使用尿的无细胞dna评价肾状态的方法和组合物的制作方法
【专利说明】使用尿的无细胞DNA评价肾状态的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请顺序号US61/793, 427的 优先权利益，将该文献的全部内容引入本文作为参考。
[0003] 背景
[0004] 统称为肾系统的肾执行从血液中除去废物和调节水基液体水平的主要功能。它们 是泌尿系统中必需的，而且可起自身稳定功能的作用，例如调节电解质、维持酸-碱平衡和 调节血压。它们充当身体血液的天然过滤器并且除去废物，使废物转移至膀胱。在产生尿 的过程中，肾排泄废物，例如尿和铵，且它们还负责水、葡萄糖和氨基酸的再吸收。肾还产生 激素，包括骨化三醇、红细胞生成素和酶肾素。
[0005] 肾状态受肾病或损伤（也称作肾损伤、肾病）影响且可以因急性和慢性病症而产 生。改变的肾状态的另一种形式是移植的肾排斥。
[0006] 传统上，通过使用针对肌酸酐的血液试验评价肾状态。较高水平的肌酸酐表示较 低的肾小球滤过率，且作为结果，肾排泄废物的能力下降。为了完整地研究肾损害的主要原 因，各种形式的医学成像、血液试验和肾活组织检查（取出肾组织小样）通常用于发现是否 存在可逆的肾功能障碍的原因。
[0007] 对于改善的肾损伤和肾移植损伤的非侵害性诊断和用于评价肾状态一般存 在关键的未得到满足的需求。在肾移植损伤中，例如，已经证实供体来源的无细胞 DNA(dd-cfDNA)是血液中移植物损伤的替代者，但需要以供体和受体DNA测序为代价。
[0008] 更近来，在人尿中发现了来自濒临死亡的细胞的无细胞DNA(CfDNA)。近期的尝试 集中于测试尿的CfDNA作为同种异体移植物排斥的标记，然而，该技术限于检测已经接受 了男性肾的女性接受者的Y染色体-特异性序列或预先测定供体与受体之间的遗传组成/ 分子标记的差异并且探测那些差异。照此，这些测试类型限于某些类型的构造（例如，接受 男性供体肾的女性移植物接受者）且不能广泛地适用于所有移植物构造。
[0009] 因此，需要用于广泛地适用于所有肾移植情况的非侵害性测试的改进的组合物和 方法来使用尿CfDNA评价肾状态、肾损伤或肾移植物排斥。需要快速地用于测定所有肾损 伤和肾移植患者中的尿的无细胞DNA的方法，与性别无关且无需负担DNA测序。
[0010] 本文提供了用于这样的操作的组合物和方法，例如高流通量方法。
[0011] 将本说明书中引述的所有出版物和专利申请引入本文作为参考，如同将出版物或 专利申请各自特别地和分别地显示以并入作为参考一样。
[0012] 发明概述
[0013] 尿的无细胞DNA(CfDNA)可以是用于评估和评价肾状态、肾健康、肾损伤、肾移植 损伤和高度急性肾排斥的强有力工具。可以通过数字或标准qPCR对尿CfDNA负荷进行依 次分析，无需供体和受体DNA测序。
[0014] 本发明涉及使用在尿中发现的CfDNA评价个体的肾状态和肾健康。具体地，本发 明涉及用于监测、诊断、预后和评价患有或疑似具有改变的肾状态的受试者的治疗方案的 方法和组合物。
[0015] 本发明尤其提供了用于评价肾状态、肾损伤或肾移植物排斥的组合物和方法，其 基于测定尿中的常染色体的cfDNA。
[0016] 在一个方面，本发明提供了用于评价个体的肾状态的方法，包括：测定尿样中的常 染色体的拷贝数和比较所述染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样中所述染色体的标准 拷贝数，其中拷贝数的改变预示改变的肾状态。在一个实施方案中，常染色体是染色体1。 在一个实施方案中，使用EIF2C1基因座测定染色体1的拷贝数。在一个实施方案中，使用 包含正向引物5' -GITCGGCTITCACCAGTCT和反向引物5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC的引物组测 定EIF2C1基因座。在一个实施方案中，所述引物组用于实时PCR且进一步包括探针。在一 个实施方案中，所述探针包含如下序列和报道基因：5' -HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
