用于对固定化在基底上的模板核酸测序的方法

用于对固定化在基底上的模板核酸测序的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸测序。特别地，本发明涉及一种用于对固定化在基底上的模板核 酸测序的方法、一种用于对模板核酸测序的程序单元、一种计算机可读介质、一种用于对模 板核酸测序的器皿、用于对模板核酸测序的器皿的用途、以及用于对固定化模板核酸测序 的测序装置。
【背景技术】
[0002] 诸如DNA测序的核酸测序是确定DNA分子内核苷酸的精确顺序的过程。其包括用 来确定DNA链中四种碱基-腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的顺序的任何方法或技术。快 速DNA测序方法的出现极大地加快了生物和医学研究和发现。DNA序列知识对于基础生物 研究以及诸如诊断、生物技术、法医生物学和生物系统分类学的很多应用领域来说已经变 得不可或缺。现代DNA测序技术的快速测序对于完整DNA序列或许多类型和生命种类的基 因组的测序是有帮助的，包括人类基因组和许多动物、植物、和微生物物种的其它完整DNA 序列。
[0003] 在二十世纪70年代早期学术研究人员使用基于二维色谱法的费力方法获得了第 一个DNA序列。随着自动分析的荧光标记测序方法的发展，DNA测序已经变得更加容易并 且速度有了数量级的提升。
[0004] 但是，很多测序方法依赖于整体测量并且不能在单个DNA分子基础上实现。此外， 多数当前使用的测序方法需要结合到模板DNA链中的核苷酸的标记，这导致在样本准备和 测量本身的过程中的某些不利方面。另外，对于用来测序的标记dNTP的需求增加了成本。 此外，部分当前水平的测序方法利用焦磷酸盐来产生检测信号，但是相对不灵敏。

【发明内容】

[0005] 需要提供一种对模板核酸测序的改进方法。特别地，需要一种使用非标记dNTP测 序的灵敏方法。
[0006] 本发明的目的通过独立权利要求的主题解决。本发明的其他实施例和优点合并在 从属权利要求中。
[0007] 以下详细描述的本发明的实施例类似地属于用于对模板核酸测序的方法、用于对 模板核酸测序的程序单元、计算机可读介质，用于对模板核酸测序的器皿的用途以及用于 对模板核酸测序的测序装置。所述实施例的不同组合会出现协同效应，虽然下文没有明确 描述。
[0008] 在相对于一些优选实施例详细描述本发明之前，提供以下一般定义。
[0009] 下文中说明性地描述的本发明能够在缺少本文未具体公开的任何一个或多个元 件、一个或多个限制的情况下实践。
[0010] 将相对于特定实施例并参照某些附图描述本发明，但本发明不限于此，而是仅由 权利要求限定。
[0011] 本发明的描述和权利要求中使用的术语"包括（comprising) "不排除其他元件。为 了本发明的目的，术语"由…?组成（consisting of)"应被认为是术语"包括（comprising of) "的优选实施例。如果下文中组被限定为包括至少确定数量的实施例，则其也被理解为 公开组，所述组优选只由这些实施例组成。
[0012] 当指单数形式时使用不确定或确定冠词的情况，例如"一"、"一个"或"所述"，其包 括多个名词除非另有明确说明。本发明上下文中的术语"大约"或"近似"表示本领域技术 人员会理解的仍然确保所讨论特征的技术效果的精确值的区间。所述术语通常表示指明数 值的±20%的偏差，优选±15%，更优选±10%，并且更加优选±5%。
[0013] 此外，说明书和权利要求中的术语"第一"、"第二"、"第三"或"（a) "、" (b) "、"（c) "、 "⑷"或"⑴"、"（ii) "、"（iii) "、"（iv) "等用来区分类似元件，并不一定用来描述顺序或 时间次序。应该理解的是如此使用的术语在适当情况下是能够互换的，并且本文所描述的 本发明的实施例能够以不同于本文描述或示出的其他顺序进行操作。
[0014] 如果术语"第一"、"第二"、"第三"或"（a) "、"（b) "、"（c) "、" ⑷"或"⑴ "、"（ii) "、 "（iii) "、"（iv) "等涉及方法或应用或试验的步骤，所述步骤之间没有时间或时间间隔相干 性，除非另有说明，即，所述步骤可同时执行或者所述步骤之间可有几秒、几分钟、几小时、 几天、几周、几个月、甚至几年的时间间隔，除非如上文或下文所述的应用中另有说明。
