专利名称：一种非洲菊灰霉病抗性鉴定的方法
技术领域：
本发明属植物抗病性鉴定技术领域，具体涉及非洲菊灰霉病离体抗性鉴定的方法。
背景技术：
非洲菊(fer力era )是世界五大重要切花之一，其盆花的应用也越来越流行， 具有重要的经济价值。灰霉菌(彻iiriis是一种空气传播、适宜温度范围大 (4°C -25°C)、侵染200多种寄主的腐生菌，由灰霉菌引起的软腐病，严重危害非洲菊的生产、贮藏、运输等各个环节，尤其是在非洲菊切花采后贮藏、运输过程中，由于高湿、温度波动大产生结露等环境条件，给灰霉菌的滋生繁殖提供了良好的条件，灰霉菌引起的软腐病成为非洲菊切花采后质量保持的限制因子之一，灰霉菌侵染引起的软腐病给非洲菊切花导致的经济损失，直接的影响是侵染产品被拒绝进入采后供应链，间接的影响是被感染产品的观赏性状降低，极大的影响了产品的销售价格。大田生产发现，在非洲菊不同栽培品种中存在对灰霉菌软腐病的抗性差异。虽然可以通过控制栽培条件来降低灰霉菌软腐病的危害，但随着能源成本的升高，培育抗性品种是非洲菊育种、生产可持续发展的主要出路。抗性资源的准确鉴定筛选是抗性品种培育的首要条件，现有技术中对非洲菊灰霉病抗性鉴定常采用大田活体植株接种法，存在供试植株感染病害、鉴定周期长、结果易受环境条件影响的缺陷和不足。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的大田活体植株接种法对非洲菊灰霉病抗性鉴定存在供试植株感染病害、鉴定周期长、结果易受环境条件影响的缺陷和不足，其目的是提供一种简单、快速、准确和能大规模筛选鉴定非洲菊灰霉病抗性资源的方法，为进一步的杂交育种或分子标记辅助育种提供支持。解决上述技术问题和实现本发明目的是通过以下技术方案实现的 一种非洲菊灰霉病抗性鉴定方法，按以下步骤进行
(1)适宜的接种材料的选择，以新鲜采集的完整幼叶或花瓣作为接种材料；
(2)灰霉菌SoiiTiisCinerea培养及其分生孢子悬浮液的制备
用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(简称PDA培养基)培养灰霉菌(彻iiriis cinerea), 将-70°C _80°C低温保存的灰霉菌(SoiiTii1S于超菌工作台接种于马铃薯葡萄
糖琼脂培养基中，于18°C 25°C温度，光照强度为1000 20001x条件下16 h连续光照培养培养3天后，转入黑暗条件培养7 15天，菌丝长满整个培养皿后，用含有质量分数为 0. 1%吐温-20的灭菌蒸馏水悬浮培养皿中所培养的分生孢子，用小孔计数法制备每毫升孢子数为IXIO7个的分生孢子贮备液供接种用；
(3)制备接种液
3于接种前，将步骤(2)获得的分生孢子贮备液稀释为含有质量分数为3%的马铃薯葡萄糖(potato dextrose, PD)和分生孢子数为1 X IO6个/ml浓度的接种液供接种用或将步骤 (2)获得的分生孢子贮备液稀释为含有质量分数为6%的马铃薯葡萄糖(potato dextrose, PD)和分生孢子数为3 X IO5个/ml浓度的接种液供接种用； (4)接种
用微量移液器取2μ 1的接种液以液滴的方式将孢子液接种到步骤(1)所述的幼叶或花瓣，将该幼叶或花瓣材料保持在相对湿度为90% 95%、光照强度为IOOOIx 20001χ、温度为18°C 25°C的条件下，接种24h后开始观察病情发展，根据病情发展的速度及病情指数判断供试材料的抗性，花瓣在4 内病情指数达到3 5级为感病品种，幼叶在120h 内病情指数达到3 5级为感病品种。所述的病情指数分为花瓣病情指数统计方法和幼叶病情指数统计方法，所述的花瓣病情指数统计方法如下
