标特异性探针106会退火至靶序列108。由于延伸反应期间由聚合 酶对靶序列进行复制，聚合酶的外切核酸酶活性会消化与靶标杂交的靶标特异性探针106， 避免其与捕获探针102杂交，从而使与捕获探针相连的荧光团解除淬灭。
[0036] 虽然在优选的方面中，本发明的方法应用的PCR反应使用具有固有外切核酸酶活 性的聚合酶，如上文所述，但这类活性不是感兴趣的靶序列在扩增后的信号生成所需要的。 具体而言，对于靶标特异性探针与捕获探针或靶序列的结合而言，在给定的反应混合物中 会存在平衡。由于PCR反应期间靶序列被扩增，该平衡会朝更多的靶标特异性探针与靶标 结合、而非结合并淬灭带标记的捕获探针的方向移动。结果是，该扩增导致荧光信号增加。
[0037] 应理解，对于具有或不具有外切核酸酶活性的方法，扩增反应过程中反应的敏感 性将取决于（至少部分取决于）靶标特异性探针和捕获探针的相对浓度。例如，并如上文所 述，预期靶标特异性探针在与样品中任何靶标杂交和与捕获探针杂交之间的存在平衡，导 致一些带标记的捕获探针可能处于未杂交且未淬灭的状态。当靶序列的拷贝数对于靶标特 异性探针的拷贝数相对较低时（情况通常如此），预期其影响不显著。通常，扩增期间生成 的靶标的量可多至允许起始靶标浓度远低于任何可测量效果。在靶标拷贝数显著更高时， 会由于固定靶标特异性探针而提高起始的背景荧光水平。在这类情况下，需要提供更高浓 度的靶标特异性探针以抵消该效果。可基于靶序列的拷贝数调节靶标特异性探针的确切浓 度以降低基线。
[0038] 或者，可以两种、三种或更多种浓度或捕获效率提供捕获探针区域，从而对捕获进 行优化调节以使其对跨扩增循环前后的浓度范围敏感。因此，对于任何给定的扩增反应，可 选择适当的阵列区域，例如具有优化的捕获效率。
[0039] 如上文所述，在优选的方面中，以固定在固体支持物上的方式提供捕获探针。捕获 探针的固定提供了集中捕获探针相关信号的便捷机制，例如可使用标准荧光检测技术解调 的表面。此外，可将多个不同的捕获探针（即具有不同的核酸序列）排列在表面上，其中各 不同的捕获探针序列提供于离散的位置中，从而可以使用单个阵列在单个反应过程中检测 多个不同靶序列。具体而言，在存在捕获探针阵列的情况下，使多个不同靶标特异性探针序 列接触可能含有一种或多种不同靶序列的样品，其中阵列中各位点包含与某一不同靶标特 异性探针互补的捕获探针。扩增后，存在的那些靶序列会导致与其相连的靶标特异性探针 消化，其继而导致相应的带荧光标记的捕获探针解除淬灭状态。通过鉴定产生荧光增强的 捕获探针，可确定样品中存在的靶序列。用于制备捕获探针阵列的示例性方法参见例如美 国专利申请号13/399, 872和61/600, 569,其全文通过引用全文纳入本文用于全部目的。
[0040] 在本文中，本发明提供了允许高度多重化检测感兴趣核酸的方法及相关装置、系 统和耗材，例如用于生物样品中的检测病毒、细菌、疟原虫属、真菌或其他病原体。在优选的 方面中，所述耗材包含信号优化的腔室，该信号优化的腔室在腔室内表面上具有高效热稳 定核酸检测阵列。该阵列被构造为包含多至约100种或更多种不同带标记的捕获探针。该 方法包括与阵列上捕获探针互补的靶标特异性探针，且那些靶标特异性探针包含淬灭剂部 分，如上文所述。如前所述，在反应室中扩增感兴趣的靶核酸的一部分期间，携带淬灭剂的 靶标特异性探针被消化且其淬灭捕获探针荧光的能力被基本消除。可使靶标特异性探针接 触阵列上的捕获探针然后将样品导入阵列。或者，可将样品材料与靶标特异性探针混合然 后导入阵列。
