ing Temperature)分型、PCR-SSOP(sequence_specific oligonucleotide probe ;PCR_ 序列特 异寡核苷酸探针）法、PCRH3HFA (preferential homoduplex formation assay ;PCR-同源 双链优先形成试验）法、PCR-RSCA (reference strand conformation assay;参考链构象分 析）法等，但是不限于这些方法。
[0090] 作为在RNA水平上检测突变的方法，例如可以使用以下方法。
[0091] (i) Northern 印迹杂交（Northern blot)法
[0092] 从来源于个体的样品通过常规方法提取mRNA，在含有乙二醛、甲酰胺、甲醛、甲基 汞等的溶液中加热，使分子内的氢键断裂，破坏构象而成为线状。然后，使用含甲醛的琼脂 糖凝胶进行电泳。将凝胶在15~20 X SSC的高碱性溶液中，转印到尼龙膜或硝酸纤维素膜。 使用硝酸纤维素膜时，在80°C真空烘烤中处理2小时，固定RNA。使用尼龙膜时，例如照射 紫外线，通过交联固定RNA。
[0093] 接着，为了鉴定滤膜上的特定的mRNA，从克隆的cDNA制作探针加入标记，将探针 与滤膜在特定条件下接触后，能够检测出只有与cDNA探针结合的mRNA。本领域技术人员可 以根据盐浓度、温度、碱基长度、组合等而适宜选择杂交条件。
[0094] 靶mRNA为微量时，还可以结合RT-PCR法。对于RNA样品，使用反转录酶和寡核苷 酸（dT)引物进行反转录反应，将获得的cDNA通过PCR进行扩增后，使用标记的互补核酸检 测 cDNA。
[0095] (ii)斑点杂交（Dot blot)法
[0096] 该方法是Northern印迹杂交法演变而来，将从个体来源的样品提取的mRNA通过 甲基氢氧化汞方法等变性后，在多种浓度下，在硝酸纤维素等的滤膜上以斑点（dot)点样， 与用放射性标记等标记的探针进行杂交，检测信号强度。虽然有可能还会检测出与探针具 有同源性的其他的mRNA、或与目的mRNA长度不同的mRNA，但是比Northern印迹杂交法更 为简便。
[0097] (iii) RNA 酶（RNase)保护试验
[0098] 该方法利用RNA酶不会分解与靶RNA完全一致而杂交的双链RNA，但如果存在错 配，则在该处酶切的原理。首先，将用 32P等标记的mRNA作为探针，与样品RNA进行杂交后， 用RNA酶消化。反应产物用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等进行电泳，测定大小。如果转 录产物与探针RNA完全互补，则会出现较大的1条条带，但是如果存在错配，则条带的大小 变小，或者出现2条以上的条带，因此能够确认是否有目的RNA。
[0099] (iv)原位杂交（in situ hybridization)
[0100] 从个体获得的样品用蛋白降解酶、盐酸等进行预处理后，为了抑制探针的非特异 性结合，用鲑鱼精DNA或白蛋白等封闭。然后，用标记物质标记的探针RNA和组织样本杂交 约24小时，随后清洗组织样本，通过放射自显影或免疫组织化学方法，检测靶位。并且，靶 mRNA为微量时，还可以使用原位RT-PCR法。使用反转录酶和寡核苷酸（dT)引物进行反转 录反应，将获得的cDNA通过PCR进行扩增后，使用标记的互补核酸检测cDNA。
[0101] (V)实时荧光定量PCR (Real-Time PCR)法
[0102] 实时荧光定量PCR法是通过荧光检测PCR扩增产物的检测方法。包括使用以 SYBR Green为代表的特异性插入到双链核酸中的荧光标记的插入法以及使用以荧光定量 (TaqMan)探针为代表的荧光标记的突变序列特异性探针的方法。利用实时荧光定量PCR法 时，也可以从样品中的RNA通过使用反转录酶获得cDNA，以此为模板。
[0103] (vi)DNA 微阵列
[0104] 除此以外，在RNA水平上的检测，也可以根据使用DNA微阵列的方法进行。从个体 的样品提取总RNA，使用固定了与多个具有突变的目的RNA分别互补的DNA的DNA微阵列， 能够一次检测出多个突变。
