试验方法和系统的制作方法
【专利说明】试验方法和系统
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2012年8月16日提交的美国临时专利申请号61/684, 104的优先权 和权益，该专利申请的说明书通过引用全文纳入本文。
[0003] 关于联邦资助研究的声明
[0004] 本发明是在美国国土安全部第HSHQDC-10-C-00053号基金资助下进行。政府享有 本发明的某些权利。
[0005] 发明背景
[0006] 已开发了多种不同方法用于检测样品混合物中是否存在给定的核酸序列。这些方 法被用于诊断、研究工具、病原体检测的目的和多种其他应用。已证明在鉴定给定靶核酸序 列是否存在方面高度有用（特别是预期这类靶标的拷贝数目较低时）的一种方法是实时聚 合酶链式反应，或实时PCR。
[0007] 实时PCR常规用于对生物样品中感兴趣核酸的检测。实时PCR的综述参见，例如M Tevfik Dorak(编）（2006) Real-time PCR(Advanced Methods)(《实时 PCR(高级方法）》）， TF 公司（Taylor&Francis)，第一版ISBN-10:041537734X ISBN-13:978-0415377348， 和 Logan 等（编）（2009)Real_Time PCR:Current Technology and Applications(《实 时PCR:新编技术和应用》），凯斯特学术出版社（Caister Academic Press)，第一版 ISBN10:1904455395, ISBN-13:978-1904455394。其他细节还可参见例如 Gelfand 等， "Homogeneous Assay System Using The Nuclease Activity of A Nucleic Acid Polymerase (使用核酸聚合酶的核酸酶活性的均匀分析系统）"USPN 5, 210, 015 ;Leone等， (1995) "Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA(分子信标探针与NASBA扩增的结合能均勾实时 检测 RNA)" Nucleic Acids Res. 26:2150-2155;以及 Tyagi 和 Kramer (1996) "Molecular beacons:probes that fluoresce upon hybridization(分子信标：杂交时发焚光的探 针）'Mature Biotechnology 14:303-308。传统上，用于在单一反应容器（如多孔板的孔） 中检测多于一种靶核酸/样品的单孔多重技术（multiplexing)利用对各扩增子具有特异 性的自淬灭PCR探针（诸如TAQMAN?或分子信标探针）来实现。在与溶液中的扩增子结合 后，或在PCR过程中的探针降解后，所述探针不淬灭（unquench)，生成可检测信号。所述探 针用不同波长的荧光团标记，使得能在单个"单罐式"反应中实现多至约5个靶标的多重化 能力。由于实际光谱范围和标记物发射的限制，很难实现超过约5个探针/反应。这严重 限制了单一反应的多重化，进而严重限制了每个样品能被筛选的靶标数量，并提高了检测 多种感兴趣靶标的试剂成本和设备复杂性。
[0008] 核酸阵列代表另一种多重化检测扩增产物的方法。最常见地，对样品进行扩增反 应，然后在核酸阵列上分别检测扩增子。例如Sorge"Methods for Detection of a Target Nucleic Acid Using A Probe Comprising Secondary Structure (使用包含二级结构探针 检测靶核酸的方法）" USPN 6, 350, 580提出了通过从扩增混合物中纯化探针来捕获扩增后 释放的探针然后检测探针。这种生成和检测扩增子的多步法使对于扩增混合物的实时分析 变得不切实际。
[0009] 还提出了多种在存在捕获核酸的情况下扩增反应物的方法。例如，Kleiber等 "Integrated Method and System for Amplifying And Detecting Nucleic Acids (扩增 和检测核酸的综合方法与系统）" USPN 6, 270, 965提出了通过渐消式（evanescence)诱 发焚光来检测扩增子。相似地，Alexandre 等"Identification and Quantification of a Plurality of Biological (Micro) Organisms or Their Components (多种（微）生物 体或其成分的鉴定和定量）"USPN 7, 829, 313,提出了在阵列上检测扩增子。在另一个示 例中，通过检测作为扩增结果生成的探针片段来检测靶多核苷酸，所述检测是例如通过结 合至电极，然后进行电化学检测。参见，例如Aivazachvilli等，"Detection of Nucleic Acid Amplification (核酸扩增的检测）"美国公布号 2007/0099211 ;Aivazachvilli 等， "Systems and Methods for Detecting Nucleic Acids (检测核酸的系统和方法）"美 国公布号 2008/0193940,和 Scaboo 等，"Methods And Systems for Detecting Nucleic Acids (检测核酸的方法和系统）"美国公布号2008/0241838。