[0041] 因此，在第一方面，提供了检测靶核酸的方法。该方法包括提供检测腔室，该检测 腔室在腔室的至少一个表面上具有至少一个高效核酸检测阵列。如本文中所用，"高效核 酸阵列"是在杂交条件下与靶标特异性探针有效杂交的捕获核酸探针阵列。在典型的实施 方式中，阵列被设置在反应/检测腔室的内表面上。可以通过从点样法到化学或光化学合 成的任何传统阵列技术在表面上形成该阵列。通过控制识别探针的捕获探针区域的长度来 实现高效（较短的探针比较长的探针更有效地杂交，小到对于杂交条件而言的最小杂交长 度）。可以通过在捕获位点（捕获探针上与靶探针杂交的位置）和表面之间包含连接序列 或结构（因而在距离表面的选定距离上形成捕获位点，其可以降低对杂交的表面效应）来 使捕获位点对于与靶探针杂交而言更高效/更可得。例如，可以使用核酸序列和/或聚乙 二醇接头。
[0042] 该捕获核酸探针被设置以捕获相对小的探针核酸，这也提高了阵列效率。通过在 包含淬灭剂基团的靶标特异性探针存在的情况下观察阵列上捕获探针荧光的减弱或淬灭 来检测靶标特异性探针与阵列的结合。相反地，靶序列扩增的检测是通过检测来自捕获探 针的荧光增加来实现的，因为靶标特异性淬灭探针被扩增反应消耗和/或被扩增的靶标固 定。
[0043] 优选地，这在反应或检测腔室中进行，该腔室构造为增强总体反应和检测。"反应 腔室"或"检测腔室"通常指部分或全部封闭的结构，在其中分析样品或检测靶核酸。该腔 室可完全封闭，或可包含流控偶联到所述腔室的端口或通道，例如用于递送试剂或反应剂。 该腔室的形状可变化，例如，取决于实际应用和可用的系统设备。在一些情况下，该腔室可 构造为降低阵列近端的背景信号。当其尺寸上成形以降低信号背景（如通过包含接近阵列 的较小尺寸（如腔室厚度）（因而降低靠近所述阵列处溶液生成的信号量））时，或者当该 腔室另行构造以降低背景（如通过使用涂层（如光学涂层）或结构（如挡板或靠近所述阵 列的其他形状结构））时，腔室可以是"构造为降低阵列近端的背景信号"。通常，腔室构造 为在阵列附近具有某一尺寸（例如，深度），使得溶液中的信号足够低以允许检测阵列处的 信号差异。例如，在一个实施方式中，阵列上方的腔室深度小于约Imm;理想地，腔室深度小 于约500 y m。通常，阵列上方的腔室深度小于约400 y m、小于约300 y m、小于约200 y m或 小于约150 ym。在本文提供的一个实施例中，腔室深度为约142 ym。这类较薄的腔室也具 有较少的热质量，从而其温度循环比较厚腔室更快且更有效，有益于热循环扩增方法。
[0044] 在一些实施方式中，将具有待检测靶核酸的一个或多个拷贝的样品加载到检测腔 室中。将一种或多种扩增引物和包含淬灭剂基团的靶标特异性探针与一种或多种靶核酸拷 贝杂交。在扩增引物依赖的扩增反应中扩增一种或多种靶核酸拷贝的至少一部分。在使用 具有外切核酸酶活性的聚合酶来进行时，该扩增反应导致靶标特异性探针的切割，例如归 因于扩增酶的核酸酶活性。这导致可供结合阵列上捕获探针的靶标特异性探针的数目减 少，并因而导致那些捕获探针上荧光团的总体淬灭减少，即导致从阵列表面测得的荧光增 加，该增加表明样品中存在靶核酸。
[0045] 如前所述，优选薄的反应或检测腔室，因为其中能造成背景信号的热物质和液体 体积较少。在典型的实施方式中，该阵列附近的腔室深度或其他维度上小于约1mm，更典 型地，在该阵列附近的至少一个维度上是约500 y m或更小，优选约250 y m或更小，例如约 10 y m-约200 y m，并且在一些实施方式中，该阵列附近的腔室在某一维度上是约150 y m。 在本文一个实施例中，阵列上方的腔室深度为约142 y m。在本文另一个实施例中，腔室深度 为约IOOy m。相关的腔室维度取决于检测系统的信号检测路径，例如当通过传递光到阵列 上来生成信号时，其中一些光从阵列溢出阵列并进入阵列上方的液体中时，所述相关维度 是阵列上方的腔室深度。
