专利名称：小麦矮秆基因串联重复片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小麦矮杆基因串联重复片段及其应用。
背景技术：
上个世纪60年代，由于小麦的矮杆基因在小麦生产中的广泛利用，使得小麦产量有了大幅度地提高，因此，小麦的矮杆基因Rht-Blb和Rht-Dlb被称为“绿色革命”基因。在小麦中发现了 21个矮杆基因，从Rht I到Rht21 (http: / / wheat, pw. usda. gov/GG2/Triticum/wgc/2008/GeneSymbol. pdf)，其中四个，Rht-Blb (Rhtl), Rht-Blc (Rht3)，Rht-Dlb (Rht2)以及Rht-Dlc(RhtlO)是对赤霉素不敏感的，其余的基因对赤霉素敏感。Rht-Blb和Rht-Dlb分别定位在4BS和4DS上，这两个基因被广泛地应用到小麦育种中。Rht-Blb和Rht-Dlb克隆后，发现它们编码DELLA蛋白，而DELLA蛋白是赤霉素信号转导通路中的一个负调控因子，抑制植物的生长。当赤霉素缺失的时候，DELLA蛋白抑制着赤霉素 相应的基因，导致了依赖赤霉素成长的植株生长缓慢；相反，当有赤霉素的时候，GA信号通过一种尚未发现的磷酸酶和SCFsm的复合体诱导了 DELLA蛋白的磷酸化，从而使得DELLA蛋白被泛素化进一步被26S蛋白体降解。当DELLA蛋白部分缺失而变得很难降解时，比如拟南芥中的gai，它缺失了接近N端的17个氨基酸残基，植株就会表现出矮杆。在Rht-Dlb中有一个T到G碱基的突变，使得E61 (GGA)翻译成了终止密码子(TGA)，从而导致了 N端的缺失，含有该基因的植株也表现出半矮杆。除了缺失突变会造成矮杆现象以外，过量表达DELLA蛋白也会造成很强的致矮作用。低表达量的gal造成了轻微的矮化，而高表达量的gal则更大程度的矮化了株高，甚至是没有突变的GAI过量表达，也会有一定的降低株高的作用。矮变一号是西安农科所发现的一个自然突变体，株高只有25cm左右，是世界上最矮的小麦之一。矮变一号中的强降杆是Rht-Dlc(RhtlO)这个基因在起着作用，而这个基因被定位在4D染色体的短臂上，与Rht-Dlb是等位基因。在所有的小麦矮杆基因中，Rht-Dlc是降杆能力最强的一个。除了科学上的重要性，Rht-Dlc在小麦育种上也有重要的价值。ms2是完全显性的雄性不育基因，也定位在4D短臂上。刘秉华研究员将ms2和Rht-Dlc整合到了一起育成了著名的矮败小麦，败育的小麦同时具有矮杆和不育的表型，而高杆的后代是可育的。正因为不育的小麦是矮杆，因此在育种工作中很容易识别和授粉，尤其在轮回选择育种中。矮败小麦已经被证明是很有价值的育种材料，利用该材料目前已培育出了 42个新的小麦品种，推广面积I. 85亿亩，增产小麦56亿公斤，创造了重大的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明的一个目的是提供小麦矮杆基因串联重复片段形成的DNA分子。该DNA分子能够极强的降低小麦株高。本发明所提供的DNA分子，名称为Rht-Dlb: : Rht-Dlb，来源于小麦，是由两个以上(如两个)的DNA片段串联而成的分子，具体可为如下I)或2)或3)的片段I)是如下I或II或III的DNA片段I由序列表中序列I的第2218-4089位(Rht-Dlb基因)所示的核苷酸序列组成的DNA片段；II由序列表中序列I的第1-4089位(Rht-Dlb启动子和Rht-Dlb基因)所示的核苷酸序列组成的DNA片段；III由序列表中序列I所示的核苷酸序列组成的DNA片段；2)与I)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具 有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交的分子。序列表中序列I的第1-2217位为启动子、第2218-4089位为Rht-Dlb基因、第4358-5152 位为 polyA。所述严格条件可为如下50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0· 5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0. I % SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS、0. 5MNa3POjP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC，O. I % SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,O. 5M Na3PO4和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，O. 5X SSC, O. 1% SDS 中漂洗；还可为50°C，在 7% SDS,O. 5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，O. I X SSC,