[0105]作为蛋白质水平的突变检测方法，例如可以举出免疫分析法（immunoassay)，该方 法使用仅与具有突变的C〇Q2和没有突变的C〇Q2中的任意个结合的不发生交叉反应的抗 体，确认是否有与抗体的结合。本领域技术人员可以根据公知的方法制备这种抗体。与抗 体的结合，可以通过公知的方法标记抗体或抗抗体而进行检测。用于标记的物质，例如可以 举出：过氧化物酶，碱性磷酸酶等酶； 1251、1311、353、311等放射性物质；异硫氰酸荧光素、若丹 明、丹磺酰氯（dansyl chloride)、藻红蛋白、四甲基异硫氰酸罗丹明、近红外荧光材料等荧 光物质；荧光素酶、荧光素、水母发光蛋白等发光物质；除此之外，金胶体、量子点等纳米粒 子。
[0106] 作为蛋白质水平的突变检测方法，还可以举出免疫印迹法（western blotting method)。从个体获得的样品用SDS等处理，破坏蛋白的高级结构使其变性后，通过 SDS-PAGE根据分子量分离蛋白。电泳结束后，将凝胶与滤膜（硝化纤维、尼龙、PVDF等）叠 加放置于转印装置，在凝胶内展开的蛋白质条带以电性转印（印迹）到滤膜上。为防止与 蛋白的非特异性吸附，进行封闭后，与特异性结合到有突变或无突变的C 〇Q2的抗体进行一 次反应。接着，将特异性识别一抗体分子的用发色酶等标记的二抗体与一抗体反应，通过二 抗体的检测，检测靶蛋白。
[0107] 并且，在本发明中，作为使CoQlO的生物合成低下的突变的检测，也可以检测CoQ2 蛋白功能的低下。
[0108] C〇Q2功能的低下，例如可以通过测定对羟基苯甲酸的异戊烯化活性的低下而确 认。如实施例的记载，可以通过用放射性物质标记PfB，检测十聚异戊二稀（decaprenyl) PHB而测定CoQ2活性。
[0109] 〔MSA风险的检测试剂盒〕
[0110] 本发明所涉及的MSA风险的检测试剂盒，包含以下（i)至（iii)中的至少一个。 (i)与包含辅酶Q2基因中的、编码从由辅酶Q2蛋白的49位、57位、69位、78位、97位、107 位、113位、267位、297位、337位以及343位构成的群中选择的位点的氨基酸的核酸的区域 杂交的核酸；
[0111] (ii)能够扩增包含辅酶Q2基因中的、编码从由辅酶Q2蛋白的49位、57位、69位、 78位、97位、107位、113位、267位、297位、337位以及343位构成的群中选择的位点的氨基 酸的核酸的区域的引物对（primer set);以及
[0112] (iii)仅与具有从由P49H、S57T、R69H、M78V、I9H\P107S、S113F、T267A、S297C、 R337Q以及R337X、V343A构成的群中选择的至少一个突变的辅酶Q2蛋白、和野生型辅酶Q2 蛋白中的任意个结合的不发生交叉反应的抗体。
[0113] 这些核酸或抗体可以用于本发明所涉及的MSA风险的检测方法。
[0114] 上述（i)核酸能够与核酸中的突变位点特异性结合而检测是否有突变。核酸例如 可以是5~100碱基长度、10~50碱基长度、15~30碱基长度等。本领域技术人员可以 根据检测序列而适宜设计核酸的序列。
[0115] 这些核酸可以被固定于固相载体。本说明书中，固相载体只要是能够固定DNA的 载体，没有特别限定，例如可以举出玻璃制、金属制、树脂制等的微量滴定板（microtiter plate)、基板、珠（bead)、硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜等。DNA可以通过公知的方法固定 于这些固相载体上。
[0116] 上述（ii)核酸可以通过PCR法特异性地扩增具有突变的核酸而检测突变。各引 物例如可以是5~100碱基长度、10~50碱基长度、15~30碱基长度等。本领域技术人 员可以根据检测序列而适宜设计引物序列。
[0117] 上述（iii)抗体可以通过与具有突变的蛋白和野生型蛋白中的任意个不发生交 叉反应地结合而检测C〇Q2蛋白的突变。本领域技术人员可以根据公知的方法而制备抗体。 抗体可以被标记，也可以固定在固相载体上。本发明所涉及的试剂盒可以根据需要而包含 抗抗体。
[0118] 另外，该抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。单克隆抗体可以如下制 备：通过从用抗原免疫的动物分离抗体产生细胞，使该细胞与骨髓瘤细胞等融合而制备杂 交瘤细胞，使单克隆抗体在该杂交瘤细胞中产生。多克隆抗体可以从用抗原免疫的动物的 血清等获得。本发明所涉及的检测试剂盒所包含的抗体还可以用荧光物质、放射性物质等 记D
