专利名称：抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫化学技术领域，尤其涉及一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备 方法及其用途。
背景技术：
氟喹诺酮类(fluoroquinolones，FQNS或FQS)药物属第三代喹诺酮类抗菌药，发 明于20世纪80年代，是在喹诺酮萘啶环的6位处引入了氟原子，7位上都连有哌嗪环，因而 又统称氟喹诺酮类，是一系列新型氟取代的喹诺酮类衍生物。FQNS具有吸收好，半衰期长，抗菌谱广等优点，已成为兽医临床常用药品。但由于 该类药物长期和广泛的应用，造成畜产品中药物大量残留，引起了一系列的负面影响，不仅 直接危害人类健康，而且不利于养殖业的健康发展及畜禽产品出口。包括中国在内的很多 国家都针对某一具体FQNS在动物性食品中的使用而制定了最高残留限量(MRL)，其残留问 题已引起广泛的关注。近年来随着氟喹诺酮类药物在临床上的大量广泛使用，其残留问题也越来越严 重。在国内外用于FQNS药物残留检测的方法较多，有微生物法、免疫分析测定法、高效液相 色谱法、高效毛细管电泳法、薄层色谱法、荧光分光光度法等。免疫分析测定法适用于大规 模检测和筛选。ELISA方法灵敏度较高，特异性较强，测定方法简单快速，可同时筛选大量样 品。目前常将ELISA法作为筛选法，高效液相色谱_质谱法作为确证方法配套使用。兔单克隆抗体较常规的鼠单克隆抗体具有更多优点。首先，兔子相比于小鼠能识 别更多免疫抗原的表位。其次，由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛 选融合细胞成为可能。本发明通过杂交瘤技术得到抗氟喹诺酮大类兔单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途。抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法的步骤如下1)将30mg环丙沙星、45mg N-羟基琥珀酰亚胺和150mg碳二亚胺盐酸溶解于 1.5mL 二甲基甲酰胺中，避光搅拌反应24h，得到环丙沙星反应液；将牛血清白蛋白lOOmg， 溶解于15mL磷酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将环丙沙星反应液滴加到牛血清白 蛋白溶液中，搅拌反应3h，用磷酸盐缓冲液透析，得到环丙沙星免疫抗原，-20°C存放；氧氟 沙星免疫抗原、恩诺沙星免疫抗原与环丙沙星免疫抗原合成方法相同；2)将氟甲喹40mg溶解于Iml的二甲基甲酰胺和Iml 二氧六环中，4°C预冷后，加 入30 μ 1三丁胺，冰浴10分钟后加入40 μ 1氯甲酸异丁酯，反应20分钟，得到氟甲喹溶液 反应液；将80mg牛血清白蛋白溶解于SmlpH 9. 6碳酸缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将 氟甲喹溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得 到氟甲喹免疫抗原，_20°C保存；3)将达氟沙星40mg溶解于3ml 二甲基甲酰胺和Iml 二氧六环中，4°C预冷后，加入30 μ 1三丁胺，冰浴10分钟后加入40 μ 1氯甲酸异丁酯，暗处反应60分钟，得到达氟沙星溶 液反应液；将60mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH9. 6碳酸缓冲液，得到牛血清白蛋白溶液，将 达氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析， 得到达氟沙星免疫抗原，-20°C保存；4)将诺氟沙星40mg溶解于2ml 二甲基甲酰胺和2ml 二氧六环中，4°C预冷后，加 入30 μ 1三丁胺，冰浴10分钟后加入40 μ 1氯甲酸异丁酯，反应60分钟，得到诺氟沙星溶 液反应液；将IOOmg牛血清白蛋白、167mg碳二亚胺盐酸、167mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解于 8ml去离子水中，再加入2ml乙二胺，4°C反应12h，得到牛血清白蛋白溶液；将诺氟沙星溶液 反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到诺氟沙星免疫 抗原，-20°C保存；5)将上述合成的六种免疫抗原，采用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血 2ml，第一次免疫将六种免疫抗原各0. 5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至 第五次免疫将六种免疫抗原各0. 25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫间隔 两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4-8周内，将六种免疫抗原各0. 5mg混和后静脉注 射，注射后4天杀兔子，取脾备用；6)无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为在培养皿中去除脾脏周 围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640 培养液悬浮后离心，1400rpm, 5min ；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少 量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2X108个脾淋巴细胞 的悬液备用；7)将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传 代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫兔子的脾细胞融 合，融合剂为50%的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；8)融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细 胞培养板中，置37°C、6% CO2培养箱内培养，2-3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA 法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间 接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细 胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克隆化，每个多克隆分装于3 块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳 性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分 泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一 份用于扩大培养生产氟喹诺酮类兔单克隆抗体；所述的将免疫兔子的脾脏细胞与240E细胞融合步骤为分别取2X IO8个脾淋巴 细胞和IX IO8个240E细胞混勻，加1640培养液后离心，弃上清，使两种细胞充分混勻成糊 状，37°C水浴预温，缓缓加入经37°C预温的50%聚乙二醇溶液，再加入经37°C预温的1640 培养液，使聚乙二醇稀释而失去作用。补加1640培养液后离心，弃上清，将融合后的细胞沉 淀悬浮于HAT培养液中；所述氟喹诺酮药物结构通式为
