免疫抑制剂导致的淋巴瘤形式）；电解质包括钙和磷 酸盐不平衡，其可能导致骨问题等和其它药物副作用，包括胃肠道炎症和胃和食道溃疡、多 毛症（慢性模式分布的过度毛发生长）、脱发、肥胖、痤疮、2型糖尿病、高胆固醇血症和骨质 疏松症。
[0080] 个体和/或患者群体
[0081] 本发明的组合物和方法适用于任何个体。在一个实施方案中，所述个体是患者。在 其它实施方案中，所述组合物和方法可以用于鉴定需要医学干预的个体亚群（例如患者）。
[0082] 在一些实施方案中，检查其尿CfDNA以便测定常染色体拷贝数、染色体1拷贝数或 ALU重复单元的数量的个体可以是处于发生肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植排斥风险 中的个体；患有肾脏病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植排斥的个体；需要治疗肾脏病、肾损 伤、肾移植损伤或肾移植排斥的个体，其肾病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植排斥已经进展 或其肾病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植排斥已经消退。在其它实施方案中，检查其尿CfDNA 以便测定常染色体拷贝数、染色体1拷贝数或ALU重复单元的数量的个体是已经接受肾移 植、异体移植物肾移植或具有肾病家族史的个体。在一个实施方案中，检查其尿cfDNA以便 测定常染色体拷贝数、染色体1拷贝数或ALU重复单元的数量的个体是患有肾移植后急性 排斥（AR)发作的个体。在其它实施方案中，检查其尿cfDNA以便测定常染色体拷贝数、染 色体1拷贝数或ALU重复单元的数量的个体是患有高血压（高血压）、患糖尿病、患有系统 性红斑狼疮或患有心血管疾病的个体。在其它实施方案中，所述个体超过50岁年龄、超过 55岁年龄、超过60岁年龄、超过65岁年龄、超过70岁年龄或超过75岁年龄。
[0083] 伸用方法
[0084] 本文提供通过检查尿cfDNA评价肾状态和评价肾健康的方法。本文还提供评价肾 移植患者中肾移植物排斥和肾移植物排斥的方法。
[0085] 本文特别地提供了检查个体的cfDNA的方法，以便鉴定处于发生肾移植损伤或肾 移植排斥症状风险中的个体；监测肾移植损伤或肾移植排斥进程；监测肾移植损伤或肾移 植排斥消退；监测个体对需要肾移植损伤或肾移植排斥治疗的个体治疗的响应；鉴定和/ 或预测肾移植损伤或肾移植排斥的风险；鉴定应开始或持续肾移植损伤或肾移植排斥的患 者亚群；评价肾移植损伤或肾移植排斥的治疗效能和/或鉴定应监测发生肾移植损伤或肾 移植排斥症状的患者的亚群。本文还特别地提供检查个体的cfDNA的方法，以便鉴定处于 发肾病或肾损伤生风险中的个体；监测肾脏病或肾损伤进程；监测肾病或肾损伤消退；监 测个体对肾病或肾损伤治疗的响应；鉴定和/或预测肾病或肾损伤发生的风险；鉴定应开 始或持续肾病或肾损伤治疗的患者亚群；评价肾病或肾损的治疗效能和/或鉴定应监测发 生肾脏病或肾损伤症状的患者的亚群。
[0086] 这种肾状态评价方法包括测定提取自来自个体的尿样中的cfDNA。
[0087] 在一个实施方案中，评价个体肾状态的方法包括测定尿样中的ALU重复单元的数 量和比较ALU重复单元的数量与来自正常群体的尿样中ALU重复单元的标准数量或与另外 预定的标准水平，其中ALU重复单元的数量改变预示改变的肾状态。如果经测定染色体1 的拷贝数高于标准拷贝数，则预示所述个体的受损的肾状态。如果经测定染色体1的拷贝 数等于或低于标准拷贝数，则预示良好的肾健康。
[0088] 在另一个实施方案中，评价个体肾状态的方法包括测定尿样中任意染色体的拷贝 数和比较该染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样中该染色体的拷贝数或与另外预定的 标准水平，其中拷贝数改变预示改变的肾状态。如果经测定染色体的拷贝数高于标准拷贝 数，则预示所述个体的受损的肾状态。如果经测定染色体的拷贝数等于或低于标准拷贝数， 则预示良好的肾健康。
[0089] 在另一个实施方案中，所述方法用于评价个体的肾状态，包含测定尿样中染色体 1、染色体2、染色体3、染色体4、染色体5、染色体6、染色体7、染色体8、染色体9、染色体10、 染色体11、染色体12、染色体13、染色体14、染色体15、染色体16、染色体17、染色体18、染 色体19、染色体20、染色体21、染色体22、染色体X和/或染色体Y的拷贝数和将所述染色 体的拷贝数与来自正常群体的尿样的染色体的标准拷贝数或另外的预定标准水平比较，其 中拷贝数的改变预示改变的肾状态。如果经测定的染色体的拷贝数高于标准拷贝数，则预 示所述个体的受损的肾状态。如果经测定染色体的拷贝数等于或低于标准拷贝数，则预示 良好的肾健康。
[0090] 在另一个实施方案中，评价个体肾状态的方法包括测定尿样中任意常染色体的拷 贝数和比较任意染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样中该染色体的拷贝数或与另外预 定的标准水平，其中拷贝数改变预示改变的肾状态。如果经测定常染色体的拷贝数高于标 准拷贝数，则预示所述个体的受损的肾状态。如果经测定常染色体的拷贝数等于或低于标 准拷贝数，则预示良好的肾健康。
[0091] 在另一个实施方案中，评价个体肾状态的方法包括测定尿样中任意性染色体的拷 贝数和比较任意染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样中该染色体的拷贝数或与另外预 定的标准水平，其中拷贝数改变预示改变的肾状态。
