(p〈0. 0001)。然而，当来自AR患者的尿的Chrl基因座EIF2C1的拷贝数 (4. 87± L 22拷贝数/ y g尿肌酸酐）与来自包括CAN和BKVN(4. 77± L 07拷贝数/ y g尿 肌酸酐）的其他损伤表型的尿中的Chrl基因座EIF2C1的拷贝数比较时，无显著性差异 0.93±0. 15,其中P值为0.94。来自急性损伤表型（例如AR和BKVN)的尿中的Chrl基因 座EIF2C1的拷贝数为4. 72±0. 78拷贝数/ y g尿肌酸酐，其显著地高于来自无损伤表型 (STA)的尿中Chrl基因座EIF2C1的拷贝数，0. 93±0. 15,其中P值为〈0. 0001(图9A)。ROC 分析显示损伤和无损伤表型的ROC曲线的AUC为0. 77,其中P-值为〈0. 0001。在1. 15拷 贝数/yg尿肌酸酐的阈值时，真阳性率（灵敏度）为77%，且特异性为64%。
[0181] 当对于血浆中的Chr 1进行dPCR时，数据显示常染色体血浆cfDNA是供体和受体 cfDNA的混合物。通过测定具有移植物损伤和无损伤的患者血浆中的Chrl基因座EIF2C1拷 贝数评价作为移植物损伤的标记的血浆中的常染色体拷贝数的值。AR患者血浆中的Chrl 基因座EIF2C1拷贝数12. 34±0. 97与不具有AR的患者血浆中的Chrl基因座EIF2C1拷贝 数10. 25±0. 71相比无显著性差异（p = 0. 13)。AR患者血浆中的Chrl基因座EIF2C1拷 贝数与具有慢性损伤的患者血浆中Chrl基因座EIF2C1的拷贝数相比无显著性差异。相同 的情况也存在于具有损伤的AR患者血浆中的Chrl拷贝数与无损伤的患者血浆中的Chrl 拷贝数相比较的情况中。
[0182] 尿cfDNA达到的尿蛋白与肌酸酐之比优于急性肾移植物损伤标记的尿蛋白与肌 酸酐之比：蛋白尿是移植物功能障碍的良好标记。分析同组尿样的蛋白质与肌酸酐之比。当 与无损伤组（0.50±0. 06)比较时，来自移植物损伤的样品的尿蛋白与肌酸酐之比高于损 伤组（I. 08±0. 22)，p-值为0.009。有关尿蛋白与肌酸酐之比的ROC分析产生了 ROC，其中 AUC为0. 66且p-值为0. 004。在0. 45 y g/ y g尿肌酸酐阈值下，真阳性率（灵敏度）仅为 63%，特异性为64% (图9)。当蛋白质与肌酸酐配比与Chrl基因座EIF2C1拷贝数数据合 并时，存在改善的AUC，为0. 82,其中p〈0. 0001和79%的灵敏度和68%的特异性。
[0183] 尿CfDNA与肾移植物组织学损伤和肾功能相关：为了评价尿CfDNA负荷是否在 功能伤与移植物内组织学损伤和功能障碍相关，而与损伤Banff分类无关，使来自AR的 尿dd-cfDNA (通过Chr Y和Chr 1的dPCR测定的）与时间配对双盲活组织检查组织学的 肾小球、肾小管和间质损伤的不同Banff等级的半-定量组织学参数和评估的肾小球滤过 率（eGFR)建立相关性。尿dd-cfDNA拷贝数/mcg肌酸酐显著地与eGFR(p = 7. 70E-03, r =-0. 28)和炎症的配对活组织检查组织学标记（i-评分；p = I. 2E-03, r = 0. 32)、肾小 管炎评分（t-评分；p = I. 3E-03, r = 0. 32)和肾小球炎症评分（g-评分；2. 30E-02, r = 0. 23)相关。
[0184] 用于尿dd-cfDNA的dPCR的负荷与qPCR测定的尿ALU重复单元相关：通过测定来 自cfDNA的ALU重复单元测定尿中的总染色体DNA。使用Chr Y和Chr 1的Dd-cfDNA测量 值与如通过ALU重复单元QPCR测定法评估的总尿cfDNA相关（r = 0. 87 ;p〈0. 0001)。由 于这种如通过ChrY和总cfDNA、使用ALU重复单元评估的dd-cfDNA之间的相关性，所以对 于独立的尿样组进行ALU重复单元QPCR，并且使ALU重复单元负荷与如通过匹配的异种移 植物活组织检查Banff评分评价的样品表型建立相关性。
