] 要突变的氨基酸残基是L-丙氨酸（A)、L-天冬酰胺（N)、L-半胱氨酸（C)、L-谷 氨酰胺（Q)、L-异壳氨酸（I)、L-壳氨酸（L)、L-甲硫氨酸（M)、L-苯丙氨酸（F)、L-脯氨 酸（P)、L-丝氨酸（S)、L-苏氨酸（T)、L-色氨酸（W)、L-酪氨酸（Y)、L-缬氨酸（V)、L-天 冬氨酸（D)、L-谷氨酸（E)、L-精氨酸（R)、L-组氨酸⑶、L-赖氨酸（K)、或甘氨酸（G)，其 是天然存在的L-a-氨基酸。当突变是取代、添加或插入时，要取代、添加或插入的氨基酸 残基与要突变的氨基酸残基相同，如上文描述。在下文中，在氨基酸的描述中有时跳过L和 a〇
[0070] 甘氨酸氧化酶（gly氧化酶：有时缩写为GlyOX)是催化下述反应的氧化还原酶 (EC 1. 4. 3. 19)〇
[0071]甘氛酸+H20+02-乙酸酸+NH 3+H2〇2
[0072]源自任何生物体（例如微生物，诸如细菌，放线菌和真菌，以及昆虫，鱼类，动物和 植物）的酶可以用作衍生本发明的经修饰的酶的甘氨酸氧化酶。甘氨酸氧化酶的例子可以 包括源自属于芽孢杆菌属（Bacillus)及其相关属的生物体的酶。与芽孢杆菌属相关的属 的例子可以包括土芽孢杆菌属（Geobacillus)、类芽孢杆菌属（Paenibacillus)和海洋芽 孢杆菌属（Oceanobacillus)。与芽孢杆菌属相关的属属于芽孢杆菌科（Bacillaceae)，其 与芽孢杆菌属类似。
[0073] 属于芽孢杆菌属及其相关属的微生物的例子可以包括嗜气芽孢杆菌（Bacillus aerophilus)、錯状芽抱杆菌（Bacillus cereus)、澳门芽胞杆菌（Bacillus macauensis)、 短小芽抱杆菌（Bacillus pumilus)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、球形芽抱杆菌 (Bacillus sphaericus)、錯状芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌（Bacillus Iicheniformis)、芽抱 杆菌物种（Bacillus sp.)、嗜热脂肪土芽抱杆菌（Geobacillus stearothermophilus)、和 嗜热土芽胞杆菌（Geobacillus kaustophiIus) 〇
[0074] 优选地，在甘氨酸氧化酶中引入突变的位置是与甘氨酸氧化酶的活性中心紧密接 近定位的氨基酸残基。已经对源自枯草芽孢杆菌的甘氨酸氧化酶报告了分析三维结构的结 果（例如见I 3DB ID:ING3、ING4、1RYI、3IF9)。本领域技术人员可以比对源自枯草芽孢杆菌 的甘氨酸氧化酶的氨基酸序列与另一种甘氨酸氧化酶的氨基酸序列，并且如此可以容易地 规定与源自除枯草芽孢杆菌外的生物体的甘氨酸氧化酶的活性中心紧密接近定位的氨基 酸残基。
[0075] 在一个优选的实施方案中，改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变是 野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中TTS基序中的第一苏氨酸（T)和/或丝氨酸（S)的取 代。TTS基序由苏氨酸（T)-苏氨酸（T)-丝氨酸（S)的连续三个氨基酸残基构成。在TTS 基序的C端的苏氨酸残基有时称为第一苏氨酸，并且在TTS基序的中心位置处的苏氨酸残 基有时称为第二个苏氨酸。野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的TTS基序的位置可以随 着酶的起源而不同。然而，本领域技术人员可以适当确定野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序 列中的TTS基序的位置，并且如此可以规定要取代的第一苏氨酸（T)和丝氨酸（S)的位置。 一般地，在野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中，TTS基序位于42至44位的氨基酸区域内， 并且第一苏氨酸（T)和丝氨酸（S)分别位于42和44位（见例如表1)。
[0076] 表1 :甘氨酸氧化酶中的TTS基序中的第一（T)的位置
[0078] 在另一个优选的实施方案中，改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变 是野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的HCY基序中的半胱氨酸（C)取代。HCY基序由组 氨酸（H)-半胱氨酸（C)-酪氨酸（Y)的连续三个氨基酸残基构成。野生型甘氨酸氧化酶 的氨基酸序列中的HCY基序的位置可以随着酶的起源而不同。然而，本领域技术人员可以 适当确定野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的HCY基序的位置，并且如此可以规定要取 代的半胱氨酸（C)的位置。一般地，在野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中，HCY基序位于 244至252位的氨基酸区域内，并且半胱氨酸（C)位于245至251的位置（参见例如表2)。 在HCY基序中的半胱氨酸（C)取代外，本发明的经修饰的酶可以进一步具有TTS基序中的 第一苏氨酸（T)的上述取代，作为改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变。 [0079]表2 :甘氨酸氧化酶中的HCY基序中的半胱氨酸（C)位置