0级接种液滴清澈，无任何侵染迹象，
1级开始侵染，侵染斑限于接种液滴之内，液滴呈褐色状，
2级侵染扩展到液滴之外，侵染斑大小为液滴的2-4倍，
3级侵染区域继续扩大，但小于接种花瓣的1/2面积，
4级侵染面积超过花瓣的1/2，
5级整个花瓣几乎或完全被侵染，
48h内病情指数达到3 5级为感病品种；
所述的幼叶病情指数统计方法如下
0级接种液滴清澈，无任何侵染迹象，
1级开始侵染，侵染斑限于接种液滴之内，液滴呈褐色状，
2级侵染扩展到液滴之外，侵染斑大小为液滴的2-5倍，
3级侵染区域继续扩大，侵染斑大小为液滴的6-10倍，
4级侵染区域继续扩大，侵染区域接近叶片面积的1/2，
5级侵染区域达到或超过叶片面积的2/3，
120h内病情指数达到3 5级为感病品种。所述的接种是对完整幼叶的正面接种或对花瓣的正面接种。本发明所涉及的生物材料灰霉菌彻iiriis Cinerea已在许多非专利文献公开， 如在“番茄灰霉病病原菌生物学特性的研究”(徐明等，贵州农业科学，2009，37(3) :68-71) 中公开，并且上述生物材料申请人有保存，申请人保证自本专利申请日起20年内向公众发放。申请人联系地址是云南省昆明市北郊黑龙潭云南农业大学，邮政编码650201，联系电话0871-5220399。与现有技术相比，本发明的有益效果是
1、现有的大田非洲菊活体灰霉菌病害抗性鉴定从育苗开始、小苗移栽、接种到发病是一项历时2 3月、费时费力的工作，且病害表现易受环境影响、很难获得准确的结果。本发明采用小分生孢子液滴、补充营养、花瓣无创伤接种，于室温、高湿、自然光条件下48h能清楚地鉴别出非洲菊不同基因型间的灰霉病抗性差异，花瓣鉴定结果的准确性被幼叶鉴定结果进一步证实，且对非洲菊抗感亲本杂交分离后代的检测结果符合非洲菊灰霉菌抗病基因为QTL基因控制性状的分离特点，达到了简单、快速、准确鉴定非洲菊灰霉病抗性的目的。2、现有非洲菊灰霉病抗性鉴定采用活体鉴定的方法，因接种病菌使植株感染病害影响植株正常生长发育、甚至死亡，致使非洲菊杂交育种后代的早期抗性鉴定无法进行。本发明的方法采用离体的幼叶作接种材料，不但不影响植株正常的生长发育，并且能够在早期对杂交后代进行灰霉病抗性鉴定，能够有效的促进非洲菊灰霉病抗性育种。3、现有灰霉菌活体抗性鉴定方法，因易受环境的影响，其鉴定结果准确性低，无法为非洲菊灰霉菌抗性连锁分子标记的建立提供可靠的研究材料，本发明的离体花瓣鉴定方法是在人工控制的稳定条件下进行，鉴定结果准确性高，可为非洲菊灰霉菌抗性连锁分子标记的建立提供可靠的支持。
图1是一对抗病和感病的非洲菊亲本及其杂交分离后代的灰霉菌抗性变异，横坐标及其数字表示杂交亲本及其杂交分离后代。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步的描述。以下各实施例中所用的灰霉菌 Botrytis cinerea由云南农业大学提供，其余试剂均为是市售产品。所用仪器光学显微镜、 光照培养箱、人工气候箱均为普通配制。本发明使用的生物材料灰霉菌召oiiTiis ci/^rea是利用灰霉菌的致灰霉病的致病共性来感染植株，因此具有致病力的各种灰霉菌菌株都能达到本发明的效果，该灰霉菌广泛存在于许多大田或园艺作物中，采用植物病原真菌的常规稀释分离方法(方中达，植病研究法(第三版)，中国农业出版社，1998，124 125)即可得到灰霉菌召oirj^is chwrea。实施例1以花瓣为接种材料的实施例