[0017] 在本文的任意实施方案中，经测定高于标准拷贝数的拷贝数预示受损的肾状态。 在本文的任意实施方案中，经测定等于或低于标准拷贝数的拷贝数预示良好的肾健康。在 本文的任意实施方案中，使用实时PCR、定量PCR或数字PCR(dPCR)测定拷贝数。在本文的 任意实施方案中，使用BioMark实时PCR系统测定拷贝数。在本文的任意实施方案中，受 损的肾状态可以包含肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植物排斥或者对于肾损害、肾损 伤、肾病、肾病症或肾移植物排斥的治疗无响应。在本文的任意实施方案中，肾状态的评价 可以包括测定肾脏病，肾损伤、肾移植损伤或肾移植物排斥进程。在本文的任意实施方案 中，肾状态的评价可以包括测定患有且目前正在进行或已经进行过治疗的肾脏病、肾损伤、 肾移植损伤或肾移植物排斥的个体中的治疗响应。
[0018] 在本文的任意实施方案中，CfDNA可以提取自尿。在本文的任意实施方案中，测定 提取自尿的cfDNA中的拷贝数。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括测定 其它病理学和临床数据。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括测定肌酸酐 的量。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括测定蛋白尿或cGFR。在本文的 任意一个实施方案中，所述方法还可以包括进行肾的活组织检查。
[0019] 在本文的任意一个实施方案中，所述个体是处于肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、 肾移植物损伤或肾移植物排斥的风险中的个体。在本文的任意一个实施方案中，所述个体 是糖尿病患者。在本文的任意一个实施方案中，所述个体患有高血压。在本文实施方案的 任意一个中，所述个体是同种异体移植物肾移植的接受者。在本文的任意一个实施方案中， 所述个体处于肾移植物损伤或肾移植物排斥的治疗中。在本文的任意一个实施方案中，所 述个体患有至少一种急性排斥反应发作。
[0020] 在另一个方面，本发明提供用于评价个体的肾状态的方法，包括：测定尿样中ALU 重复单元的数量和比较ALU重复单元的数量与来自正常群体的尿样中ALU重复单元的标准 数量，其中ALU重复单元的数量改变预示改变的肾状态。在一个实施方案中，经测定高于 重复单元的标准数量的ALU重复单元的数量预示受损的肾状态。在一个实施方案中，经测 定等于或低于ALU重复单元的标准化数量的ALU重复单元的数量预示良好的肾健康。在 另一个实施方案中，测定提取自尿的cfDNA中ALU重复单元的数量。在另一个实施方案 中，使用实时PCR、定量PCR或数字PCR测定ALU重复单元的数量。在另一个实施方案中， 使用BioMark实时PCR系统测定ALU重复单元的数量。在另一个实施方案中，使用实时 PCR测定ALU重复单元的数量。在另一个实施方案中，使用ALU基因座的115个碱基扩增 子测定ALU重复单元的数量。在本文的任意实施方案中，所述方法还可以包含测定同一样 品中常染色体的拷贝数。在另一个实施方案中，测定染色体1的拷贝数。在一个实施方案 中，使用EIF2C1基因座测定染色体1的拷贝数。在另一个实施方案中，使用包含正向引物 5' -GITCGGCmCACCAGTCT和反向引物5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC 的引物组测定EIF2C1 基因 座。在另一个实施方案中，所述引物组用于实时PCR且进一步包括探针。在另一个实施方 案中，所述探针包含如下序列和报道基因：5' -HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
[0021] 在本文的任意实施方案中，受损的肾状态可以包含肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病 症、肾移植物排斥或者对肾损害、肾损伤、肾病、肾病症或肾移植物排斥的治疗无响应。在本 文的任意实施方案中，肾状态的评价可以包含测定肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植物 排斥的进程。在本文的任意实施方案中，肾状态的评价可以包含测定患有肾脏病、肾损伤、 肾移植损伤或肾移植物排斥且目前正在进行或已经进行过治疗的个体中的治疗响应。