O.1% SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,O. 5M Na3POjP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65°C，0. I XSSC,O. 1% SDS中漂洗；也可为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 X SSC, O. 1% SDS 和 I X SSC, O. 1% SDS 各洗膜一次。含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述DNA分子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述DNA分子构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的DNA分子构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因,和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因,赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。所述重组载体具体可为pRht-DIb: Rht-Dlb: :pRht_Dlb:Rht_Dlb。本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将所述DNA分子导入目的植物中，得到株高低于所述目的植物的转基因植物。所述目的植物具体可为单子叶植物或双子叶植物，如小麦。 所述转基因植物理解为不仅包含将所述DNA分子转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该DNA分子，也可用常规育种技术将该DNA分子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述DNA分子可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果I)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35 %,优选为多于45 %,更优选为多于50%，最优选多于约60% ；2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明DNA分子的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明DNA分子进行连接。4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。在实际操作中，也可以将本发明DNA分子进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明DNA分子序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。可以启动Rht-Dlb基因表达的启动子也属于本发明的保护范围。该启动子,是如下a)或b)的DNA分子a)其核苷酸序列是序列表中序列I第1-2217位所示的DNA分子；b)与a)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有启动子活性的DNA分子。本发明的小麦矮杆基因串联重复片段形成的DNA分子可以显著降低小麦株高。实验证明转入Rht-Dlb: =Rht-Dlb基因的Bobwhite和CB037的T1代植株中纯合的Rht-Dlb: :Rht-Dlb植株的株高平均只有12cm，降杆率为78%。
图I为T1代转基因Bobwhite的株高表型(A)以及Rht-Dlb的表达量(B)0其中的I为纯合的双拷贝Rht-Dlb (Rht-Dlb: : Rht-Dlb)单株，2为杂合的双拷贝Rht-Dlb (Rht-Dlb: : Rht-Dlb)单株，3为杂合的单拷贝Rht-Dlb单株，4为野生型的Bobwhite0图2为矮变一号及其近等基因系的株高。其中，I为矮变一号，2为矮败/中国春中的矮株，3为矮败/中国春中的半矮株，4为中国春。图3为Rht-Dlb分子标记与含有Rht-Dlb或Rht-Dlc材料之间的关系。A图为Rht-Dlb分子标记在含有Rht-Dlb或Rht-Dlc材料中的扩增，其中I为矮变一号，2为矮败/中国春中的矮株，3为矮败/中国春中的半矮株，4为中国春，5为蚰包；B图为Rht-Dlb分 子标记与矮败/中国春近等基因系中株高为60cm左右的矮杆表型共分离；C图为Rht-Dlb分子标记与矮败/中国春近等基因系中株高为85cm左右的半矮杆表型共分离。图4为Rht-Dlb在矮变一号及其近等基因系等材料中的拷贝数。A图为通过EcoRV酶切，Rht-Dlb为探针的Southern blotting(箭头所指的为4D条带)，其中的I为矮变一号，2为矮败/中国春中的矮株，3为矮败/中国春中的半矮株，4为中国春，5为农林10号，6 为 CS N4AT4B，7 为 CS mono4BT24A，8 为 CS N4DT4B ；B 图为通过 real-timePCR 检测矮变一号等材料中Rht-Dlb的拷贝数，其中以500701ike gene序列为内参基因，其中的I为矮变一号，2为矮败/中国春中的矮株，3为矮败/中国春中的半矮株，4为中国春。图5为Southern blot结果检测出的大片段重复区域。图6为以中国春为参照的Rht-Dlb基因的表达差异。其中的I为矮变一号，2为矮败/中国春近等基因系中的矮株，3为矮败/中国春近等基因系中的半矮株，4为中国春。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、利用串联的两个Rht-Dlb即Rht-Dlb: :Rht-Dlb培育矮杆转基因小麦I、构建转小麦的表达载体(含有单拷贝Rht-Dlb的表达载体pRht-D IbiRht-Dlb和含有双拷贝Rht-Dlb的表达载体pRht-Dlb:Rht-Dlb: :pRht_Dlb:Rht-Dlb的构建)将Rht-Dlb基因序列前面连接其启动子区域后面连接来自pJIT163载体(http://www. pgreen, ac. uk/JIT/pJIT163. gb)的 polyA 整合成一个 Rht-Dlb 表达单元。