专利名称：水稻丝氨酸羟甲基转移酶蛋白及其编码基因的功能的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。特别是涉及水稻丝氨酸羟甲基转移酶蛋白及其编码基因的功能。具体地说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻基因编码丝氨酸羟甲基转移酶I(OsSHMl)基因，以及利用转基因实验鉴定该基因的功能。
背景技术：
丝氨酸羟甲基转移酶(SerineHydroxymethyltransferase, SHMT)是一种 5，磷酸吡哆醛(PLP)为辅酶的吡哆醛酶，它在高等植物的一碳代谢和光呼吸中起着非常重要的作用。真核生物中存在两种类型的SHMT，即胞质丝氨酸羟甲基转移酶(Cytosolic Serine Hydroxymethyltransferase, cSHMT)和线粒体丝氨酸羟甲基转移酶(Mitochondrial Serine Hydroxymethyltran sferase, mSHMT) 而原核生物中只有 cSHMT。SHMT 在植物中的主要功能是在蛋白质和嘌呤的生物合成中提供Gly，并为Cl库提供N5，N10-亚甲基四氢叶酸。植物如果缺少SHMT，通常会导致严重的生长延迟。在拟南芥中已发现7个编码SHMT的基因，与原核生物相比，植物中的SHMT功能发生了分化。研究表明只有SHMTl的表达受到光的诱导，所以很可能只有SHMTl在光呼吸代谢中发挥其生理功能。其中突变体shmtl-Ι，其SHMT活性只有野生型的15%，既不能将甘氨酸脱羧释放C02，也不能将甘氨酸转变为丝氨酸，光呼吸条件下叶片甘氨酸大量积累，含量是野生型的40多倍。在逆境条件下，shmtl突变体表现为对逆境敏感，植株萎黄，叶片坏死等。目前，对植物丝氨酸羟甲基转移酶基因的功能研究还很不深入，尤其对光呼吸的作用还有很多争论。水稻中，还未见丝氨酸羟甲基转移酶及其基因的相关报道，由于缺少水稻丝氨酸羟甲基转移酶基因的突变体，难以对该基因进行深入的功能研究。本发明人通过长期艰苦的研究，发现了水稻中SHMl的同源蛋白OsSHMl的关键位点，通过突变OsSHMl关键位点获得苗期花斑叶致死突变体，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供了一种水稻苗期花斑叶致死基因OsSHMl，该基因具有SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列。优选地，上述SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列中可以添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸形成SALl衍生物，该OsSHMl衍生物与水稻苗期花斑叶致死基因OsSHMl具有相同的功能。优选的，SEQ ID NO 1的第1300位的“C”突变为“T”。本发明还提供了一种水稻苗期花斑叶致死基因编码的蛋白质，该蛋白质由SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列编码，其具有SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列。优选地，上述SEQ ID N0. 2的氨基酸序列中可以添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列，从而生成氨基酸序列的衍生物。优选第434位的丝氨酸发生错义突变，更优选地，丝氨酸错义突变为亮氨酸。
本发明还提供了一种培育植物苗期致死突变的方法，该方法包括用SEQ ID NO 1 所示的核苷酸序列转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株，其中植物细胞优选为水稻、大麦、小麦、玉米、高粱或甘蔗细胞，尤其优选为水稻细胞。 本发明还提供了一种培育水稻苗期致死突变的方法，该方法包括用含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的质粒转化水稻细胞，再将转化的细胞培育成植株，其中质粒含有上述基因序列SEQ ID NO :1ο本发明还提供了一种培育水稻苗期致死突变的方法，该方法包括用含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的表达载体转化水稻细胞，再将转化的细胞培育成植株，其中表达载体含有上述基因序列SEQ ID NO :1。本发明还提供了一种培育水稻苗期致死突变的方法，该方法包括用含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的表达载体转化植物细胞，再将转化的细胞培育成植株，其中表达载体含有上述基因序列SEQ ID NO :1。其中植物细胞优选为水稻、大麦、小麦、玉米、高粱或甘蔗细胞。本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有基因序列SEQ ID NO 1或其衍生物。其中宿主细胞可以是大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。本发明的水稻苗期致死基因OsSHMl (SEQ ID NO :1)是从水稻苗期花斑叶突变体 lzs(lethal zebra seedling)中分离出来，并通过遗传分析确定控制突变体的突变性状。本发明的上述从苗期花斑叶致死突变体中克隆的新基因，对该位点进行突变可以获得苗期致死表型，在杂交制种提纯和种子知识产权保护中具有广阔的应用前景。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。
图1是Izs突变体的表型分析。左面的植株是野生型，右面的植株是Izs突变体；图2是LZS基因在水稻第3染色体上的初步定位图3是LZS基因在水稻第3染色体上的精细定位图4是载体pCAMBIA301-LZS的物理图谱
图5是CAPS标记设计示意6是转基因植株分子检测图，WT为野生型，MT为纯合突变体图7是转基因阳性纯合植株，左边为非转基因对照，右边为转化植株图8是Izs突变体的叶片光合色素含量图9是Izs突变体的光合作用图10是Izs突变体的酶活。POD为过氧化物酶，SOD为超氧化物歧化酶，CAT为氧化氢酶，MAD为丙二醛。
具体实施例方式为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。实施例1、LZS基因的图位克隆1、水稻Izs突变体的分离和遗传分析