[0185] 如通过ALU重复单元QPCR评估的尿的总cfDNA是急性肾移植物损伤的指示剂：对 于全部相同表型计算基于ALU元件的尿中的基因组DNA拷贝数。基于根据ALU测定数据计 算的基因组当量（GE)，当与具有正常肾功能（0? 11±0. 18GE/mg尿肌酸）（p = 4. 25x10-07) 的健康正常对照组比较时，稳定移植物患者的尿中的cfDNA负荷增加（2. 06±5. 75GE/mg 尿肌酸）。当与具有稳定移植物功能和方案组织活组织检查时的正常移植物组织学的患者 (STA ; (2. 06±5. 75GE/mg尿肌酸））（p = 0. 002)比较时，在对活组织检查时证实为AR采集 的尿样中，ALU重复单元的增加进一步显著地较高（10. 55 ± 25. 43GE/mg尿肌酸）。对于其他 急性损伤表型例如BKVN的尿cfDNA的增加（6. 55 ±7. 02GE/mg尿肌酸）也显著地高于STA 患者中的值（P = 〇. 04)。然而，具有慢性和其他移植物损伤表型（5. 85±23. 24)的患者中 cfDNA负荷的增加高于具有稳定移植物功能和方案活组织检查时的正常移植物组织学的患 者（STA ; (2. 06 ± 5. 75GE/mg尿肌酸），但没有统计学差异（p = 0. 14)。
[0186] 基于移植物损伤与无移植物损伤关系的ALU测定的cfDNA数据的ROC分析显示 AUC 为 0.73,且 p 值为 0.001。
[0187] 尿cfDNA的依次分析是用于预测移植物损伤的敏感性监测工具：通过分析采集自 不同患者的尿样中的纵向尿样评价尿cfDNA负荷的潜在用途。在所有情况中，在急性损伤 例如AR和BKVN时观察到cfDNA负荷急剧升高（图10)。当与低级AR或其它慢性损伤比 较时，严重AR的尿中存在cfDNA负荷增加（图10A)。在每次AR事件和其它急性损伤情况 例如返流性肾病中观察到这种增加（图10B)并且与稳定的移植物功能和其它慢性损伤比 较。与边缘线和低级AR例如ARI比较，在高级AR(II和III)中存在cfDNA负荷的显著性 提高（图10C)。在BKVN中cfDNA负荷增加较高且可以在前-BKVN尿中观察到cfDNA负荷 升高（图10D)。当与如下相同患者的前-和后-AR比较时，将尿中cfDNA负荷升高观察为 AR发作中的增加。评价3位患者（患者#1、#2和#3)AR前后的尿中的总cfDNA，显示在AR 发作期间尿中的cfDNA负荷升高（图11)。
[0188] 尽管为清楚理解的目的已经通过示例和实施例在一定程度上详细描述了上述发 明，但是本领域技术人员显而易见，可以实施某些轻微的改变和变型。因此，本说明书和实 施例不应被视为限定本发明的范围。
【主权项】
1. 用于评价个体的肾状态的方法，包括： a. 测定尿样中的常染色体的拷贝数；和 b. 比较所述染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样中的所述染色体的标准拷贝数， 其中拷贝数的改变预示改变的肾状态。2. 权利要求1的方法，其中经测定高于标准拷贝数的拷贝数预示受损的肾状态。3. 权利要求2方法，其中受损的肾状态包括肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植物 排斥或者对肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症或肾移植物排斥的治疗无响应。4. 权利要求1的方法，其中肾状态的评价包括测定肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移 植物排斥的进程。5. 权利要求1的方法，其中肾状态的评价包括测定患有肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或 肾移植物排斥且目前正在进行或已经进行过治疗的个体中的治疗响应。6. 权利要求1的方法，其中经测定等于或低于标准拷贝数的拷贝数预示良好的肾健 康。7. 权利要求1的方法，其中无细胞DNA提取自尿。8. 权利要求1的方法，其中测定提取自尿的无细胞DNA中的拷贝数。9. 权利要求1的方法，其中使用实时PCR、定量PCR或数字PCR测定拷贝数。10. 权利要求9的方法，其中使用BioMark实时PCR系统测定拷贝数。11. 权利要求1的方法，其中常染色体是染色体1。12. 权利要求11的方法，其中使用EIF2C1基因座测定染色体1的拷贝数。13. 