[0092] 在另一个实施方案中，评价个体肾状态的方法包括测定尿样中染色体1的拷贝数 和比较任意染色体的拷贝数与来自正常群体的尿样中染色体1的拷贝数或与另外预定的 标准水平，其中染色体1的拷贝数改变预示改变的肾状态。如果经测定染色体1的拷贝数 高于标准拷贝数，则预示所述个体的受损的肾状态。如果经测定染色体1的拷贝数等于或 低于标准拷贝数，则预示良好的肾健康。
[0093] 用于宙量无细朐、测宙染色体拷贝数和ALU重复单元数量的方法
[0094] 在一个实施方案中，可以对来自个体的尿中定量cfDNA。可以通过任意标准方法由 本领域技术人员采集尿。例如，可以使用清洁收集方法得到尿。清洁收集方法是一种采集 尿的方法，其中患者用卫生擦拭纸擦拭生殖器，弃去第一部分尿并且随后在排尿过程中将 中流尿采集在无菌杯中。使用这种方法，采集50-100mL尿，且然后以2000xg离心20分钟。 从5mL上清液中纯化循环的cfDNA并且使用QIAamp循环核酸试剂盒（Qiagen)、按照制造商 的说明浓缩。
[0095] 在另一个实施方案中，可以从个体血浆中对循环cfDNA定量。可以通过由本领 域技术人员实施的任意标准方法采集血浆。在这样的实施方案中，可以纯化cfDNA并且 使用QIAamp循环核酸试剂盒（Qiagen)或类似产品浓缩。然后可以对得自尿或血浆的总 cfDNA定量。一种定量总cfDNA的方法通过使用Quant-It? PicoGreen dsDNA试剂和试剂 盒（Invitrogen)、按照制造商的说明和 Clinica Chimica Acta(327(2003)95_101，Chen 等 人，（2003))中提供的方案进行。在一个实施方案中，对来自尿样的总cfDNA定量。在另一 个实施方案中，对来自血浆的总cfDNA定量。
[0096] 在另一个实施方案中，测定染色体的拷贝数或ALU重复单元的数量。在一些实施 方案中，为了测定这种拷贝数和ALU重复单元，使用实时PCR、定量PCR和/或数字PCR。在 其它实施方案中，使用这样的方法，例如荧光原位杂交、比较基因组杂交和基于阵列比较基 因组杂交（aCGH)和SNP阵列技术的基于高分辨率阵列的测定法。
[0097] 在一个实施方案中，数字PCR可以用于测定任意染色体的拷贝数或任意常染色体 的拷贝数或任意性染色体的拷贝数。更具体地，数字PCR可以用于测定染色体1、染色体2、 染色体3、染色体4、染色体5、染色体6、染色体7、染色体8、染色体9、染色体10、染色体11、 染色体12、染色体13、染色体14、染色体15、染色体16、染色体17、染色体18、染色体19、染 色体20、染色体21和/或染色体22的拷贝数。类似地，数字PCR可以用于测定染色体Y或 染色体X的拷贝数。在一个实施方案中，数字PCR可以用于测定染色体1的拷贝数。在另 一个一般性的实施方案中，数字PCR可以用于测定样品中ALU重复单元的数量。
[0098] 在一个实施方案中，能够进行字PCR、实时PCR或定量PCR的引物组扩增至少20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、 140、145、150、155、160、165、170、175、180、190、200、210、220、230、250 或 300 个碱基对的扩 增子。在另一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或定量PCR的引物组扩增不超过 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、 135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、190, 200、210、220、230、250 或 300 个碱基对 的扩增子。在本文的任意实施方案中，扩增子可以是选自本文上述下限和上限的任意值的 范围。在一个具体的实施方案中，扩增子是81个碱基对长度。在另一个具体的实施方案中， 扩增子是84个碱基对长度。在另一个具体的实施方案中，扩增子是115个碱基对长度。
[0099] 在一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或定量PCR的正向引物、反向引 物或探针是富含GC的。在一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或定量PCR的正 向引物，反向引物或探针不富含GC。在另一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或 定量 PCR 的引物组是至少富含 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60 %、65 %、70 %、75 %或80 % GC的。在另一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或 定量 PCR 的引物组不超过 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65%、70%、75%或80%富含6(：。