(1)植物材料
供试的灰霉菌不同抗性的非洲菊切花栽培品种为Macy，Kaliki, Risto, Serena, CK100, 3142，5544共7个基因型，由荷兰非洲菊育种公司Florist和Shreurs提供，采集新鲜花瓣作为接种材料；
(2)灰霉菌SoiiTiiscinerea培养及其分生孢子悬浮液的制备
用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(简称PDA培养基)培养灰霉菌彻trytis cinerea， 将-80°C低温保存的灰霉菌OtoiiTiis ci/^rm)于超菌工作台接种于装有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的直径IOcm培养皿中心，于20°C 22°C温度，光照强度为18001x条件下1 连续光照培养，培养3天后，转入黑暗条件培养7天，菌丝长满整个培养皿后，用含有质量分数 0. 1%吐温-20的灭菌蒸馏水悬浮培养皿中所培养的分生孢子，用小孔计数法制备每毫升孢子数为IXlO7的分生孢子贮备液供接种用；
(3)制备接种液
于接种前，将步骤(2)获得的分生孢子贮备液制备为分别含有质量分数为1%、3%、6%浓度的马铃薯葡萄糖(potato dextrose, PD)及分生孢子数为3X IO5个/ml、1 X IO6个/ml 浓度的接种液供接种用； (4)接种
5取将步骤(3)制备的含不同浓度分生孢子和PD的接种液2μ 1分别接种到步骤(1) 所述的花瓣上，将该花瓣材料分别保持在塑料膜密封，相对湿度90% 95%，光照强度为 18001χ、温度为20°C 22°C的条件下，接种24h后开始观察病情发展，根据病害发展速度及病情指数判断供试材料的病害抗性。接种采用对花瓣的正面和反面接种对比形式。(5)病情观察及病情指数统计花瓣病情指数统计方法如下
0级接种液滴清澈，无任何侵染迹象； 1级开始侵染，侵染斑限于接种液滴之内，液滴呈褐色状； 2级侵染扩展到液滴之外，侵染斑大小为液滴的2-4倍； 3级侵染区域继续扩大，但小于接种花瓣的1/2面积； 4级侵染面积超过花瓣的1/2 ； 5级整个花瓣几乎或完全被侵染。48h内病情指数达到3 5级为感病品种。(6)实验结果及分析
接种花瓣正反两面比较组织正反面对接种效果的影响。观察结果为，花瓣正反面接种均能发病、且正反面发病表现结果一致，但花瓣正面接种病害发展快于反面，可能是非洲菊花瓣背面膜质化程度的增大加大了病菌侵入的难度，以正面接种为理想。统计灰霉菌分生孢子及营养浓度配比对非洲菊花瓣正面接种的病情指数详见表 1。病情指数结果表明，含有1%的PD的两个分生孢子浓度3 X IO5个/ml、1 X IO6个/ml接种的各品种的花瓣4天内均发病轻、且品种间差异不明显；含有6%的PD及分生孢子浓度 1 X IO6个/ml接种的各品种的花瓣在接种4 均已严重发病、无法鉴定品种间差异；3%PD 与分生孢子3X IO5个/ml浓度组合接种的花瓣虽然品种间差异明显，但48h时品种间差异尚小；以3%PD与分生孢子1 X IO6个/ml及6%PD与分生孢子3 X IO5个/ml浓度组合最为理想，4 能清楚鉴别品种间抗性差异，病情指数大于3的品种均为田间观察较为感病的品种。表1灰霉菌分生孢子及营养浓度配比对非洲菊花瓣正面接种的病情指数
权利要求