[0081] 在又一个优选的实施方案中，改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变 是野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的LRP基序中的亮氨酸（L)取代。LRP基序由亮氨 酸（L)-精氨酸（R)-脯氨酸（P)的连续三个氨基酸残基构成。野生型甘氨酸氧化酶的氨基 酸序列中的HCY基序的位置可以随着酶的起源而不同。然而，本领域技术人员可以适当确 定野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的LRP基序的位置，并且如此可以规定要取代的亮 氨酸（L)的位置。一般地，在野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中，LRP基序位于294至316 位的氨基酸区域内，并且亮氨酸（L)位于294至314的位置（参见例如表3)。在LRP基序 中的亮氨酸（L)取代外，本发明的经修饰的酶可以进一步具有TTS基序中的第一苏氨酸（T) 的上述取代和/或HCY基序中的半胱氨酸（C)的上述取代，作为改善与甘氨酸测量有关的 甘氨酸氧化酶特性的突变。
[0082] 表3 :甘氨酸氧化酶中的LRP基序中的亮氨酸（Leu)位置
[0083]
[0084] 在又一个优选的实施方案中，改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变 是野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的GML基序中的甲硫氨酸（M)取代。GML基序由甘 氨酸（G)-甲硫氨酸（M)-亮氨酸（L)的连续三个氨基酸残基构成。野生型甘氨酸氧化酶 的氨基酸序列中的GML基序的位置可以随着酶的起源而不同。然而，本领域技术人员可以 适当确定野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的GML基序的位置，并且如此可以规定要取 代的甲硫氨酸（M)的位置。一般地，在野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中，GML基序位于 45至59位的氨基酸区域内，并且甲硫氨酸（M)位于46至58的位置（参见例如表4)。在 GML基序中的甲硫氨酸（M)取代外，本发明的经修饰的酶可以进一步具有TTS基序中的第 一苏氨酸（T)和丝氨酸（S)的上述取代和/或HCY基序中的半胱氨酸（C)的上述取代和/ 或LRP基序中的亮氨酸（L)的上述取代，作为改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性 的突变。
[0085] 表4 :甘氨酸氧化酶中的GML基序中的甲硫氨酸（M)的位置
[0087] 在又一个优选的实施方案中，改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变 是野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的SG基序中的丝氨酸（S)取代。SG基序由丝氨酸 (S)-甘氨酸（G)的连续两个氨基酸残基构成。野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的SG 基序的位置可以随着酶的起源而不同。然而，本领域技术人员可以适当确定野生型甘氨酸 氧化酶的氨基酸序列中的SG基序的位置，并且如此可以规定要取代的丝氨酸（S)的位置。 一般地，在野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中，SG基序位于190至204位的氨基酸区域 内，并且丝氨酸（S)位于190至203的位置（参见例如表5)。在SG基序中的丝氨酸（S)取 代外，本发明的经修饰的酶可以进一步具有TTS基序中的第一苏氨酸（T)和丝氨酸（S)的 上述取代和/或HCY基序中的半胱氨酸（C)的上述取代和/或LRP基序中的亮氨酸（L)的 上述取代和/或GML基序中的甲硫氨酸（M)的上述取代，作为改善与甘氨酸测量有关的甘 氨酸氧化酶特性的突变。
[0088] 表5 :甘氨酸氧化酶中的SG基序中的丝氨酸（S)的位置