[0100] 在一个实施方案中，能够进行数字PCR、实时PCR或定量PCR的正向引物、反向引 物或探针是至少 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、40、45、50、55或60个碱基对长度。在一个实施方案中，能够进行数字PCR、 实时PCR或定量PCR的正向引物、反向引物或探针是不超过10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55 或 60 个碱基对长 度。
[0101] 在一个具体的实施方案中，数字PCR可以用于测定ALU重复单元的数量。为了 进行这样的实施方案，使用适合于扩增所关注的基因座的扩增子的引物和探针制备具 有 Rox(Roche)的 FastStart TaqMan Probe Master Mix。在一个实施方案中，为了扩 增ALU基因座，可以使用如下引物组：正向引物5' -GGAGGCTGAGGCAGGAGAA-3' ；反向引 物 5' -ATCTCGGCTCACTGCAACCT-3' 和探针 5' - (FAM) CGCCTCCCGGGITCAAGCG-3'。在另一 个实施方案中，为了扩增115个碱基对的ALU基因座，可以使用如下引物组：正向引物 5' -GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3' ；反向引物 5' -ATCTCGGCTCACTGCAAC-3' ；和探针 5' -HEXTCAA GCGATTCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3' 。
[0102] 在另一个具体的实施方案中，数字PCR可以用于测定染色体1的拷贝 数。为了进行这样的实施方案，使用适合于扩增所关注的基因座的扩增子的引物和 探针制备具有 Rox (Roche)的 FastStart TaqMan Probe Master Mix。在一个实施 方案中，为了扩增染色体1上基因座EIF2C1的81个碱基对的扩增子，可以使用如 下：正向引物 5' -GITCGGCTITCACCAGTCT ;反向引物 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC ;探针 HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
[0103] 在另一个具体的实施方案中，数字PCR可以用于测定染色体Y的拷贝数。为了 进行这样的实施方案，使用适合于扩增所关注的基因座的扩增子的引物和探针制备具有 Rox(Roche)的 FastStart TaqMan Probe Master Mix。在一个实施方案中，为了扩增染色 体Y上基因座DYS 14(多拷贝基因座）的84个碱基对的扩增子，可以使用如下引物组：正 向引物 5' -ATCGTCCAITTCCAGAATCA ;反向引物 5' -GITGACAGCCGTGGAATC ;探针：5' -FAM-TGCC ACAGACTGAACTGAATGATTTTC-BHQ1。
[0104] 在另一个具体的实施方案中，数字PCR可以用于测定染色体Y的拷贝数。为了 进行这样的实施方案，使用适合于扩增所关注的基因座的扩增子的引物和探针制备具有 Rox(Roche)的FastStartTaqManProbeMasterMix。在一个实施方案中，为了扩增所关注 的染色体Y上基因座SRY(多拷贝基因座）的84个碱基对的扩增子，可以使用如下引物组： 正向引物 5'-CGCTTAACATAGCAGAAGCA;反向引物 5'-AGITTCGAACTCTGGCACCT;和探针 5'-FAM -TGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACA-BHQ1。
[0105] 可以使用BioMark实时PCR系统（Fluidigm)将为数字PCR制备的样品负载在 12. 765数字阵列芯片上。可以使用数字PCR分析软件v3.0提取和评估数据。每种染色体 的拷贝数可以使用如下等式计算：（382/组/4. 59 y 1/组）X(8 y 1反应混合物/I y I DNA) =原始样品中的拷贝数/yl。
[0106] 可以定量并且表示一种染色体的拷贝数与另一种染色体的拷贝数之间、一种染色 体上的一种基因座与同一染色体上的另一种基因座之间或一种染色体的拷贝数与ALU重 复单元的数量之间的相关性。可以建立这种相关性以便测定特定引物组检测肾病、肾损伤、 肾移植损伤或肾移植排斥的灵敏性和可预测性。还可以建立这种相关性以便优化用于特定 体液或样品的引物组。
[0107] 如上所述，可以使用尿和/或血浆样品对总CfDNA、至少一种染色体的拷贝数、至 少一种常染色体的拷贝数、染色体1的拷贝数、至少一种性染色体的拷贝数进行定量和测 定或对ALU重复单元的数量进行定量并且与尿蛋白的测定组合。在一个具体的实施方案 中，尿蛋白是肌酸酐。此外，可以使用尿和/或血浆样品对总cfDNA、至少一种染色体的拷贝 数、至少一种常染色体的拷贝数、染色体1的拷贝数、至少一种性染色体的拷贝数进行定量 和测定或对ALU重复单元的数量进行定量并且与测定其它病理学和临床数据组合。这样的 病理学和临床数据包括、但不限于医学成像、其它血液试验、肾活组织检查、肾小球滤过率 (GFR)测定（每分钟过滤的血浆水量）、校正的GFR(cGFR)测量使用体表面积的校正因子的 GFR)、蛋白尿测定等。
[0108] 标准水平
[0109] 如本文提供的方法用于评价个体的肾状态，部分地通过测定尿样中至少一种染色 体的拷贝数、测定至少一种常染色体的拷贝数、测定至少性染色体的拷贝数、特别地测定染 色体1的拷贝数、特别地测定染色体Y的拷贝数、测定ALU重复单元的数量和比较该数量与 来自正常群体的尿样