[0046] 对于上文所述其他试验形式（如美国申请号13/399, 872中所述），阵列通常提供 以非限速数量的与带标记探针（如释放的带标记探针片段）杂交的捕获核酸。在这类方法 中，需要带标记探针不使阵列饱和。然而，在本发明中，对带标记的捕获探针的数量进行设 计，从而作为靶序列扩增的结果，使与捕获探针结合的靶探针数目发生可测量的变化。由于 典型扩增反应中扩增期间靶标浓度的显著变化和相应量的靶标特异性探针消耗，与带标记 的捕获探针结合的靶探针量的变化会产生可测量的效果。虽然反应混合物中靶标特异性探 针的量可以广泛变化，但在特别优选的方面，反应混合物中靶标特异性探针的浓度范围可 以是约IOnM-约luM，优选约50nM-约200nM。
[0047] 典型的捕获探针阵列密度是约350fmol/cm2或更大，如约2000fmol/cm 2或更大、 2500fmol/cm2 或更大、3000fmol/cm2 或更大、4000fmol/cm2 或更大、4500fmol/cm2 或更大，或 者5000fm〇l/cm2或更大。阵列效率也与待捕获探针的长度呈函数关系。尽管探针确实需要 足够长以在杂交过程中于给定T ni下结合，但较短的探针通常呈现更有效的杂交。通常待由 阵列捕获的探针的长度为约50个核苷酸或更短；这些阵列包含具有对应的互补捕获核酸 序列的位点（捕获探针的核酸序列也可任选地包含其他序列，例如，以隔开表面上的互补 区域（捕获位点），例如，以降低表面效应）。更典型地，探针和捕获位点的序列（不包含任 何可选的用于分隔的其他序列）长度为约40个核苷酸或更短，例如约20个核苷酸至约35 个核苷酸。
[0048] 在一些情况下，选择用于给定分析的阵列的捕获探针和互补靶标特异性探针，使 得提供覆盖阵列的所有成员的窄范围Tm。特别地，为了确保与捕获阵列的最优和稳定的杂 交，给定阵列中的捕获探针各自具有的Tni在该阵列各其他成员的约10°C内，并且优选在该 阵列的各其他探针的约7°C、5°C或:TC内。这样的窄T ni范围使得杂交稳定，并且所得信号 生成涵盖阵列的所有成员。由于靶标特异性探针具有感兴趣的靶序列所确定的序列，因此 会降低杂交体控制Tm的能力。然而，通常，可选择总体靶标中的不同靶标特异性序列以实 现较窄的Tm范围。
[0049] 如上文所述，选择捕获探针上荧光团和靶标特异性探针上淬灭剂的位置，使得在 两条探针杂交在一起时，淬灭剂位于与荧光团足够近的距离内，从而在经受激发光照时能 量能从荧光团转移至淬灭剂。在某些方面，这通过将淬灭剂和荧光团与其相应探针序列上 的互补碱基相连来实现。将标记基团和淬灭剂与核苷酸连接，特别是与核苷酸的核碱基部 分连接是本领域熟知的。
[0050] 在特别优选的方面，淬灭剂基团位于靶标特异性探针的5'位置处或附近，因此在 扩增反应期间其不会中断切割/消化。
[0051] 也可改变阵列上捕获探针的取向。例如，可使捕获探针在其3'或5'端与阵列表 面相连，且可使荧光团更接近或更远离阵列表面。在特别优选的方面，捕获探针经由其5' 端与表面相连，并在靠近该末端处携带其荧光团，例如在3'端核苷酸上。应理解，可通过 直接共价连接至表面或表面上的涂层，或者经由间插结合分子（intervening association molecule)(例如通过生物素-亲和素连接）、核酸杂交偶联（例如使用与捕获探针末端存 在的标签序列互补的单独连接的核酸）等进行探针与阵列表面的连接。同样，示例性表面、 涂层和核酸固定技术参见例如美国专利申请号61/600, 569,其在前文中全文纳入本文以用 于全部目的。
[0052] 根据耗材的确切设置，可通过任何不同机制将样品载入本发明的装置/系统的腔 室。在一个方便的应用中，通过与腔室可操作连通的至少一个端口或流体通道来加载样品。 例如，可在耗材的顶表面制造端口，所述端口引导进入所述腔室。这使加载简化，例如通过 移液器或其他液体递送装置加载。或者，流体或微流体通道、毛细管等可用于样品递送。