[0010] 所有这些方法均存在限制其用于多重靶核酸检测的实践限制。例如Kleiber (USPN 6, 270, 965)依靠渐消式诱发荧光以检测阵列表面处的扩增子的荧光，并且需要复杂和昂 贵的光学元件和阵列。Alexandre (USPN7, 829, 313)提出在阵列上检测扩增子；如Kleiber 所述，这显著增加了阵列成本，因为必须个体化设计各阵列以检测各扩增子。实践中，对于 阵列上的不同扩增子可能难以实现相似的杂交动力学，特别是当扩增子相对较大时，正如 Alexandre中所述。另外，对于如何在其中有同样包含高水平信号背景的伴随溶液相的阵列 上或者在原位热循环中保持稳定的阵列上检测信号，本领域几乎没有提供指导。
[0011] 本发明克服了本领域中这些问题和其他问题。通过通读以下内容可以更完整地理 解本发明。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明提供了新颖的阵列方法和系统，以及这类方法和系统中使用的装置、试剂 和反应混合物。在至少一个方面，本发明提供了一种检测样品中是否存在至少一种第一靶 核酸序列（并可选地定量其增量）的方法。该方法包括对样品进行扩增反应，所述扩增反 应能够在至少一种第一核酸探针组存在的情况下扩增靶核酸序列。该第一探针组包含含有 与其连接的荧光团的捕获探针、与捕获探针的至少一部分和靶核酸序列的至少一部分互补 的靶标特异性核酸探针，且该靶标特异性探针包含与其连接的淬灭剂，从而使淬灭剂在该 靶标特异性探针与捕获探针杂交时淬灭来自荧光团的荧光。该方法还包括在一个或多个聚 合酶链式反应循环后检测来自样品的荧光，荧光的增加表明靶核酸序列的存在和/或其含 量增加。
[0014] 相应地，本发明还包括一种反应混合物，其包含含有一种或多种感兴趣的靶核酸 的样品、用于扩增感兴趣靶核酸序列的扩增试剂和至少一种第一探针组，所述第一探针组 包含含有与其连接的荧光团的捕获探针以及与捕获探针的至少一部分和靶核酸序列的至 少一部分互补的靶标特异性核酸探针，且所述靶标特异性核酸探针包含与其连接的淬灭 剂。淬灭剂与探针连接，从而使淬灭剂在靶标特异性探针与捕获探针杂交时淬灭来自荧光 团的荧光。
[0015] 本发明还包括一种反应腔室，其包含反应区域，所述反应区域中放置有含有一种 或多种感兴趣的靶核酸的样品、用于扩增靶核酸序列的扩增试剂和至少一种第一探针组， 所述第一探针组包含含有与其连接的荧光团的捕获探针以及与捕获探针的至少一部分和 靶核酸序列的至少一部分互补的靶标特异性核酸探针，且该靶标特异性探针包含与其连接 的淬灭剂，从而使淬灭剂在该靶标特异性探针与捕获探针杂交时淬灭来自荧光团的荧光。
[0016] 本发明还包括本发明的方法/装置的实施方式中使用的扩增引物和靶探针。例 如，本发明包括用于特异性检测天花病毒的引物和探针（例如从可能包含混合的痘病毒内 容物的样品中检测）。这类引物和探针包括VAR-I探针、VAR-2探针、VAR-3探针、VAR-4探 针、VAR-I 引物 1、VAR-I 引物 2、VAR-2 引物 1、VAR-2 引物 2 ;VAR-3 引物 1、VAR-3 引物 2、 VAR-4引物1和VAR-4引物2。
[0017] 附图简述
[0018] 图1显示本发明的试验方法的示意图。
[0019] 图2提供用于根据本发明进行扩增和检测反应的反应/检测腔室装置的示意图。
[0020] 图3显/」、/」、例性9?光检测系统的不意图〇
[0021] 图4显示用于根据本发明进行扩增和检测反应的替代性流动相试验系统的示意 图。
[0022] 图5显示在对10个不同靶标特异的所有引物和探针存在的情况下10000个拷贝 的MS2靶标的扩增结果。
[0023] 图6显示使用本发明的试验对MS2靶标浓度进行滴定的结果。
[0024] 图7显示在带标记的靶标特异性探针序列和未带标记的捕获探针存在的情况下1 百万个拷贝的F1UA/H3靶核酸序列的扩增结果。
【具体实施方式】
[0025] 在进一步详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文所述的特定装置或生 物系统，因为它们当然可能变化。还应当理解本文所使用的术语仅为了描述特定的实施方 式而不是限制性的。在本说明书和权利要求书中所用的单数形式"一个"，"一种"和"该"包 括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。因此，例如，关于本文所讨论的耗材腔室的"一 个表面"，任选地包含两个或多个表面的结合等。