[0090] 在又一个优选的实施方案中，改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变 是野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的PGT基序中的甘氨酸（G)取代。PGT基序由脯氨 酸（P)-甘氨酸（G)-苏氨酸（T)的连续三个氨基酸残基构成。野生型甘氨酸氧化酶的氨基 酸序列中的PGT基序的位置可以随着酶的起源而不同。然而，本领域技术人员可以适当确 定野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的PGT基序的位置，并且如此可以规定要取代的甘 氨酸（G)的位置。一般地，在野生型甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中，PGT基序位于303至317 位的氨基酸区域内，并且甘氨酸（G)位于304至316的位置（参见例如表6)。在PGT基序 中的甘氨酸（G)取代外，本发明的经修饰的酶可以进一步具有TTS基序中的第一苏氨酸（T) 和丝氨酸（S)的上述取代和/或HCY基序中的半胱氨酸（C)的上述取代和/或LRP基序中 的亮氨酸（L)的上述取代和/或GML基序中的甲硫氨酸（M)的上述取代和/或SG基序中 的丝氨酸（S)的上述取代，作为改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性的突变。
[0091] 表6 :甘氨酸氧化酶中的PGT基序在的甘氨酸（G)的位置
[0094] 可以通过对具有一种或多种自前述6种基序选择的基序的野生型酶引入一种或 多种突变产生本发明的经修饰的酶。野生型酶可以具有选自前述6种基序的2种基序、3种 基序、4种基序、5种基序或6种基序。
[0095]与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶的特性可以包括下列各项：
[0096] (a)甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性；
[0097] (b)甘氨酸氧化酶的热稳定性；和
[0098] (C)甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。
[0099] 本发明的经修饰的酶可以仅具有前述特性之一，或者可以具有组合的两种或三种 前述特性。
[0100] 对于TTS基序中的第一苏氨酸（T)，改善至少一种自特性（a)至（c)选择的特性的 突变（单独或与另一种/些突变组合的单一突变）的例子可以包括用丙氨酸（A)、丝氨酸 (S)、半胱氨酸（C)或甘氨酸（G)取代。
[0101] 对于TTS基序中的丝氨酸（S)，改善至少一种自特性（a)至（C)选择的特性的突变 (单独或与另一种/些突变组合的单一突变）的例子可以包括用赖氨酸（K)取代。
[0102] 对于HCY基序中的半胱氨酸（C)，改善至少一种自特性（a)至（c)选择的特性的突 变（单独或与另一种/些突变组合的单一突变）的例子可以包括用丙氨酸（A)、天冬氨酸 (D)、甘氨酸（G)、组氨酸（H)、天冬酰胺（N)、色氨酸（W)、酪氨酸（Y)或丝氨酸（S)取代。
[0103] 对于LRP基序中的亮氨酸（L)，改善至少一种自特性（a)至（c)选择的特性的突变 (单独或与另一种/些突变组合的单一突变）的例子可以包括用异亮氨酸（I)、缬氨酸（V)、 半胱氨酸（C)、苏氨酸（T)、或脯氨酸（P)取代。
[0104] 对于GML基序中的甲硫氨酸（M)，改善至少一种自特性（a)至（c)选择的特性的突 变（单独或与另一种/些突变组合的单一突变）的例子可以包括用异亮氨酸（I)取代。
[0105]对于SG基序中的丝氨酸（S)，改善至少一种自特性（a)至（c)选择的特性的突变 (单独或与另一种/些突变组合的单一突变）的例子可以包括用精氨酸（R)取代。
[0106] 对于PGT基序中的甘氨酸（G)，改善至少一种自特性（a)至（c)选择的特性的突 变（单独或与另一种/些突变组合的单一突变）的例子可以包括用酪氨酸（Y)或谷氨酰胺 (Q)取代。
[0107] 在一个实施方案中，改善甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性作为与甘氨酸测量有关的 甘氨酸氧化酶的特性。甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性改善意味着相对于野生型酶对甘氨酸 的活性，经修饰的酶对甘氨酸的活性增强。特别地，在下述情况中可以实现甘氨酸氧化酶对 甘氨酸的活性的改善：当野生型甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性在预先确定的浓度时（在低 或高浓度时）视为100时，在相同浓度时经修饰的甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性高于100。 此类经修饰的酶实现以高灵敏性快速测量甘氨酸，因此可用于测量甘氨酸。相对于野生型 酶的活性，经修饰的酶的活性的增强水平优选是1. 3倍或更多，更优选1. 5倍或更多，仍更 优选1. 7倍或更多，且特