甲型流感病毒核衣壳蛋白的抗原表位及其用途的制作方法

专利名称：甲型流感病毒核衣壳蛋白的抗原表位及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及甲型流感病毒感染的检测和/或治疗，属于生物医药工程技术领域。
背景技术：
流行性感冒(Influenza)简称流感，是由流感病毒引起的呼吸道传染病，其临床特点是引起发热、乏力、全身酸痛及伴随一定程度上的呼吸道症状。流感病毒是人类健康的一大威胁，全世界姆年约有25-50万人死于流感病毒的感染(Peter C. Doherty.等人，JClin Invest，2008，118 :3273-3275)。自从流感病毒被发现以来，人类历史上共出现了五次世界范围内的流感大流行，共计造成了数千万人的死亡。根据病毒核蛋白(NP)及基质蛋 白(M)抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分为甲(KU乙(B)、丙(C)三型(HorimotoT.等人，NAT REV MICROBIOL, 2005, 3 (8) :591-600)。其中，甲型流感病毒(InfluenzaA Virus，简称Flu A)变异快，致病力強，能引起世界范围内的大流行。こ型流感病毒(Influenza B Virus,简称Flu B)变异较慢,只能引起局部范围内的小流行。丙型流感病毒(Influenza C Virus,简称Flu C)变异最慢,致病力弱,通常只能感染抵抗力较低的孕妇和小孩。在自然界中Flu A的宿主范围广，除了其天然宿主水禽以外，还能够引起人、马、猪等多种动物的感染。Flu A亚型多，变异大，已成为流感防控及疫苗研究的重点。Flu A属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、流感病毒属、有包膜的单链负义RNA病毒。其基因组由八条分节段的RNA组成，至少编码十种病毒蛋白。Flu A根据表面抗原血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)抗原性及基因特性的不同又可以分多种亚型，目前在水禽中已发现了十六种H亚型(H1-H16)和九种N亚型(N1-N9) (Fouchier RA.等人,J Virol,2005，79 (5) :2814-2822)。人群中流行的Flu A亚型主要有两种H亚型(HI、H3)和两种N亚型(NI、N2) οFlu A基因片段5编码核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein,简称NP)。NP为Flu A的结构蛋白，由498个氨基酸组成，分子量约为56KD，与病毒RNA及聚合酶形成核糖核蛋白体复合物。NP在病毒粒子中的含量高，约占病毒总蛋白量的30%，每个病毒粒子中约含有1000个NP分子。流感病毒NP的保守性远高于表面膜蛋白HA及NA，同型流感病毒NP的氨基酸同源性高于 90% (AltnmulerA.等人，J Gen Virol，1989，70 :2111-2119)，基因变异率仅为2. 3X10_3/年，具有型特异性，是流感病毒型别划分的主要依据之一，也是动物模型中研究最早的具有交叉保护效果的抗原(Shu L L.等人，J Virol, 1993,67(5) :2723-2729)。因此，NP作为主要的靶抗原用于流感病毒的检测。Flu A感染人后，经呼吸系统的传播速度非常迅速。因此，及时有效的诊断对于FluA的预防及控制有重要意义。人在感染病毒后的36-48小时为最佳治疗时间，因而快速诊断对于患者的及时治疗有积极作用。目前流感病毒的诊断主要有以下三类传统诊断法、分子诊断法及快速诊断法。传统诊断主要有病毒分离培养、血清学检测等。病毒分离培养法是流感病毒诊断的黄金标准(Gold Standard)。这种方法的可信度高，特异性好，但周期较长，通常需要3-7天。因而该方法不利于病毒的现场检测，不利于病毒的及时防控。血清学检测主要是检测病毒人血清中抗体的存在情况。这种检测方法属于回顾性诊断，具有流行病学意义，但对于急性早期诊断意义不大，且敏感度较低。分子诊断法主要是指基于流感病毒核酸诊断的ー类方法，包括常规RT-PCR、real-time PCR及病毒全基因测序等。这些方法周期短、特异性强、灵敏度高，而且能測定病毒不同的亚型。但这些方法对技术及设备的要求极高，不利于病毒的现场检测，不能对大量临床标本同时进行平行检测及筛查。快速诊断是指能够快速地得出检测结果(约30分钟)。快速诊断方法必须符合国际实验室促进协会(Committee for Laboratory Improvement Act, CLIA) 1988 年提出的床边诊断(Point of Care)的要求(Mitamura K.等人，Nippon Rinsho 2003,61 (11)1914-1920 ；Storch GA.等人，CurrOpinPediatr 2003，15 (I) :77-84)。既可以检测流 感病毒的抗原也可以检测抗体。目前国内外已有商品化的流感病毒快速检测试剂盒，如Directigen-Flu A/Flu A&B、Quidel-QuiCkVue 等,都能在 15-30 分钟以内得出检测结果。由于流感病毒中NP的高保守性及高丰度，因而，当前的快速诊断试剂盒的检测靶点都是NP抗原。这些检测方法操作简单、成本低廉、无需特殊设备，适合现场检測。因此，抗原快速诊断试剂已成为广大临床单位进行Flu A诊断的首选。

