361120&七6-口〇15^代11711：抑118€6抑86(￡(] 2.5.1.39)称为"辅酶 Q2 "或" C〇Q2 "，其基因称为" C0Q2 "或" C0Q2基因"）突变的携带者，确认部分家族性多系统萎 缩症中，只要出现C0Q2突变的纯合型突变或者复合杂合型突变，即为充分条件而发病。并 且，还发现在散发性MSA中，杂合的C0Q2突变是MSA发病的巨大危险因素。而且，由于C0Q2 参与CoQlO的生物合成，因此对家族性以及散发性MSA患者的组织中的CoQlO量进行测定， 其结果证实了 CoQlO量变为低下，确认了在理论上极力启示CoQlO给药具有治疗效果，从而 完成了本发明。
[0015] SP，本发明涉及以下⑴至（9):
[0016] (1) 一种检测个体（subject)的多系统萎缩症风险的方法，包括步骤：检测从个体 采取的样品中的使辅酶QlO生物合成低下的突变。
[0017] (2)如上述（1)所述的方法，所述的使辅酶QlO生物合成低下的突变，是抑制对羟 基苯甲酸酯聚戊稀转移酶（Para-hydroxybenzoate-polyprenyltransferase)(辅酶 Q2)的 表达或功能的突变。
[0018] (3)如上述⑵所述的方法，所述的抑制辅酶Q2的表达或功能的突变选自由序列 号 1 中的 P49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、T267A、S297C、R337Q、R337X 以及 V343A组成的群。
[0019] (4)如上述（2)所述的方法，所述的抑制辅酶Q2的表达或功能的突变为V343A。
[0020] (5) -种检测多系统萎缩症风险的试剂盒，包括以下⑴至（iii)中的至少一个：
[0021] (i)与一种区域杂交的核酸，该区域包含辅酶Q2基因中的、编码从由辅酶Q2蛋白 (序列号1)的49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位以及 343位组成的群中选择的位点的氨基酸的核酸；
[0022] (ii)能够扩增一种区域的引物对，该区域包含辅酶Q2基因中的、编码从由辅酶Q2 蛋白（序列号1)的49位、57位、69位、78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位以 及343位组成的群中选择的位点的氨基酸的核酸；
[0023] (iii)仅与在序列号 1 中具有从由 P49H、S57T、R69H、M78V、I97T、P107S、S113F、 T267A、S297C、R337Q、R337X以及V343A组成的群中选择的至少一个突变的辅酶Q2蛋白、和 野生型辅酶Q2蛋白中的任意个结合的不发生交叉反应的抗体。
[0024](6)-种包含辅酶QlO的多系统萎缩症的预防或治疗药剂。
[0025](7)-种包括辅酶QlO给药步骤的多系统萎缩症的预防或治疗方法。
[0026] (8) -种多系统萎缩症的预防或治疗药剂的筛选方法，包括步骤：
[0027] 使候选化合物和细胞相接触而进行培养（incubate);
[0028] 选择使细胞内的辅酶QlO量提高的候选化合物。
[0029] (9) 一种编码包含V343A突变的辅酶Q2蛋白的核酸。
[0030] 有益效果
[0031] 根据本发明，通过检测个体的C0Q2基因的特定突变的有无这一简便的方法，能够 评估MSA发病风险。
[0032] 如果被判断为高MSA发病风险，则认为通过补充CoQlO而抑制发病，并且极力启示 CoQlO的补充可能对MSA的治疗也是有效的。
【附图说明】
[0033] 图IA示出6个MSA多发家系的家系谱图。FMSA_1的父母是嫡亲兄妹婚（first degree cousin)。FMSA_1的患者（II-4以及II-8)两个人均患有视网膜色素变性，而其他 的兄弟姐妹既未患MSA也未患视网膜色素变性。FMSA_1的II-4和11-8、以及FMSA_8的 II-6通过活检被确诊为MSA。FMSA_8的另外2名兄弟姐妹是H)患者。□表示男性，〇表示 女性，黑色表示MSA患者，灰色表示ro患者，白色表示两种病皆未患有者，黑点表示已得到 基因组DNA。MSA-C是以小脑性共济失调为主要症状的MSA，MSA-P是以帕金森病为主要症 状的MSA，F 1D表不帕金森病。