权利要求
抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于它的步骤如下1)将30mg环丙沙星、45mgN 羟基琥珀酰亚胺和150mg碳二亚胺盐酸溶解于1.5mL二甲基甲酰胺中，避光搅拌反应24h，得到环丙沙星反应液；将牛血清白蛋白100mg，溶解于15mL磷酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将环丙沙星反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应3h，用磷酸盐缓冲液透析，得到环丙沙星免疫抗原， 20℃存放；氧氟沙星免疫抗原、恩诺沙星免疫抗原与环丙沙星免疫抗原合成方法相同；2)将氟甲喹40mg溶解于1ml的二甲基甲酰胺和1ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，反应20分钟，得到氟甲喹溶液反应液；将80mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH9.6碳酸缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将氟甲喹溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到氟甲喹免疫抗原， 20℃保存；3)将达氟沙星40mg溶解于3ml二甲基甲酰胺和1ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，暗处反应60分钟，得到达氟沙星溶液反应液；将60mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH 9.6碳酸缓冲液，得到牛血清白蛋白溶液，将达氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到达氟沙星免疫抗原， 20℃保存；4)将诺氟沙星40mg溶解于2ml二甲基甲酰胺和2ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，反应60分钟，得到诺氟沙星溶液反应液；将100mg牛血清白蛋白、167mg碳二亚胺盐酸、167mg N 羟基琥珀酰亚胺溶解于8ml去离子水中，再加入2ml乙二胺，4℃反应12h，得到牛血清白蛋白溶液；将诺氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到诺氟沙星免疫抗原， 20℃保存；5)将上述合成的六种免疫抗原，采用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2ml，第一次免疫将六种免疫抗原各0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将六种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫间隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4 8周内，将六种免疫抗原各0.5mg混和后静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；6)无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后离心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2×108个脾淋巴细胞的悬液备用；7)将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫兔子的脾细胞融合，融合剂为50％的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；8)融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6％CO2培养箱内培养，2 3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克隆化，每个多克隆分装于3块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用于扩大培养生产氟喹诺酮类兔单克隆抗体；
2.根据权利要求1所述的一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于 所述的将免疫兔子的脾脏细胞与240E细胞融合步骤为分别取2X IO8个脾淋巴细胞和 1 X IO8个240E细胞混勻，加1640培养液后离心，弃上清，使两种细胞充分混勻成糊状，37°C 水浴预温，缓缓加入经37°C预温的50%聚乙二醇溶液，再加入经37°C预温的1640培养液， 使聚乙二醇稀释而失去作用，补加1640培养液后离心，弃上清，将融合后的细胞沉淀悬浮 于HAT培养液中；
3.根据权利要求1所述的一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于所 述氟喹诺酮药物结构通式为
4.一种如权利要求1所述的抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的用途，其特征在于用于制 备检测氟喹诺酮类药物残留的ELISA检测试剂盒；
5.一种如权利要求1所述的抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的用途，其特征在于用于制 备检测氟喹诺酮类药物多残留的胶体金检测试剂盒；
6.一种如权利要求1如所述的氟喹诺酮类兔单克隆抗体的用途，其特征在于用于检测食品、饲料及环境样品中的氟喹诺酮类药物的残留；
7.如权利要求4、5或6所述的一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的用途，其特征在于所 述的氟喹诺酮类药物为恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星及达氟沙星。
全文摘要
本发明公开了一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途。本发明选取氟喹诺酮类药物中的六种药物，分别与载体蛋白牛血清白蛋白偶联合成免疫抗原，混和六种免疫抗原采用背部皮下注射免疫兔子，经过杂交瘤技术，最终得到抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体。本发明制备的抗体为兔单克隆抗体，兔单克隆的制备优于鼠单克隆抗体。兔子相比于小鼠可以识别更多免疫抗原的表位。其次，兔脾脏较大可以进行更多的融合实验，使高通量筛选融合细胞成为可能。本发明的抗氟喹诺酮类抗体对恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星、达氟沙星等氟喹诺酮类药物都有很好的检测效果，具有广谱性。可用于食品、饲料及环境样品中的氟喹诺酮类药物的残留检测。
文档编号G01N33/577GK101983971SQ20101051418
公开日2011年3月9日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者倪庚, 刘娜, 郑晓冬, 陆蕾 申请人:浙江大学