[0053] 本发明的方法可用于检测样品中感兴趣核酸和/或对核酸定量，例如实时进行。 因此，一方面，可选多个扩增循环中扩增靶核酸然后从阵列检测信号，信号检测后靶核酸部 分得以补充扩增，即在靶标特异性探针的其它拷贝的存在下）。一个或多个扩增循环后，反 应混合物中保持游离的靶标特异性探针序列（如未消化且未与扩增的靶序列杂交的那些） 能与阵列上的捕获探针杂交并淬灭其连接的荧光团。随后，测试阵列是否存在荧光，测得的 信号强度对应于样品中靶核酸的存在和/或含量。通常，对样品扩增超过1个循环后开始 检测，通过增加靶标特异性探针的数目来增加信号水平，所述靶标特异性探针被扩增反应 消耗或被扩增的靶序列量的增加所固定。例如，可选对靶核酸扩增至少例如2、3、4、5轮或 更多轮扩增循环后从阵列检测信号。
[0054] 带标记的捕获探针通常包含荧光或发光标记物，尽管也可使用其他标记物如量子 点。在一个优选实施方式中，所述标记物是荧光染料。由捕获探针产生的信号通常是光学信 号。类似地，将靶标特异性探针上的淬灭剂基团选择为来自所用荧光团的能量接受体，例如 在荧光团发射的波长下作为能量接受体。如本文中所用，该淬灭剂可以是非发射性淬灭剂， 例如其接受来自荧光团的能量而不以光的形式发射能量。或者，该致敏剂可以发射光能，但 所发射光能的波长被用于分析来自阵列的荧光的检测系统滤除。因此，淬灭剂仅指自荧光 团接受荧光能量且不在检测系统的经检测波长范围内发射的基团，所述检测系统用于监测 荧光团发射波长的荧光。在其他方面，靶标特异性序列上的淬灭剂可包括发射性淬灭剂，且 总体分析仪器系统可包括能够在靶标特异性序列上不存在"淬灭剂"基团的情况下差异化 检测"淬灭剂"所发射辐射和捕获探针的荧光团所发射辐射的光学系统。结果是，当靶标特 异性序列与阵列结合并照射有特异性激发捕获探针荧光团的激发波长时，该荧光团会以其 第一特征性波长发射，其会经由能量转移被"发射性"淬灭剂基团吸收。结果是，发射性淬 灭剂会以其第二特征性波长发射。当靶标特异性探针不再与阵列结合时（例如作为扩增反 应消耗的结果），由未淬灭的捕获探针的荧光团所发射的能量将以第一特征性波长发射。使 用常规的双波长荧光检测光学部件，可以基于其特征性荧光信号检测阵列的两种状态。
[0055] 通常通过检测对应于捕获探针上光学标记物的一种或多种光学信号波长来检测 信号。因为阵列上靶探针的结合位置能用于区分不同靶标特异性探针，所以不需要在不同 探针上采用不同标记物以区分多重扩增反应（在样品中存在超过一种的靶标时，设计以扩 增多种靶核酸的扩增反应）中的探针。换言之，在一些实施方式中，捕获探针的位置特异性 针对给定的靶序列。
[0056] 虽然以与阵列上捕获探针相连的标记物基团的方式进行一般描述，但应理解可以 使用不需要使用预先标记的捕获探针的其他检测方案。例如，在一些实施方式中，可以使用 插入染料。插入染料通常在整合到或插入到双链核酸（例如捕获探针/靶标特异性探针杂 交体）内之后产生可检测信号事件，。在本发明的内容中，靶标特异性探针与阵列上互补捕 获探针的杂交在阵列表面处产生双链体，该双链体可以纳入插入染料，并且提供指示该杂 交的独特信号。插入染料为本领域熟知，并且包含描述于如Gudnason等，Nucleic Acids Research, (2007)，第35卷，第19, el27中的那些，该文献通过引用纳入以用于所有目的。 类似地，靶标特异性探针可提供有荧光或其他光学可检测标记基团，而捕获探针不包含标 记基团或互补基团，例如淬灭剂或能量接受体基团。在对靶序列进行任何扩增前，这些带标 记的探针会与其对应的捕获探针杂交，在基材（如阵列）表面产生信号浓度。在溶液中扩 增靶序列期间，荧光标记的靶标特异性探针被消化，使标记释放至溶液中并减少了与表面 上捕获探针杂交的带标记的靶标特异性探针的量。如上文所述，样品中靶序列的存在导致 表面杂交信号量随后续扩增循环而减少。在一些方面，靶标特异性探针可包含淬灭剂基团， 例如，正如在常规的TaqMan?探针组中所见。
[0057] 相似地，虽然特别优选光学信号检测方法，通常也可以使用非光学标记和/或检 测方法来进行探针设计和测试方