[0022] 在本文的任意实施方案中，CfDNA可以提取自尿。在本文的任意一个实施方案中， 所述方法还可以包括测定其它病理学和临床数据。在本文的任意一个实施方案中，所述方 法还可以包括测定肌酸酐的量。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括测定 蛋白尿或cGFR。在本文的任意一个实施方案中，所述方法还可以包括进行肾的活组织检查。
[0023] 在本文的任意一个实施方案中，所述个体是处于肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、 肾移植损伤或肾移植排斥的风险中的个体。在本文的任意一个实施方案中，所述个体是糖 尿病患者。在本文的任意一个实施方案中，所述个体患有高血压。在本文的任意一个实施 方案中，所述个体是同种异体移植物肾移植的接受者。在本文的任意一个实施方案中，所述 个体处于肾移植物损伤或肾移植物排斥的治疗中。在本文的任意一个实施方案中，所述个 体患有至少一种急性排斥反应发作。
[0024] 在另一个方面，本发明提供了诊断测定试剂盒，该试剂盒包含：用于测定来自样 品的至少一种常染色体的拷贝数的试剂；用于测定所述拷贝数的引物组；和用于测定的 使用说明书。在一个实施方案中，常染色体是染色体1。在另一个实施方案中，所述引物 组能够扩增基因座EIF2C1的扩增子。在另一个实施方案中，所述引物组包含正向引物 5' -GITCGGCTITCACCAGTCT 和反向引物 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC。在另一个实施方案中，弓丨 物添加包含用于d PCR的探针。在一个实施方案中，所述探针的序列包含如下序列和报道 基因：5' -HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
[0025] 在本文的任意实施方案中，所述试剂盒还包含用于从样品中提取CfDNA的试剂。 在本文的任意实施方案中，所述样品包含尿。在本文的任意实施方案中，所述引物组能够用 于实时PCR、定量PCR或数字PCR。在本文的任意实施方案中，所述引物组还包含用于数字 PCR的探针。
[0026] 在另一个方面，本发明提供了诊断测定试剂盒，该试剂盒包含：用于测定样品中 ALU重复单元的数量的试剂；用于测定所述ALU重复单元的数量的引物组；和用于测定的 使用说明书。在一个实施方案中，所述引物组是能够扩增ALU基因座的扩增子的组。在 另一个实施方案中，所述引物组包含正向引物5' -GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3'和反向引 物5' -ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'。在另一个实施方案中，引物另外包含用于数字PCR的探 针。在一个实施方案中，所述探针的序列包含如下序列和报道基因：5'-HEXTCAAGCGATTC TCCTGCCTCAGC-BHQ-3'。在另一个实施方案中，所述试剂盒还能够包含测定常染色体拷贝 数的引物组。在一个实施方案中，常染色体是染色体1。在另一个实施方案中，所述引物 组能够扩增基因座EIF2C1的扩增子。在另一个实施方案中，所述引物组包含正向引物 5' -GITCGGCTITCACCAGTCT 和反向引物 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC。在另一个实施方案中，弓丨 物另外包含用于数字PCR的探针。在一个实施方案中，所述探针的序列包含如下序列和报 道基因：5' -HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