[0034] 图IB示出FMSA_1的多位点参数连锁分析。利用管道软件SNPHiTLink，通过遗传 平衡（Hardy-Weinberg)检验选择p值>0.05、就诊率（call rate) >0.95、基因分型的置 信度<0.1、对照者的少见等位基因频率（minor allele frequency) >0、以及用于连锁分 析的标记间距离为80kb到120kb的SNP。利用Allegro version 2进行多位点参数连锁分 析（具有完全外显率的常染色体隐性遗传）以及单倍体的重建。LOD值（LOD score)的最 大值为1. 93,横跨包含染色体4上的区域（NCBI36/hgl8组装（assembly)的72. 795Mb到 89. 616Mb at)、5 上的区域（149. 50Mb 到 168. 32Mb)、6 上的区域（85. 499Mb 到 87. 382Mb)、 7上的区域（62. 754Mb到64. 907Mb)、9上的区域（99. 781Mb到115. 484Mb)、以及13上的区 域（75. 849Mb到98. 253Mb)的大约80Mb的区域。
[0035] 图IC是筛选作为候选的突变的过程的说明图。通过全基因组测序共发现 3, 492, 929个SNV和得失位（indel)，其中54, 306个位于候选区域。其中，342个编码外显 子或接合区域，78个为非同义突变或剪接区域突变。其中，在dbSNP130尚未登录的新型SNV 仅有4个。
[0036] 图ID示出FMSA_1的患者（11-4。上图）以及非患病者（11-7。下图）的直接测 序的结果。患者具有M78V-V343A的纯合体。
[0037] 图2A示出C0Q2变异体的酵母互补分析（yeast complementation assay)的结果。 包含野生型（wt)人类C0Q2基因cDNA的pAUR123载体或者用mock载体转化的酵母coq2 无效突变体的增殖曲线在左侧图表示。利用包含具有各种突变的人类C0Q2的cDNA(L16V、 P22L、F29L、N336H、V343A、I97T、T267A 或 S297C)的 pAUR123 载体而转化的酵母 coq2 无 效突变体的增殖曲线在中间图表示。I97T、T267A、以及S297C与野生型C0Q2相比增殖率 低很多，但显示出比coq2无效株更高的增殖率（中度有害的突变）。L16V、P22L、F29L、 N336H、以及V343A显示出与野生型C0Q2相同水平的增殖率。利用包含具有各种突变的人类 C0Q2cDNA (P49H、S57T、R69H、M78V、M78V-V343A、P107S、SI 13F、R337X 或 R337Q)的 pAUR123 载体而转化的coq2无效突变体的增殖曲线在右侧图表示。这些与coq2无效株同样地表现 出呼吸依赖性增殖率的显著下降（非常有害的突变）。各酵母株经YH)培养基的予培养， 稀释到0D600为0. 1，置于酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖（YPG)培养基中23°C下以200转/ 分钟振摇温育（incubate) 4天。每10分钟测定一次0D600,按培养时间制作成图表。CoQ2 的活性通过测定放射性对羟基苯甲酸（Pfffi)的聚十异戊二稀（decaprenyl)PHB的掺入而求 出。
[0038] 图2B示出C〇Q2变异体的酶活性的测定结果。从具有C0Q2基因的任何一个突变 (R337Q/V343A、R337X/V343A、V343A/V343A、或者 V343A/wt)的 MSA 患者以及无突变的对照 者获得的淋巴母细胞样细胞的CoQ2活性进行测定。各对象的酶活性（pmol/mg-protein/ minute)以9次单独实验的中间值（圆柱）和标准偏差（棒状）表示。群比较是利用 Kruskal-Wallis检验进行，多重检验利用的是Steel法。对于1名对照者（野生型C0Q2基 因型）*p〈0. 05。
[0039] 图2C示出MSA患者的冷冻小脑样品的CoQlO浓度的测定结果。测定了 3名MSA 患者（1名为M78V-V343A/M78V-V343A以及2名为V343A/wt)与3名对照者（wt/wt)的冷 冻小脑样品的CoQlO浓度。将约IOOmg的脑组织在含10倍量（v/wt)的0. 32M的蔗糖、ImM 的EDTA以及20 %的SDS的IOmM TrisHCl (pH7. 4)中均质。接着，正己烷/乙醇（5:2v/v) 中抽提CoQlO,抽提物中的CoQlO浓度用HPLC测定，调整游离胆固醇浓度。
[0040] 图 3 是 Andrew J?等，The Ameri can Journal of Human Genetics 84, 558-566, May 15, 2009的图1。示出CoQlO的生物合成的简图。
[0041] 图4示出将MSA患者为对象的泛醌醇的临床试验概要（outline)。
[0042] 图5示出以各用量给予泛醌醇后的血浆CoQlO浓度（y g/ml)的测定结果。
[0043] 图6示出以各用量给予泛醌醇后的单核细胞中的全CoQlO/游离胆固醇（nM/ yM) 的测定结