发明内容
本发明的ー个方面涉及甲型流感病毒核衣壳蛋白(Flu A NP)的抗原表位多肽，其能够诱导产生甲型流感病毒的特异性抗体或者能够与甲型流感病毒的抗体特异性结合。在ー个具体实施方式
中，本发明的抗原表位多肽为(a)甲型流感病毒核衣壳蛋白的多肽片段，其包含SEQ ID NO :29所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO :29所示的氨基酸序列至少97%序列一致的氨基酸序列；并且能够诱导产生甲型流感病毒的特异性抗体或者能够与甲型流感病毒的抗体特异性结合。其中，所述抗原表位多肽的长度可以是9-25个氨基酸，例如9-20个氨基酸，例如19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸。在另ー个具体实施方式
中，本发明的抗原表位多肽为(b)在SEQ IDNO 29所示氨基酸序列的一端或两端经I个或多个(例如I个或几个)氨基酸，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸的延伸和/或在SEQ ID NO :29所示氨基酸序列中经I个或多个(例如I个或几个，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸)氨基酸的置換得到的多肽；并且其能够诱导产生甲型流感病毒的特异性抗体或者能够与甲型流感病毒的抗体特异性结合。在特别的实施方式中，所述经延伸和/或置換后得到的(b)的抗原表位多肽与上述(a)中的抗原表位多肽有至少90%的序列一致性，例如至少91%、至少92 %、至少93 %、至少94%、至少95 %、至少96 %、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。在优选的实施方式中，本发明的上述(a)或(b)的抗原表位多肽包含SEQ ID NO 17-23或SEQ ID NO :25-29中任一项所示的氨基酸序列，特别地，其由SEQ ID NO :17-23或SEQ ID NO :25-29中任一项所示的氨基酸序列组成，例如由SEQ ID NO :29所示的氨基酸序列组成。在又ー个方面，本发明涉及分离的多肽，其包含上述任一本发明的抗原表位多肽。在具体的实施方式中，所述分离的多肽可以是甲型流感病毒核衣壳蛋白的多肽片段，其长度可以是例如9-497个氨基酸、9-400个氨基酸、9-300个氨基酸、9-200个氨基酸、9-178个氨基酸、9-150个氨基酸、9-100个氨基酸、9-50个氨基酸或9_20个氨基酸；在ー个实施方式中，所述分离的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :7所示，或者与SEQ ID NO :7有至少90%，例如至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。在另ー个方面，本发明涉及复合物，其包含 (i)上述任一种本发明的抗原表位多肽或上述任一种本发明的分离的多肽；以及(ii)载体(例如大分子载体或重组载体)；其中所述载体包括但不限于蛋白、毒素或脂类，其中所述抗原表位多肽与所述载体可以通过偶联、缀合或融合得到所述复合物。当所述抗原表位多肽与所述载体偶联时，所述偶联可以是MBS法、戊ニ醛法、活泼酷法、碳ニ亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法等。所述载体有例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血白蛋白及其他Y球蛋白等蛋白类载体，另有重组载体可以为多聚赖氨酸、ニ软脂酰赖氨酸、三软脂酸2S甘油半胱氨酰2丝氨酰基丝氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。特别地，所述复合物可以是融合蛋白。在ー个具体的实施方式中，所述融合蛋白中的载体为HBVcAg，例如为由HBVcAg的1-183位氨基酸组成的蛋白。在又ー个方面，本发明还提供展示上述抗原表位多肽的类病毒颗粒。所述抗原表位多肽典型地通过与载体蛋白融合，经过蛋白纯化和组装后而形成类病毒颗粒，并将所述抗原表位多肽展示在类病毒颗粒的表面，使其仍保持诱导特异性抗体产生的能力，其中所述载体蛋白可以为HBVcAg，例如由HBVcAg的1-183位氨基酸组成。在另外的方面，本发明还涉及编码前述任一抗原表位多肽、前述任一分离的多肽或前述任一复合物(例如所述融合蛋白)的多核苷酸序列，或者包含该多核苷酸序列的分尚的核酸分子。本发明还涉及核酸载体，其包含前述的任一核酸分子。在又一方面，本发明还涉及包含上述分离的核酸分子或核酸载体的宿主细胞，例如微生物宿主细胞，如大肠杆菌宿主细胞。