葡萄糖异构化的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及葡萄糖异构化的方法及在果糖和葡萄糖的混合物中富集果糖的方法。
【背景技术】
[0002] D-葡萄糖在多种生物聚合物在中大量存在，该生物聚合物是再生原材料的一部 分。其示例为淀粉（如玉米淀粉）或纤维素（木质纤维素生物质的纤维素）。
[0003] 将D-葡萄糖转化为D-果糖的常见可能性是通过采用适当的D-葡萄糖异构酶（如 D-木糖异构酶）进行的，该D-葡萄糖异构酶接受D-葡萄糖作为底物。这样的方法已经知 晓很长一段时间（如从US2950228)且仍然适合工业使用，例如在US3616221或US386830 中所描述的。
[0004] 该方法所伴随的一个问题是通常最多大约42%的D-葡萄糖能够被转化为D-果 糖。D-果糖对D-葡萄糖的进一步富集只有通过分离方法才可实现。因此一种可能性是采 用色谱法，如描述在US5221478中的示例。食品行业通常只追求部分富集D-果糖。特别地， 用于生产相对较纯到高纯度D-果糖的色谱法是相当费力的。
[0005] 除了使用异构酶之外，文献还描述了对碳水化合物进行酶促氧化还原反应。
[0006] 例如，DE69839381描述了用于将D-山梨醇转化成L-山梨醇且可用于产生抗坏血 酸生的山梨醇脱氢酶。
[0007] DE10247147描述了一种通过采用D-甘露糖醇-2-脱氢酶将D-果糖还原成D-甘 露糖醇的方法。
[0008] US4467033描述了将L-山梨醇酶促氧化成L-果糖。
[0009] 将D-木糖还原成木糖醇的示例为，例如US20060035353或Woodyer R.等人.，在 FEBS J.，2005, 272卷，3816-3827页中所描述的内容。
[0010] 已经表明，可以采用适当的木糖还原酶将D-葡萄糖还原为D-山梨醇（如Wang X?等人?，Biotechnol. Lett.，2007, 29 卷，1409-1412 页）。
[0011] 糖氧化还原酶（如山梨糖醇脱氢酶）还用于诊断目的（如DE60006330)。
[0012] 这些方法是单独的氧化还原反应，其中发生还原反应或发生氧化反应以形成每个 产物。在工业过程中，酶催化氧化还原反应，例如用于产生手性醇、Q-氨基酸和Q-羟基 酸。目前已知的工业过程通常采用用于产品合成的氧化还原酶，以及任选地另一种用于再 生辅酶因子的酶。与此形成对比的方法是在产物形成过程中涉及的两个以上酶促氧化还 原反应以及辅酶因子再生所必需的任何酶促反应是在一个反应批次中进行的（同时或相 继），无需分离任何中间物。近来，这种酶促级联反应-这里被称为一锅反应-已经吸引了 大量关注，因为它们能有效降低操作成本、操作时间和对环境的影响。此外，氧化还原的酶 促级联反应允许利用经典化学方法不易实施转化的发生。
[0013] 描述了一种尝试，其中以前手性酮作为中间体并利用一锅体系实现了仲醇的外消 旋体的去消旋化（J. Am. Chem. Soc.，2008, 130卷，13969-13972页）。通过两个具有不同的 辅酶因子特异性的醇脱氢酶（S-和R-特性）实现了仲醇的去消旋化。这种方法的缺点是 所使用的底物具有非常低浓度0. 2-0. 5%，不适于工业用途。
[0014] 在WO 2009/121785描述了另一个一锅体系，其中光学活性仲醇的立体异构体被 氧化成酮，然后被还原成相应的旋光对映体，且其中使用了两种具有相反的立体选择性和 不同的辅酶因子特异性的醇脱氢酶。辅酶因子利用所谓的"杂交转化体系"只采用一个额 外的酶进行再生。为了再生辅酶因子，使用了不同的酶，如甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸 脱氢酶。这种方法的缺点是所用底物的低浓度。
[0015] 相比之下，知晓许多个体酶促氧化还原反应。生产手性羟基化合物的示例性应用 是基于相应的前手性酮化合物。在这种方法中，通过额外的酶对辅酶因子进行再生。所有 这些方法的共同点是它们代表孤立的还原反应并再生NAD (P)H(参见如EPl 152054)。
[0016] 酶法生产手性化合物、富集的对映体化合物、有机化合物（例如醇类或氨基酸类） 的其他示例已被描述（Organic Letters, 2003, 5 卷，3649-3650 H;US7163815;Biochem. Eng. J. ,2008,39(2)卷，319-327页；EP1285962)。在这些体系中，来自于短乳杆菌或旧金 山乳酸菌的NAD (P) H-依赖性氧化酶被用作辅酶因子再生酶。这些尝试也代表用于形成产 品的个体反应。
[0017] 如上所述的单独进行的氧化反应或还原反应缺乏一锅反应的优势，如通过减少时 间和材料的效率。
[0018] 例如，根据在US4895601或US504708中所描述的方法从水溶液中分离果糖是有可 能的。
[0019] 至今已知的所有方法具有不同的缺点，例如底物的初始浓度较低，总收益率较低。
【发明内容】
[0020] 令人惊奇的是，现在已经发现了在葡萄糖向果糖的异构化过程中实现更好富集果 糖的可能性。