我们一共构建了两个载体，都是将片段整合在PCAMBIA2200 (CAMBIA)载体上，其中一个称为单拷贝载体，只含有一个上述的单元，另一个称为双拷贝载体，含有两个上述的单元，以串联的形式连接在一起。构建单拷贝载体时，首先在启动子(2217bp)的上游引物接上一个Kpn I的接头，在Rht-Dlb基因(1872bp)下游引物接上一个SbfI的接头，在polyA(795bp)的上游引物接上一个SbfI接头，下游引物接上一个Kpn I的接头。在启动子和Rht-Dlb基因的连接处存在一个Hindi 11酶切位点，通过这个酶切位点，将扩增的启动子和基因连接在一起，并整合到同时被Kpn I和SbfI双酶切的载体pCAMBIA2200中，通过质粒在大肠杆菌中的扩增而富集。再通过Kpn I和SbfI双酶切将上述载体中的启动子和基因的片段切下来，再与polyA的片段相连，成为一个含有启动子，Rht-Dlb基因和polyA的大片段，除去大片段两端的Kpn I的接头该片段的长度为5152bp (其核苷酸序列如序列表中的序列I)。将序列I的5152bp连同两端Kpn I的接头插入pCAMBIA2200的Kpn I位点得到含有单拷贝Rht-Dlb的表达载体pRht-Dlb = Rht-Dlb。序列表中序列I的第1-2217位为启动子、第2218-4089位为Rht-Dlb基因、第4358-5152位为polyA。表达载体pRht_DIb:Rht-Dlb构建的具体方法如下(I)根据本实验室筛选的矮败/中国春BAC文库中的1J9上Rht2 (Rht-Dlb)上游序列设计引物扩增Rht2 (Rht-Dlb)基因的启动子序列，并在该上游引物加上一个Kpn I的接头，产物长度2229bp。
上游引物L9GGTACCTACGCGTTGGAATGCTGGACAA Tm60. 5 °C下游引物L7O-R CTTCATGATCCGCGAGCTATm55°C(2)根据BAC 1J9上Rht2 (Rht-Dlb)附近的序列设计引物扩增Rht2 (Rht-Dlb)基因的全长序列，并在该下游引物加上一个SbfI的接头，产物长度2212bp (此处扩增的是包含 Rht-Dlb 1872bp 的片段)。上游引物L71-F GGAACCGAGGCAAGCAATm 57°C下游引物L13-R CCTGCAGGGGATTACATTACTACATGCCGGT Tm 59 V(3)根据PJIT163载体的polyA的序列设计，并在该上游引物加上一个SbfI的接头，在下游引物上加上一个Kpn I的接头，产物长度809bp(含接头)。上游引物Sbfl-polyA-F CCTGCAGGATGGCGTGCAGGTCGACT Tm 53°C下游引物DpnI-po IyA-R GGTACCGATCTCTCGAGGATATCGC Tm 50 V(4)回收上述三种片段(全式金EG101)。(5)连接上述三种片段的回收产物到T载体上，并转化入大肠杆菌感受态细胞(全式金 CB111)。(6)提质粒，分别测序上述三种片段的单克隆，选取序列完全正确的单克隆。(7)将启动子区用 Kpn I 和 HindIII 双酶切，Rht2 (Rht-Dlb)用 SbfI 和 HindIII双酶切，polyA用Kpn I和SbfI双酶切。(8)回收酶切片段。(9)将回收的启动子与Rht2 (Rht-Dlb)连接。(10)再将(9)中这个大约4500bp的片段连接在已经被Kpn I和Sbf I双酶切的载体pCAMBIA2200上，并转化入大肠杆菌中。(11)大量提取(10)中的质粒，Kpn I和Sbf I双酶切该质粒，回收酶切片段，使酶切片段的量达到连接的水平。(12)连接(11)中的片段和Kpn I和Sbf I双酶切后的polyA，形成一个5kb大小左右的大片段，将连接的片段回收，再与Kpn I单酶切的载体PCAMBIA2200再连接，得到含有单拷贝Rht-Dlb的表达载体pRht-Dlb:Rht-Dlb。该载体pRht_Dlb:Rht-Dlb含有由启动子、Rht-Dlb基因和polyA组成的长度为5152bp (其核苷酸序列如序列I)的大片段。将该5152bp的DNA片段命名为单拷贝Rht-Dlb表达盒用“Rht-Dlb”表示。将载体pRht-Dlb: Rht-Dlb 转入大肠杆菌 DH5 α。序列表中的序列I的第1-2217位为启动子、第2218-4089位为Rht-Dlb基因、第4358-5152 位为 polyA。
构建双拷贝载体pRht-DIb:Rht-Dlb: :pRht-DIb:Rht-Dlb时，一方面将上述的单拷贝载体pRht-DIb = Rht-Dlb用Kpn I完全酶切，回收含有启动子、Rht-Dlb基因和polyA的大片段，另一方面将单拷贝载体pRht-Dlb: Rht-Dlb用Kpn I不完全酶切，即只将单拷贝载体pRht-D lb: Rht-Dlb由环形的质粒切成带有Kpn I粘性末端的线性质粒,最后将回收的大片段与这线性的质粒连接起来，获得的载体含有两个串联的5152bp片段，该载体为pRht-DIb: Rht-Dlb: : pRht-DIb: Rht-Dlb。将pRht-Dlb: Rht-Dlb: : pRht-DIb: Rht-Dlb 中所含的由两个5152bp DNA片段(其核苷酸序列如序列I)通过Kpn I位点串联形成的双拷贝命名为双拷贝 Rht-Dlb 表达盒用 “Rht-Dlb::Rht-Dlb” 表示。