[0015] 只使用技术术语的一般意思。如果确定术语具有具体意义，会在使用术语的上下 文之后给出术语的定义。
[0016] 术语"核酸"指可被测序的任何类型的核酸分子，例如DNA或RNA或PNA或LNA或 由化学单元序列组成的任何聚合物。DNA是优选核酸。术语"核酸模板"指待测序的任何类 型的核酸分子。DNA模板优选是核酸模板。利用本方法，具有5到10000之间长度或更长的 喊基的DNA模板可被测序。例如，模板可具有长达约10000、长达5000、长达1000、长达900、 长达约800、长达约700、长达500、长达约250、长达约100、长达约50长度的碱基。DNA模 板通常为至少5个碱基长度。
[0017] 应该理解的是为了本发明的目的，术语"核酸模板"和"DNA模板"指作为测序先决 条件的至少部分地和优选完整的单链核酸序列和单链DNA序列。在捕捉核酸和/或引物核 酸的结合中，所得到的复合物可包括单链部分和双链部分。
[0018] 本文中使用的术语"核苷酸"包含任何脱氧核苷酸，包括如在测序过程中使用的 任何2' -脱氧核糖核苷-5-三磷酸盐（dNTP)。因此术语"核苷酸"包括dNTP，例如dATP、 dGTP、dCTP和dTTP以及它们的任何衍生物。如本文中使用的，术语"核苷酸"指从由单核苷 酸、寡核苷酸和多核苷酸以及它们的混合物构成的组选取的任何一种。这种物质通常带负 电荷。使用可由单链核苷酸和/或双链核苷酸组成。此外，可以混合蛋白质、DNA以及核苷 酸。生物聚合物不仅包括源自生物体的那些，还包括从源自生物体的生物聚合物修改的那 些和合成分子。
[0019] 术语"引物"和/或"核酸引物"指通常至少6个碱基长度的核酸，优选至少6个 碱基长度的DNA序列，对于它们序列是已知的并且它们可用模板核酸且优选DNA模板退火。 这些引物的长度通常具有5到100个碱基的长度以允许用核酸模板且优选DNA模板高效退 火。但是其他引物长度也是可能的。因此引物在其3'端会具有自由OH组。
[0020] 术语"聚合酶"指可拉长已经退火到核酸模板的引物的3'端的酶。优选为DNA聚 合酶。可优选提供DNA聚合酶用于校对。可使用市场上能够买到的任何DNA聚合酶。一种 优选DNA聚合酶是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的BstDNA聚合酶。但是，也可使用其它聚合酶 而不脱离本发明的范围。
[0021] 本文中使用的术语"标记"可以是能够发射信号的任何适合实体。在该情况下所 述信号可包括任何物理信号、化学信号或生物信号。在这些信号中，电磁波是优选的。当被 电磁波特别是光激励时发出光致发光的光致发光标记是特别优选的。特别地，荧光标记和 磷光标记可包括荧光染料、金属、以及半导体纳米粒子。
[0022] 此外，复合物上标记的数量不受任何特别限制并且可根据预期目的进行适当地选 取。所述数量至少是1个，并且可以是两个或更多个。复合物上标记的位置不受任何特别 限制，并且可根据预期目的进行适当地选取。如果在如下文中限定的复合物是线性的，则可 能的标记位置包括其端部。如果复合物是多核苷酸或包括多核苷酸，则标记位置可以在例 如3'端或5'端。其他位置也是可能的。根据下文预期和描述的具体实施例，标记可以与 如下文描述的复合物共价结合或非共价结合。在优选实施例中，优选为光致发光标记的标 记与用在测序方法中和/或与模板核酸一起使用的聚合酶结合。在这些情况下共价结合是 优选的。尽管所述标记也可结合到用在测序过程中的dNTP，但是本发明的优选实施例考虑 无标记dNTP。
[0023] 此外，下文中术语"复合物"会被用作分子结合的描述。如本文中使用的复合物至 少包括模板核酸和引物核酸。但是也可包括附加分子。例如，复合物包括模板核酸、引物核 酸和聚合酶。因此，在本发明的上下文中，术语"复合物"可与术语"DNA复合物"或"DNA/ 聚合酶复合物"同义描述。另外，根据本发明的优选复合物是核酸模板、引物、聚合酶以及 任何其他类型的一个或多个分子（例如用来将核酸模板结合到基底的捕捉寡核苷酸）的结 合。本文中可将用于结合的所述分子称为"结合单元"。如下文中将详细解释的，结合单元 可以各种不同方式具体化。所述复合物也可称为"杠杆（lever)"或"DNA-杠杆"。此外，由 于术语"复合物"和术语"结合单元"不限于任何具体形状，所以该术语是比喻性的，并且不 应被理解为对复合物和/或结合单元的类型或形状作任何限制。另外，替代DNA，RNA也可 用在本发明的上下文中。