1.一种非洲菊灰霉病抗性鉴定的方法，按以下步骤进行(1)适宜的接种材料的选择，以新鲜采集的完整幼叶或花瓣作为接种材料；(2)灰霉菌SoiiTiisCinerea培养及其分生孢子悬浮液的制备用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养灰霉菌，将-70 -80°C低温保存的灰霉菌于超菌工作台接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，于18°C 25°C温度，光照强度为1000 20001x 条件下16 h连续光照培养培养3天后，转入黑暗条件培养7 15天，菌丝长满整个培养皿后，用含有质量分数为0. 1%吐温-20的灭菌蒸馏水悬浮培养皿中所培养的分生孢子，用小孔计数法制备每毫升孢子数为IX IO7个的分生孢子贮备液供接种用；(3)制备接种液于接种前，将步骤(2)获得的分生孢子贮备液稀释为含有质量分数为3%的马铃薯葡萄糖和分生孢子数为1 X IO6个/ml浓度的接种液供接种用或将步骤(2)获得的分生孢子贮备液稀释为含有质量分数为6%的马铃薯葡萄糖和分生孢子数为3 X IO5个/ml浓度的接种液供接种用；(4)接种用微量移液器取2μ 1的接种液以液滴的方式将孢子液接种到步骤(1)所述的幼叶或花瓣，将该幼叶或花瓣材料保持在相对湿度为90% 95%、光照强度为IOOOIx 20001χ、温度为18°C 25°C的条件下，接种24h后开始观察病情发展，根据病情发展的速度及病情指数判断供试材料的抗性，花瓣在4 内病情指数达到3 5级为感病品种，幼叶在120h 内病情指数达到3 5级为感病品种。
2.根据权利要求1所述的一种非洲菊灰霉病抗性鉴定的方法，其特征在于所述的病情指数分为花瓣病情指数统计方法和幼叶病情指数统计方法，所述的花瓣病情指数统计方法如下0级接种液滴清澈，无任何侵染迹象，1级开始侵染，侵染斑限于接种液滴之内，液滴呈褐色状，2级侵染扩展到液滴之外，侵染斑大小为液滴的2-4倍，3级侵染区域继续扩大，但小于接种花瓣的1/2面积，4级侵染面积超过花瓣的1/2，5级整个花瓣几乎或完全被侵染，48h内病情指数达到3 5级为感病品种；所述的幼叶病情指数统计方法如下0级接种液滴清澈，无任何侵染迹象，1级开始侵染，侵染斑限于接种液滴之内，液滴呈褐色状，2级侵染扩展到液滴之外，侵染斑大小为液滴的2-5倍，3级侵染区域继续扩大，侵染斑大小为液滴的6-10倍，4级侵染区域继续扩大，侵染区域接近叶片面积的1/2，5级侵染区域达到或超过叶片面积的2/3，120h内病情指数达到3 5级为感病品种。
3.根据权利要求1所述的一种非洲菊灰霉病抗性鉴定的方法，其特征在于所述的接种是对完整幼叶的正面接种或对花瓣的正面接种。
全文摘要
本发明公开了一种非洲菊灰霉病抗性鉴定的方法，属植物抗病性鉴定技术领域。该方法是(1)适宜的接种材料的选择，以新鲜采集的完整幼叶或花瓣作为接种材料；(2)灰霉菌培养及其分生孢子悬浮液的制备(3)制备接种液，于接种前将分生孢子贮备液稀释为含有质量分数为3%的马铃薯葡萄糖和分生孢子数为1×106个/ml浓度的接种液或将分生孢子贮备液稀释为含有质量分数为6%的马铃薯葡萄糖和分生孢子数为3×105个/ml浓度的接种液；(4)接种。本发明方法在人工控制的稳定条件下进行，鉴定结果准确性高，达到了简单、快速、准确鉴定非洲菊灰霉病抗性的目的。
文档编号C12Q1/18GK102220407SQ20111012255
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者吴兴恩, 吴景芝, 吴红芝, 都婷, 陈溪 申请人:云南农业大学