2、小麦的农杆菌遗传转化将构建好的载体pRht-DIb: Rht-Dlb 和 pRht-Dlb: Rht-Dlb: :pRht_Dlb:Rht_DIb 分别转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens strain C58C1) (Ashby A. Μ.,Watson M. D. ,Loake GJ. ,et al. , Ti plasmid-specified chemotaxis of Agrobacterium tumefaciens C58Cltoward vir—inducing phenolic compounds and soluble factorsfrom monocotyledonous anddicotyledonous plants. J Bacteriol,1988. 170(9)4181-7.),以农杆菌侵染的方式转入普通小麦Bobwhite (Weeks JT, Anderson OD, BlechlAE. Rapid Production of MultipleIndependent Lines of Fertile TransgenicWheat(Triticum aestivum). Plant Physiol. 1993,102(4) 1077-1084. http://genbank.vurv. cz/wheat/pedigree/krizeni2. asp id = 8104)(本身不含 Rht-Dlb)和 CBO37 (韩晓峰，叶兴国，刘晓蕾，魏亦勤，杜丽璞，王轲，佘茂云，樊明，晏月明.小麦花药培养后代和杂交后代中高分子量麦谷蛋白亚基变异分析.植物遗传资源学报2010，11 (6) :6712677.)(自身带有Rht-Dlb)中。表达载体构建完成后，经过酶切与测序验证其正确性后，取1μ I构建好的表达载体质粒电击转化进入20μ 1C58C1农杆菌感受态细胞中，然后用ImlYEB液体培养基28 V 250rpm恢复培养3h，取10 μ I菌液涂布于YEB抗性平板上(氯霉素50mg/L，利福平Rif 50mg/L)，于28°C培养2 3天。提取农杆菌的质粒进行目标基因的PCR检测，阳性菌液保存于-70°C超低温冰箱中备用。将阳性菌液扩大培养，然后侵染小麦品种Bobwhite和CB037的幼胚愈伤组织，用G418抗性筛选愈伤，并进一步培养分化成幼苗，然后移栽大田。3、阳性转化植株的鉴定及后代株高表型调查通过PCR检测得知，127株Ttl代Bobwhite中有15株(12% )为阳性植株，107株TtlRCBOS 中有24株(22% )为阳性单株(表I)。结果表明，Ttl代中，Rht-Dlb:: Rht-Dlb所形成降杆效应大约为33-34%，大大降低了株高。鉴定Ttl 和 T1 是通过弓丨物 polyA :5’ -ATGGCGTGCAGGTCGACT-3’ 和5’ -GATCTCTCGAGGATATCGC-3’ 鉴定。表I Ttl代植株的株高
权利要求
1.DNA分子，是由两个以上的DNA片段串联而成的分子，其特征在于所述DNA片段为如下I)或2)或3)的片段 1)是如下I或II或III的DNA片段 I由序列表中序列I的第2218-4089位所示的核苷酸序列组成的DNA片段； II由序列表中序列I的第1-4089位所示的核苷酸序列组成的DNA片段； III由序列表中序列I所示的核苷酸序列组成的DNA片段； 2)与I)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交的分子。
2.含有权利要求I所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将所述DNA分子插入pCAMBIA2200得到的重组表达载体。
4.根据权利要求2或3所述的重组载体，其特征在于所述重组载体中，启动权利要求I所述DNA分子转录的启动子为如下a)或b)的启动子 a)其核苷酸序列是序列表中序列I第1-2217位所示的DNA分子； b)与a)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有启动子活性的DNA分子。
5.ー种培育转基因植物的方法，是将权利要求I所述的DNA分子导入目的植物中，得到株高低于所述目的植物的转基因植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述单子叶植物为小麦。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于权利要求I所述的DNA分子通过权利要求2-4中任一所述的重组载体导入目的植物中。
9.ー种DNA分子，是如下a)或b)的DNA分子 a)其核苷酸序列是序列表中序列I第1-2217位所示的DNA分子； b)与a)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有启动子活性的DNA分子。
10.含有权利要求9所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
全文摘要
本发明公开了一种小麦矮秆基因串联重复片段及其应用。该DNA分子是由两个以上的如下I或II或III的DNA片段串联而成的分子I由序列表中序列1的第2218-4089位(Rht-D1b基因)所示的核苷酸序列组成的DNA片段；II由序列表中序列1的第1-4089位(Rht-D1b启动子和Rht-D1b基因)所示的核苷酸序列组成的DNA片段；III由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA片段。本发明的小麦矮秆基因串联重复片段形成的DNA分子可以显著降低小麦株高。
文档编号C12N5/10GK102776179SQ20111012313
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者孔秀英, 李异媛, 肖建会, 贾继增 申请人:中国农业科学院作物科学研究所