[0027] 在本文的任意实施方案中，所述试剂盒还包含用于从样品中提取CfDNA的试剂。 在本文的任意实施方案中，所述样品包含尿。在本文的任意实施方案中，所述引物组能够用 于实时PCR、定量PCR或数字PCR。在本文的任意实施方案中，所述引物组还包含用于数字 PCR的探针。
[0028] 附图简述
[0029] 图1呈现来自个体的血浆样品中染色体1染色体Y拷贝数之间的相关性，所述个 体进行了肾移植，具有或没有急性排斥（AR)发作。
[0030] 图2呈现来自个体的血浆样品中染色体1染色体Y拷贝数之间的相关性，所述个 体进行了肾移植，具有或没有急性排斥（AR)发作。
[0031] 图3呈现质量控制测定。为了评价尿样中染色体1拷贝数的稳定性，以重复试验 发问那个是测定来自3位患者的9份样品中染色体1的拷贝数。在一式两份试验之间观察 到紧密的相关性。
[0032] 图4显示与染色体1拷贝数相关的尿中的蛋白质的量。
[0033] 图5显示尿样中ALU重复单元与染色体1拷贝数之间的相关性。
[0034] 图6显示实施例4所用研究样品和方法的示意图。本研究评价肾移植患者尿和血 浆中无细胞DNA测量值的意义。分3期进行本研究。在第1期中，评价尿和血浆中dd-cfDNA 的意义。在第2期中，评价常染色体基因座（Chrl)的测量值。在第3期中，分析尿中总 CfDNA负荷的定量以用于特异性移植物损伤检测。
[0035] 图7显示在具有男性移植物的19位女性接受者的小组中，当与稳定（STA)移植物 功能过程中测定的血浆dd-cfDNA值比较时，在急性排斥反应（AR)时观察到血浆dd-cfDNA 的量增加。
[0036] 图8显示正如根据Chr 1基因座EIF2C1拷贝数测定的，尿cfDNA负荷显示甚至尿 中检测到的常染色体DNA是供体来源的。Chr Y基因座SRY的尿cfDNA负荷与Chr 1基因 座EIF2C的尿cfDNA负荷强烈相关。
[0037] 图9显示作为肾移植损伤指示剂的尿中的无细胞Chrl拷贝数。（A)来自具有移植 物损伤的肾移植患者的尿中Chrl的基因座EIF2C1的拷贝数在与来自无移植物损伤的肾移 植患者的尿中的Chrl的基因座EIF2C1的拷贝数比较时具有显著性。（B)数据的ROC分析 产生0. 777的AUC，其中p值〈0. 0001。（C)移植物损伤表型中的蛋白质与肌酸酐之显著地 高于来自无移植物损伤患者的尿的蛋白质与肌酸酐之比。（D) ROC分析产生0. 66的AUC，其 中P值为0.004。
[0038] 图10显示用于移植物损伤适应征的无细胞DNA。（A)显示根据ALU测定数据计算 基因组当量时来自有代表性的患者的数据，与低级AR或其它慢性损伤比较时严重AR的尿 中的cfDNA负荷增加。（B)在一种有代表性的情况中尿中的总cfDNA增加显著地高于其它 慢性损伤相比高级AR和返流性肾病的尿中的总cfDNA增加。（C)呈现了尿cfDNA的增加特 别地高于AR前后样品时的样品数据。（D) cfDNA负荷增加高于BKVN中且在前-BKVN尿中可 以观察到cfDNA负荷升高。
[0039] 图11显示在与AR前后相比时尿cfDNA负荷升高在AR发作中增加。评价3位患 者（患者#1、#2和#3)的AR前后尿中的总cfDNA，显示在AR过程中和发作时尿中的cfDNA 负荷升高。
[0040] 详细描述
[0041] 本文所述的本发明特别地提供了用于管控肾健康（肾脏健康）、肾病和肾移植的 组合物和方法。本发明提供了用于评价个体（例如患者）的肾健康、监测肾健康和鉴定用 于治疗干预的个体和个体亚群的诊断、预后和/或治疗组合物和方法。一般地，本发明基于 测定尿中的cfDNA。如下所述，测定尿cfDNA中的常染色体的拷贝数和/或测定来自那些 已经进行过肾/肾脏移植的尿的cfDNA中的ALU重复单元的数量，可以用于精确地鉴定处 于发生肾移植物损伤或肾移植物排斥症状风险的个体；监测肾移植损伤或肾移植排斥的进 程；监测肾移植物损伤或肾移植物排斥的进程；监测对治疗肾移植物损伤或肾移植物排斥 的个体的治疗响应；鉴定和/或预测肾移植物损伤或肾移植物排斥发作的风险；鉴定应开 始或持续肾移植物损伤或肾移植物排斥治疗的患者亚群；评价肾移植物损伤或肾移植物排 斥的治疗效能；和/或鉴定应监测发生肾移植损伤或肾移植排斥症状的患者亚群。另外进 一步如下所述，测定尿cfDNA中的常染色体拷贝数和/或测定尿