突变体是从中花11组培后代中发现的，从二叶期开始，新叶发白，至三叶期叶片逐渐枯死(附图1)。Tl代，野生型表型植株与突变体植株的分离比为35 13，符合 3 Kx2c = O. 03 < X 2U5 = 3. 84)的分离关系，单株收获Tl代种子，随机选取10个单株种植T2代，T2代株系中3个株系植株表现野生型表型，不再分离，7个株系的植株表型发生了分离，野生型表型植株与突变体植株的分离比例符合3 1的分离关系，提示该突变体受一对隐性核基因控制。2、水稻OsSHMl基因的克隆(1)定位群体构建由于突变体Izs苗期致死，不能获得纯合的种子与籼稻亲本杂交获得F2分离群体用于基因定位，只能利用杂合体与籼稻亲本杂交获得F2代定位群体。即在T1代分离群体中，从存活的植株中随机选取6株挂牌，分别与籼稻品种龙特甫B杂交获得Ftl种子，同时单株收获挂牌的自交种子并种植T2代以鉴定T1单株的基因型。如果T2代株系不出现分离， 表明T1代单株的基因型为纯合野生型，弃掉该单株与龙特甫B杂交的Ftl种子；如果自交种子种植的T2代株系出现分离，表明该T1代单株的基因型为杂合体。种植该单株与龙特甫B 杂交的Ftl种子获得Fl植株，单株收获F1植株种子，种植得F2代，约1/2的株系出现表型分离，选择其中为Izs表型的单株提取DNA用于基因定位。(2)基因定位和克隆选取120个均勻分布在水稻12条染色体在两亲本间有多态性的SSR标记，以 BSA法建成的绿苗DNA池和突变DNA池(各10株DNA等量混合)，利用上述120个有多态的SSR标记对两池进行多态性分析，位于第3染色体长臂的SSR标记RM8277(127. 7cM)、 RM6090 (144. 5cM)和RM570有强烈的偏态扩增。随后利用RM8277和RM6090及其附近的SSR 标记RM5813，RM8269, RM3867对其中的93个单株进行了扩增，发现LZS与上述标记紧密连锁，将LZS定位在和RM8277(127. 7cM)和RM5813(139. 8)之间，随后利用公布的SSR序列在 RM8277(127. 7cM)和RM5813(139. 8)之间选取10对SSR引物，其中5对在两亲本之间有多态性，利用这5对引物进一步对上述93个单株进行扩增，进一步将LZS定位在RM15857和 RM15887之间，与两标记之间的遗传距离分别相距1. IcM和0. 5cM(附图2)为了进一步构建与目标基因更紧密的连锁图谱，提取F2群体中全部645株突变体幼苗的DNA进行进一步的精细定位，利用RM15857和RM15887筛选全部645个单株，其中 RM15857有21个单交换单株，RM15887有8个单交换单株。根据公布的粳稻日本晴与籼稻 9311序列比对分析结果，在RM15857和RM15887标记之间发展了 16个STS标记，利用这些标记对亲本中花11和龙特甫B进行差异分析，共有14个能扩增出单条带，其中8个在亲本间表现出多态性，利用这8对标记对RM15857和RM15887筛选出的交换单株进行扩增，将 OsSHMl进一步定位在RH3-17和RH3-21之间，与RH3-20共分离，RH3-17和RH3-21两个标记位于两个相互重叠的BAC上，物理距离约为49kb (附图3a)。在亲本间表现出多态性的引物
权利要求
1.一种水稻苗期花斑叶致死基因，该基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其中SEQID NO :1所示的核苷酸序列中可以添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸形成SALl衍生物，其与水稻苗期花斑叶致死基因具有相同的功能。
3.根据权利要求2所述的基因，其中SEQID NO :1的第1300位的“C”突变为“T”。
4.一种水稻苗期花斑叶致死基因编码的蛋白质，该蛋白质由SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列编码，其具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其中SEQID W). 2的氨基酸序列中可以添力Π、取代、 插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列，从而生成氨基酸序列的衍生物。
6.根据权利要求5所述的蛋白质，SEQID NO. 2中的第434位的丝氨酸发生错义突变， 突变为亮氨酸。
7.一种培育植物苗期致死突变的方法，该方法包括用SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株，其中植物细胞为水稻、大麦、小麦、玉米、 高粱或甘蔗细胞，尤其优选为水稻细胞。
8.一种培育水稻苗期致死突变的方法，该方法包括用含有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的质粒转化水稻细胞，再将转化的细胞培育成植株，其中质粒含有上述基因序列SEQ ID NO :1ο
9.一种培育植物苗期致死突变的方法，该方法包括用含有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的表达载体转化植物细胞，再将转化的细胞培育成植株，其中表达载体含有上述基因序列SEQ ID NO :1，其中植物细胞为水稻、大麦、小麦、玉米、高粱或甘蔗细胞。
全文摘要
本发明涉及一种水稻丝氨酸羟甲基转移酶蛋白及其编码基因的功能，其中该蛋白质具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，编码该蛋白质的基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明还公开了含有上述基因的质粒、植物表达载体和宿主细胞。本发明还公开了培育植物苗期致死的方法用上述植物表达载体转化植物细胞，再将转化的植物细胞培育成植株。本发明的从苗期花斑叶致死突变体中克隆的新基因，对该位点进行突变可以获得苗期致死表型，在杂交制种提纯和种子知识产权保护中具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/54GK102242135SQ20111012267
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月11日 优先权日2011年5月11日
发明者严松, 刘合芹, 李素娟, 汪得凯, 陶跃之 申请人:浙江省农业科学院