[0119] 这种试剂盒例如还可以具备检测用探针，反转录酶，各种反应、检测试剂，缓冲液， 使用说明书，抗抗体等。
[0120] 〔MSA的诊断方法〕
[0121] 本发明还包括检测从个体采集的样品中的使CoQlO生物合成低下的突变的MSA诊 断方法。使CoQlO生物合成低下的突变的检测，可以按照本发明所涉及的检测方法而进行， 因此在此省略说明。
[0122] 〔MSA的预防或治疗药剂、以及预防或治疗方法〕
[0123] 本发明所涉及的MSA的治疗药剂作为有效成分而包含CoQlO。并且，本发明所涉及 的MSA的预防或治疗方法包含CoQlO给药步骤。如上所述，在部分MSA中，因参与CoQlO的 生物合成的酶的突变而导致CoQlO量减少，这与发病有关。
[0124] MSA的给药方式没有特别限定，无论口服给药，或非口服给药均可。作为非口服给 药，例如可以举出肌肉注射、静脉注射、皮下注射等注射给药，经皮给药、黏膜给药（经鼻、 口腔、眼睛、肺、阴道、直肠）给药等。
[0125] CoQlO可以直接给药，或者也可以添加药学上可接受的载体、赋形剂、添加剂等而 制成药剂。作为剂型，例如可以举出液体制剂（如注射液）、分散剂、悬浮剂、片剂、丸剂、粉 剂、栓剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、锭剂、吸入剂、软膏剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴 耳剂、巴布剂等。
[0126] 例如可以适当使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、助溶剂、着色剂、调味 剂、稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、PH调节剂、防腐剂、抗氧化剂等，根据常规方 法制备药剂。
[0127] 药剂制备时可使用的成分，例如可以举出去离子水、盐水、磷酸缓冲液、葡萄糖、甘 油、乙醇等药学上可接受的有机溶液，动植物油、乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、结晶纤维 素、羟丙基纤维素、淀粉、玉米淀粉、无水硅酸、硅酸铝镁、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、 羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、 果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、黄蓍胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘 油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、辛基十二烷基肉豆蔻酸酯、异丙基肉豆蔻酸酯、高级醇、硬 脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白等，但是不限于此。
[0128] 片剂或锭剂也可以用糖衣、胃溶性、肠溶性物质包衣。
[0129] 注射剂可以包含注射用蒸馏水、生理盐水、丙二醇、聚乙二醇、植物油、乙醇类等。 进一步地，还可以添加润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、增溶剂、助溶剂、防腐剂等。
[0130] CoQlO也可以与对MSA有效的其他的药物或治疗方法同时给药。例如，可以与目前 对症治疗中所用的药物组合。
[0131] CoQlO还对于预防MSA有效。在本发明所涉及的检测方法中被判断为高MSA风险 时，即使尚未发病，也可以通过补充CoQlO而防止发病、或者推迟发病。CoQlO还用在所谓的 保健食品，并且安全性高且副作用少，因此可以长期服用。
[0132] 当向人给予CoQlO时，给药量可以根据患者的年龄、性别、体重、敏感性差别、给药 方法、给药间隔、有效成分的种类、制剂的种类而不同，虽没有特别限定，但是例如可以将 30MG ~2000MG、40MG ~1500MG、10