[0021] -方面，本发明提供了一种通过将葡萄糖还原成山梨糖醇并继而氧化成果糖而对 葡萄糖进行异构化的方法，其特征在于葡萄糖和果糖的混合物被用作起始材料，在所述方 法中氧化还原辅酶因子NAD7NADH和NADP7NADPH在一锅反应中再生，其中所述两个氧化 还原辅酶因子中的一个得到的是其还原形式，另一个氧化还原辅酶因子得到的是其氧化形 式，因为在相同的反应批次中发生至少两个额外的酶催化的氧化还原反应（产品形成反 应），其中
[0022] a)在将所述还原型辅酶因子转化回其原来的氧化形式的再生反应中，氧气或通式 I的化合物被还原，
[0024] 其中札是直链或支链的（CV4)-烷基基团或（Cq)-羧烷基基团，以及
[0025] b)在将所述氧化型辅酶因子转化回其原来的还原形式的再生反应中，（C4_ s)环烷 醇或通式II的化合物被氧化，
[0027] 其中私和R3各自独立地选自由氢、直链或支链的（C 〇)烷基、直链或支链并含有 一个到三个双键的（C26)烯基，芳基、特别是（C6- 12)芳基），羧基或（C1-O羧烷基，特别是环 烷基、如（C3_ s)环烷基组成的组。
[0028] 根据本发明提供的方法在本文中也被称作"根据本发明的方法"或"本发明的方 法"。
[0029] 另一方面，本发明提供了一种根据本发明的方法，其中a)中通式I的化合物被还 原，其中R 1是取代或未取代的（Cq)烷基基团，以及b)中通式II的化合物被氧化，其中R2 和R3独立地选自由氢，直链或支链的（C^6)烷基，直链或支链并任选地含有多达三个双键 的（C 26)烯基环烷基、特别是（C3_s)环烷基，芳基、特别是（C6_ 12)芳基，（Cf4)羧烷基组成 的组，如果化合物I是丙酮酸盐，任选地私和R 3还为羧基。
[0030] 另一方面，在根据本发明的一种方法中，私和1?3独立地选自由氢、直链或支链的 (C^ 6)烷基、直链或支链并含有一个到三个双键的（C2 6)烯基、芳基（特别是（C6_12)芳基）、 羧基或（C1-O羧烷基组成的组。在一个具体的方面，根据本发明的反应按照以下反应方案 1进行：
[0031] 反应方案1
[0033] 与现有技术状态相比，根据本发明的方法表现出将化合物酶促氧化或还原的方法 的显著改进，因为该方法允许在一个反应批次中进行所述必要的氧化反应和还原反应以及 所述相应的辅酶因子再生的反应，并同时允许使用比根据现有技术显著较高的底物浓度。
[0034] 在根据本发明的方法中，使用了所述辅酶因子NADH和NADPH，在此，NAD+代表烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸的氧化形式及NADH代表烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原形式，而NADP +代 表烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化形式及NADPH代表烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的还 原形式。
[0035] 在本文中，术语"氧化反应"和"还原反应"代表那些不属于辅因子再生的一部分 且不涉及在根据本发明的方法中形成产品的酶催化氧化还原反应。"氧化反应"和"还原反 应"共同地被称为"产品形成反应"。在根据本发明的方法中的所述产品形成反应的每个反 应包括至少一个氧化反应和至少一个还原反应。
[0036] 如果NAD+用作所述氧化反应的辅酶因子，那么NADPH是所述还原反应的辅酶因 子。如果NADP +用作所述氧化反应的辅酶因子，那么NADH是所述还原反应的辅酶因子。
[0037] 在根据本发明的方法中，氧化反应和还原反应可以在相同反应批次中并行进行或 不并行发生，即相继发生。
[0038] 在本文中，底物指的是那些用来以形成产物为目标的化合物。在本文中，共底物指 的是那些在辅酶因子再生过程中被转化的化合物。
[0039] 在根据本发明的方法中，使用几种底物（即葡萄糖和山梨糖醇）。在此，在相同的 底物（分子骨架）上发生还原反应和/或氧化反应。另外，在根据本发明的方法中，在分子 骨架的不同位置的两个不同官能基团上发生还原反应和氧化反应。
[0040] 在本文中，"一锅反应"指的是一种方法，在该方法中，在一个反应批次中发生涉及 产品形成和用于辅酶因子再生的两个酶促体系的两个以上氧化还原反应，而不需要分离中 间体中间体。
[0041] 本文中提及的酸或酸性盐包括没有说明的相应的其他术语。同样，在本文中提及 的酸包括所有由此派生的酯类。另外，（部分地）带有保护基团的化合物包括在提及的潜 在物质中。
[0042] 在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的方法的特征在于氧化反应和还原 反应并行发生。
[0043] 在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的方法的特征在于在同一分子骨架 上发生氧化反应和还原反应。
[0044] 在本发明的一个优选实施方案中，根据