[0024] 模板核酸可通过附着力和/或内聚力固定化在基底上。但是，更加优选的实施例 利用结合单元，结合单元将模板结合到基底以实现固定化。结合单元可包括捕捉核酸或由 其构成。另外，下文将会如下使用术语"结合单元"。结合单元可以具体化为例如用于将模 板核酸结合到基底的化学链结（linker)。下文将会给出这种链结的示例。替代地，结合单 元可具体化为用于将模板核酸结合到基底的捕捉核酸。但是，化学链结和捕捉核酸的组合 也有可能实现结合单元。术语"结合单元"包括可将模板核酸固定化在基底处的各种不同 的其他固定化实体。在下面图1的相关描述中将会详细解释各种示例。
[0025] 下文将会使用的术语"与模板核酸共价或非共价结合"的意思是包括直接或间接 接合到模板核酸。例如，所述标记可结合到聚合酶，所述聚合酶自身结合到模板核酸。所述 标记可通过例如标记聚合酶-特异性抗体共价或非共价结合到模板核酸。但是像是例如光 致发光标记的标记也可结合到模板核酸的端部，或者也可结合到捕捉寡核苷酸/引物寡核 苷酸。另外，下文中也将使用的术语"结合到复合物"和"结合到模板核酸"的意思是分别包 括直接结合或间接接合。例如，所述标记可接合到聚合酶，所述聚合酶自身结合到复合物。 但是，标记也可结合到模板核酸的端部，或者也可结合到捕捉寡核苷酸/引物寡核苷酸，捕 捉寡核苷酸/引物寡核苷酸是结合单元的部分。
[0026] 根据本发明的示例性实施例，提供一种用于对固定化在基底上的模板核酸测序的 方法，其中标记共价或非共价地结合模板核酸，其中核酸引物退火成所述模板核酸，其中淬 灭介质用于淬灭标记的信号。所述方法至少包括以下步骤：
[0027] a)添加核苷酸，
[0028] b)通过以下方式确定所述核苷酸是否结合在退火至所述模板核酸的所述核酸引 物的3'端：至少在添加核苷酸之前和之后观察标记的信号，使用观察到的标记的信号基于 观察到的标记的信号的变化来检测核苷酸结合到模板核酸中，其中信号的变化是由核苷酸 结合到模板核酸中引起的标记到淬灭介质的距离变化导致的。
[0029] 根据另一示例性实施例，淬灭介质是淬灭层。
[0030] 在另一示例性实施例中，如下文将详细解释的，淬灭层可设置在基底上。但是在其 他实施例中，淬灭层不位于基底上。之前提到的关于淬灭层的实施例可与本文包括的每个 其它实施例结合使用，除非有相反说明。特别地，也是在关于程序单元、计算机可读介质、器 皿、器皿的用途和/或测序装置的实施例中，淬灭介质可具体化为淬灭层，例如在基底上。
[0031] 本发明的测序方法包括基于标记发出信号的改变检测核苷酸结合到模板核酸中 的步骤。此外，信号的改变是由标记到基底的距离改变引起的，距离的改变是由核苷酸结合 到模板核酸中引起的。这将在下文中详细描述并可结合例如图1到12。
[0032] 本发明的方法提供用于更加精确和可靠地测序模板核酸。有利地，可使用非标记 核苷酸、dNTP。因此，由聚合酶引起的核苷酸结合不受化学标签影响/干扰并且保持天然持 续合成能力。另外，该方法是节省成本的，因为其废弃了核苷酸的昂贵标记。另外，本方法 允许单分子测序。利用例如抗光致退色的光稳定PL标记，所描述的方法可被用来利用市场 上能够买到的光学仪器设备监测核苷酸在单个分子水平处的结合。除了改进工作流程的效 率和速度之外，该方法提供重要机会来研究后生修饰。特别地，沿DNA模板的核苷酸的甲基 化状态可通过所测量的匹配核苷酸的结合时间进行推断。相对比，传统的现有技术测序方 案要求通过PCR过程扩大模板DNA，在PCR过程中原始DNA链的甲基化状态被不利地丢失 了。通过本发明的方法可实时测量核苷酸结合速率，这对于市场上的多数测序系统是不可 能的。在这样做时，可根据给定聚合酶的不同持续合成能力区分沿模板链的不同核苷酸来 从溶液结合匹配dNTP并继续到模板上的下一个碱基。有利地，化学改性的核苷酸-例如， 在后生过程中被甲基化或以一些其他方式损坏（氧化等）-可通过本发明的用于测序的装 置和方法识别。另外，结合时间提供关于模板上核苷酸重复，即相同核苷酸的伸长，的长度 的信息，其一般难以用已建立的方法量化。但