另ー方面，本发明还涉及组合物，例如药物组合物(如疫苗)或诊断组合物，其包含本发明所述的任一抗原表位多肽、前述的任一分离的多肽、前述的任ー复合物、类病毒颗粒或前述的核酸分子，以及任选地药学上可接受的载体(例如佐剂)。本发明还涉及前述的任一抗原表位多肽，任一分离的多肽、任ー复合物、任ー类病毒颗粒、任一核酸分子在制备用于检测、预防和/或治疗甲型流感病毒感染的组合物中的用途。特别地，本发明还涉及预防或治疗甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的前述的任一抗原表位多肽，任一分离的多肽、任一复合物、任ー类病毒颗粒，或任一核酸分子，或者向其施用本发明的药物组合物(例如疫苗)。本发明也涉及诊断甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括(I)使来自受试者的样品与前述的任一抗原表位多肽、任一分离的多肽、任ー复合物、或任ー类病毒颗粒接触，或者与前述任一诊断组合物接触，以及(2)检测所述任ー抗原表位多肽，任一分离的多肽，任ー复合物或类病毒颗粒与样品中可能存在的抗体之间形成的特异性免疫结合物，从而判断所述受试者是否感染了甲型流感病毒。在又ー个方面，本发明涉及ー种抗体(例如单克隆抗体)，其特异性地识别本发明的前述任一抗原表位多肽、前述任一分离的多肽或任一前述复合物。特别地,本发明的抗体还包括能阻断Flu A NP的多抗血清或者抗体4D2与Flu ANP相结合的抗体。优选地，所述抗体能够阻断Flu A NP的多抗血清或者抗体4D2与Flu ANP相结合的活性的至少50%，例如至少70%、至少80%或至少90%。可以米用常规方法如Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)中描述的方法，测定某一未知抗体降低某一已知抗体结合Flu A NP的能力。例如，先把抗原预包被在微孔板上，然后把系列稀释的未标记的待测抗体和特定浓度的标记后的已知抗体共同加入上述预包被后的微孔板中孵育，洗涤后測定不同稀释度的待测抗体和已知抗体结合到板上的数量。待测抗体竞争已知抗体结合抗原的能力越強，已知抗体结合抗原的能力就越弱。通常，抗原是预包被在96孔微孔板上，并利用放射标记法或酶标记法測定未标记抗体阻断已标记抗体的能力。在ー个具体实施方式
中，所述抗体可以是鼠源或人源或兔源或羊源或其它动物来源，或为基因工程抗体，如人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体等。另外，其中所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。特别地，本发明所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO :11_13所示氨基酸序列中的ー个或多个，和/或其轻链可变区包含SEQ ID NO :14-16所示氨基酸序列中的一个或多个。在具体的实施方式中，本发明所述的抗体的重链⑶R1、⑶R2和⑶R3分别包含SEQID NO :11-13所示的氨基酸序列或者分别由SEQ ID NO :11-13所示的氨基酸序列组成。在又ー个具体实施方式
中，本发明所述抗体的轻链⑶R1、⑶R2和⑶R3分别包含SEQ ID NO :14-16所示的氨基酸序列或者分别由SEQ ID NO : 14-16所示的氨基酸序列组成。在另外的实施方式中，本发明所述抗体的重链⑶R1XDR2和⑶R3分别包含SEQ IDNO :11-13所示的氨基酸序列或者分别由SEQ ID NO :11-13所示的氨基酸序列组成；并且其轻链CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO :14-16所示的氨基酸序列或者分别由SEQID NO :14-16所示的氨基酸序列组成。在具体的实施方式中，本发明所述的抗体的重链可变区与抗体4D2的重链可变区相同。在另外的实施方式中，本发明所述的抗体的轻链可变区与抗体4D2的轻链可变区相同。在又一个实施方式中，本发明所述的抗体的重链可变区和轻链可变区分别与抗体4D2 的重链可变区和轻链可变区相同。特别地，本发明所述的抗体为杂交瘤细胞株4D2所产生的单克隆抗体(在本申请中称为抗体4D2)，所述杂交瘤细胞株4D2于2010年10月22日被保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为C2010103。在一个优选的实施方式中，本发明的抗体广谱性地特异识别ー种或多种甲型流感病毒，例如毒株H5N1、HlNl、H3N2、新甲型HlNl等，所述病毒毒株以人或动物(例如猪、马、水禽等)为宿主。在ー个具体的实施方式中，本发明的抗体衍生自抗体4D2，且所述衍生的抗体可以是鼠源或人源或兔源或羊源或其它动物来源，或为基因工程抗体，如人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体等；其可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明还涉及杂交瘤细胞株，其是CCTCC保藏编号为C2010103的杂交瘤。在另ー个方面，本发明还涉及药物组合物或诊断组合物，其包含前述的任ー种抗体，以及任选地药学上可接受的载体。本发明还涉及前述的任一抗体在制备用于检测、预防和/或治疗甲型流感病毒感染的组合物中的用途。