权利要求8的方法，其中使用包含正向引物5' -GTTCGGCTTTCACCAGTCT和反向引物 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC 的引物组测定 EIF2C1 基因座。14. 权利要求13的方法，其中所述引物组用于实时PCR且进一步包括探针。15. 权利要求14的方法，其中所述探针包含如下的序列和报道基因：5' -HEX-CGCCCTGC CATGTGGAAGAT-BHQ1。16. 权利要求1的方法，还包括测定其它病理学和临床数据。17. 权利要求16的方法，其中该方法包括测定肌酸酐的量。18. 权利要求16的方法，其中该方法包括测定蛋白尿或cGFR。19. 权利要求16的方法，其中该方法包括进行肾活组织检查。20. 权利要求1的方法，其中所述个体是处于肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植 损伤或肾移植排斥的风险中的个体。21. 权利要求1的方法，其中所述个体是糖尿病患者。22. 权利要求1的方法，其中所述个体患有高血压。23. 权利要求1的方法，其中所述个体是同种异体移植物肾移植的接受者。24. 权利要求1的方法，其中所述个体处于肾移植物损伤或肾移植排斥的治疗中。25. 权利要求1的方法，其中所述个体患有至少一种急性排斥反应发作。26. 用于评价个体的肾状态的方法，包括： a. 测定尿样中的ALU重复单元数量；和 b. 比较ALU重复单元数量与来自正常群体的尿样中的标准ALU重复单元数量， 其中ALU重复单元数量的改变预示改变的肾状态。27. 权利要求26的方法，其中经测定高于标准重复单元数量的ALU重复单元数量预示 受损的肾状态。28. 权利要求27的方法，其中受损的肾状态包括肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移 植物排斥或者对肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症或肾移植物排斥的治疗无响应。29. 权利要求26的方法，其中肾状态的评价包括测定肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾 移植物排斥的进程。30. 权利要求26的方法，其中肾状态的评价包括测定患有肾脏病、肾损伤、肾移植损伤 或肾移植物排斥且目前正在进行或已经进行过治疗的个体中的治疗响应。31. 权利要求26的方法，其中经测定等于或低于标准ALU重复单元数量的ALU重复单 元数量预示良好的肾健康。32. 权利要求26的方法，其中无细胞DNA提取自尿。33. 权利要求26的方法，其中测定提取自尿的无细胞DNA中的ALU重复单元数量。34. 权利要求26的方法，其中使用实时PCR、定量PCR或数字PCR测定ALU重复单元数 量。35. 权利要求9的方法，其中使用BioMark实时PCR系统测定ALU重复单元数量。36. 权利要求26的方法，其中使用实时PCR测定ALU重复单元数量。37. 权利要求36的方法，其中使用ALU基因座的115碱基对扩增子测定ALU重复单元 数量。38. 权利要求26的方法，其中该方法进一步包括测定同一样品中常染色体的拷贝数。39. 权利要求38的方法，其中测定染色体1的拷贝数。40. 权利要求39的方法，其中使用EIF2C1基因座测定染色体1的拷贝数。41. 权利要求40的方法，其中使用包含正向引物5' -GTTCGGCTTTCACCAGTCT和反向引物 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC 的引物组测定 EIF2C1 基因座。42. 权利要求41的方法，其中所述引物组用于实时PCR且进一步包括探针。43. 权利要求42的方法，其中所述探针包含如下序列和报道基因：5' -HEX-CGCCCTGCCA TGTGGAAGAT-BHQ1〇44. 权利要求26的方法，还包括测定其它病理学和临床数据。45. 权利要求44的方法，其中该方法包括测定肌酸酐的量。46. 权利要求44的方法，其中该方法包括测定蛋白尿或cGFR。47. 权利要求44的方法，其中该方法包括进行肾活组织检查。48. 权利要求26的方法，其中所述个体是处于肾损害、肾损伤、肾脏病、肾病症、肾移植 损伤或肾移植排斥的风险中的个体。49. 权利要求26的方法，其中所述个体是糖尿病患者。