[0026] 除非另有限定，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域技术人员的 通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发 明，但下面描述了优选的方法和材料。在说明和要求保护本发明的过程中，将依据以下定义 使用以下术语。
[0027] 本发明一般涉及使用基于实时PCR的检测方法检测样品材料中靶核酸的方法和 系统。本发明受益于提供比现有方法更大的多重性和更低的信号背景水平的能力。
[0028] 上述多重性问题的极佳方法参见同为申请人所有的美国专利申请号13/399, 872， 其通过引用全文纳入本文以用于全部目的。简言之，在这类方法中，提供了一种探针，其具 有与靶序列互补的第一部分和不与靶序列互补的第二带标记的折翼（flap)部分。该带标 记的折翼部分在扩增靶序列后被释放并被固体支持物（例如基材表面）上提供的互补捕获 探针序列捕获。固体支持物的表面上带标记的折翼部分的累积表明靶序列存在且正被扩 增。通过针对不同待测试靶序列使用不同折翼部分序列，并通过将与那些折翼部分序列互 补的不同捕获探针排列在基材上的不同位置，可以通过单个扩增反应过程有效地检测单个 样品中是否存在多种不同的靶序列。此外，由于带标记的折翼部分无需与靶标杂交，其序列 可基于所需捕获探针序列或基材上的序列进行选择。结果是，可使用通用捕获探针或捕获 探针组来测得任何靶序列。
[0029] 本发明对这些方法提供了进一步改进，使得信号生成增强且背景信号水平下降。 具体而言，本发明的方法使用了第一靶标特异性核酸探针组，它们与感兴趣的靶核酸序列 的至少一部分互补。这些靶标特异性探针还包含与靶标特异性探针的某部分相连的淬灭剂 基团。这些方法还使用了第二核酸捕获探针组，它们与靶标特异性探针互补。这些捕获探 针还包含与捕获探针上某位置相连的荧光团，使得两条探针杂交在一起时该荧光团被靶标 特异性探针上的淬灭剂基团淬灭，并能对荧光团进行适当激发光照。结果是，来自未杂交捕 获探针的荧光信号将显著大于来自靶标特异性探针-捕获探针杂交体的荧光信号。
[0030] 在本发明的方法中，对于待分析其中是否存在靶核酸序列的样品材料，在靶标特 异性核酸探针和带标记的捕获探针的存在下对其进行扩增。如本文详述的那样，本发明的 方法还包括通过使用多个靶标特异性探针和空间分离的多个捕获探针（如探针阵列）来检 测样品内的多个靶核酸序列。如本文中所用，扩增指反复复制感兴趣的靶序列以增加靶核 酸分子的总数。多种不同扩增方法是本领域熟知的，包括聚合酶链式反应（PCR)和连接酶 链式反应（LCR)。
[0031] 在特别优选的方面中，在PCR反应中扩增靶序列。简言之，PCR扩增方法使用两 条引物序列，它们在靶序列上游与包含感兴趣靶序列的核酸的反向平行链（anteparallel strand)互补并起始这些反向平行链扩增，使得引物延伸会复制包含靶序列及其互补序列 的核酸序列。该反应涉及反应混合物的重复热循环以使含靶序列的互补链解链，使引物退 火至分离的链，使用聚合酶对那些引物进行延伸，并重复这些循环以使复制的链解链并基 于这些复制链产生更多拷贝。该反复复制过程的结果是，靶核酸以指数形式复制，例如一个 靶标经复制产生两个拷贝，后者经复制产生四个拷贝等。
[0032] 在本发明使用的扩增过程期间，每次扩增循环都减少了靶标特异性探针分子可用 于结合并淬灭带标记的捕获探针的含量。该可用靶标特异性探针的减少的原因可以下一种 或多种：由于扩增样品中靶序列的数目增加而固定靶标特异性探针，或在扩增期间消化靶 标特异性探针。
[0033] 在实时PCR反应中，对含有感兴趣的靶序列的样品进行PCR反应，该PCR反应经设 计以扩增感兴趣的靶序列，例如在靶标特异性探针和捕获探针都存在的情况下使用引物结 合靶标的两条反向平行链的上游序列。例如，在使用具备固有外切核酸酶活性的聚合酶时， 在扩增过程期间可通过该外切核酸酶活性消化与靶序列杂交的任何靶标特异性探针。在多 个扩增循环后，反应混合物中靶标特异性探针的含量将显著下降，且更少的捕获探针上的 荧光团被淬灭，导致荧光信号随靶序列扩增而增加。通过在一个或多个扩增循环后观察来 自反应的荧光，可鉴定是否存在靶序列。类似地，如下文更详细讨论的那样，通过观察不同 扩增循环数后的荧光增加，甚至可以定量起始材料中靶标的含量。
[0034] 图1示意性地显示了本发明的反应过程。如图所示，捕获探针组102中各探针携 带相连的荧光部分或荧光团（F)，其被固定在基材表面104上。虽然捕获探针优选结合基材 表面以便于解调和多重化，但如下文更详细讨论的那样，与基材的结合并非本发明的方法 下信号生成或检测所必需。还提供了靶标特异性探针106,其与捕获探针102和感兴趣的靶 核酸序列互补。这些靶标特异性探针包含相连的淬灭剂部分（Q)。选择捕获探针102上荧 光团F和靶标特异性探针106上淬灭剂Q的位置，使得在探针102和106杂交在一起时，淬 灭剂Q位于与荧光团F足够近的距离内，从而在另行经受激发光照时淬灭荧光团的荧光。
[0035] 随后使上述探针接触可能含有感兴趣的靶核酸（如靶序列108)的样品材料，并使 用聚合酶对靶序列进行PCR反应，所述聚合酶包含例如固有的外切核酸酶活性。PCR过程包 括多个反复的解链、退火和延伸反应步骤，导致适当引物110跨靶序列108的延伸。在各退 火步骤期间，至少一些靶