50. 权利要求26的方法，其中所述个体患有高血压。51. 权利要求26的方法，其中所述个体是同种异体移植物肾移植的接受者。52. 权利要求26的方法，其中所述个体处于肾移植损伤或肾移植排斥的治疗中。53. 权利要求26的方法，其中所述个体患有至少一种急性排斥反应发作。54. 诊断试剂盒，该试剂盒包含： a.用于测定来自样品的至少一种常染色体的拷贝数的试剂； b.用于测定所述拷贝数的引物组；和 C.用于测定的使用说明书。55. 权利要求54的试剂盒，还包含用于从样品中提取无细胞DNA的试剂。56. 权利要求54的试剂盒，其中所述样品包含尿。57. 权利要求54的试剂盒，其中常染色体是染色体1。58. 权利要求57的试剂盒，其中所述引物组是能够扩增基因座EIF2C1的扩增子的组。59. 权利要求58的试剂盒，其中所述引物组包含正向引物5' -GTTCGGCTTTCACCAGTCT和 反向引物 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC。60. 权利要求54的试剂盒，其中所述引物组能够用于实时PCR、定量PCR或数字PCR。61. 权利要求59的试剂盒，其中所述引物组还包含可用于数字PCR的探针。62. 权利要求61的试剂盒，其中所述探针的序列包含如下序列和报道基因：5'-HEX-CG CCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。63. 诊断测定试剂盒，该试剂盒包含： a. 用于测定样品中ALU重复单元数量的试剂； b. 用于测定所述ALU重复单元数量的引物组；和 c. 用于测定的使用说明书。64. 权利要求63的试剂盒，其还包含用于从样品中提取无细胞DNA的试剂。65. 权利要求64的试剂盒，其中所述样品包含尿。66. 权利要求63的试剂盒，其中所述引物组是能够扩增ALU基因座的115碱基对扩增 子的组。67. 权利要求66的试剂盒，其中所述引物组包含正向引物 5' -GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3' 和反向引物 5' -ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'。68. 权利要求63的试剂盒，其中所述引物组能够用于实时PCR、定量PCR或数字PCR。69. 权利要求67的试剂盒，其中所述引物组还包含可用于数字PCR的探针。70. 权利要求69的试剂盒，其中所述探针的序列包含如下序列和报道基因：5' -HEXTCA AGCGATTCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3' 。71. 权利要求63的试剂盒，其中该试剂盒还包含能够测定常染色体拷贝数的引物组。72. 权利要求71的试剂盒，其中常染色体是染色体1。73. 权利要求72的试剂盒，其中所述引物组是能够扩增基因座EIF2C1的扩增子的组。74. 权利要求73的试剂盒，其中所述引物组包含正向引物5' -GTTCGGCTTTCACCAGTCT和 反向引物 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC。75. 权利要求74的试剂盒，其中所述引物组能够用于实时PCR、定量PCR或数字PCR。76. 权利要求74的试剂盒，其中所述引物组还包含可用于数字PCR的探针。77. 权利要求76的试剂盒，其中所述探针的序列包含如下序列和报道基因：5' -HEX-CG CCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
【专利摘要】本发明涉及使用尿的无细胞DNA评价肾状态和肾健康的非侵害性工具和方法。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105102634
【申请号】CN201480014636
【发明人】M·M·萨沃, T·西格迪尔
【申请人】伊穆科Gti诊治股份有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年3月15日
【公告号】CA2902006A1, WO2014145232A2, WO2014145232A3