特别地，本发明还涉及预防或治疗甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的前述任一抗体。本发明也涉及诊断甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括(I)使来自受试者(例如动物或人)的样品与前述任一抗体接触，以及(2)检测所述抗体与样品中可能存在的甲型流感病毒抗原之间形成的特异性免疫结合物，从而判断所述受试者是否感染了甲型流
感病毒。特别地，所述检测方法可为间接免疫荧光检测，免疫组织化学检测，ELISA检测或蛋白质印迹检测等。


图I为pT0-T7-C183的质粒示意图。图2为pT0-T7-C183-NP9的质粒示意图。图3为融合蛋白C183-NP9纯化样品的SDS-PAGE电泳图，其中I :表达C183-NP9的大肠杆菌(E. coli)全部溶胞产物；2 :C183-NP9超声上清65°C水浴中热变性30min后，离心后的上清；图4为单克隆抗体4D2与Flu A NP、Flu B NP两种NP重组蛋白的蛋白质印迹(简称WB)检测結果。图中1-7为12% SDS-PAGE电泳結果，8-13为WB結果。从左至右依次为1、蛋白分子量标准；2、1249-NP，(A/Xiamen/1249/2007 (HlNl)) ;3、177_NP，(A/Shantou/177/2005 (H3N2)) ;4、N444-NP，(A/Xiamen/N444/2009 (全国流行的 H1N1)) ;5、212-NP, (A/Hong Kong/212/2003(H5N1)) ;6、 NS727-NP， (A/Swine/NS727/2005(H3N2))；
7、Flu B NP, (B/Shantou/331-5/2005) ;8、1249-NP 的 WB 結果；9、177-NP 的 WB 結果；10、N444-NP 的 WB 结果;11、212_NP 的 WB 结果;12、NS727_NP 的 WB 结果;13、Flu B NP 的 WB 结果O图5为单克隆抗体4D2与Flu A、Flu B两种流感病毒的WB检测結果。图中从左至右依次为1、蛋白分子量标准；2、Flu A毒株A/California/04/2009的WB結果，3、Flu B毒株 B/Shantou/331-5/2005 的 WB 結果。图6为单克隆抗体4D2与Flu A、Flu B两种流感病毒的间接免疫荧光結果。对于每ー个特定病毒株而言，左侧照片显示FITC荧光，右侧照片显示DAPI荧光。图7为单克隆抗体4D2与感染Flu A致死的小鼠肺部切片的免疫组织化学检测结果O
具体实施例方式在本申请中， 术语“抗原表位多肽”指任何能够被特异性的抗体所识别的多肽片段。在具体的实施方式中，所述“抗原表位多肽”的长度可以是4-25个氨基酸，例如9-25个氨基酸、9-20个氨基酸，例如19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸。在本申请中，术语“甲型流感病毒核衣壳蛋白的多肽片段”是指这样的多肽(i)其氨基酸序列包含在SEQ ID NO :1所示的序列中，或者(ii)其氨基酸序列与SEQ ID NO:I所示的序列或其片段有至少90%，例如至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性；并且(iii)其不是由SEQID NO :1所示的氨基酸序列所组成的多肽。在本申请中，“序列一致性”是指候选序列中的核酸或氨基酸分别与对应的核酸或多肽序列中核酸或氨基酸相同或相似的百分比。对于某ー个序列，将它和目的序列进行比对，必要时可跳过突变缺ロ，以达到最大的相似百分比。本领域的多种比对方法可用于确定核酸或氨基酸序列的相似性，可以使用的计算机软件包括例如BLAST，BLAST-2, ALIGN,ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)等。本领域的技术人员懂得为比对设定合适的测量參数，包括使用最大可比性的ー些运算法则以达到全长序列的比较。在本申请中“特异性结合”指的是，两分子间的非随机结合反应，如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处，结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和カ是检测不到的或者即使可以检测到，也是很弱的。在本发明中，可用于甲型流感病毒感染检测的方法包括但不限于，例如酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法、免疫组织化学检测法及类似的检测方法。本发明中涉及的药物组合物或诊断组合物可进ー步包含用于预防、治疗和/或诊断甲型流感病毒感染的其它试剂或组合物，可以和这些抗病毒试剂同时、分开或连续给药，所述其它试剂或组合物包括但不限干，例如干扰素，免疫抑制剂如环胞菌素。在本申请中，“预防或治疗有效量”指足以防止或減少Flu A感染的量。“药学可接受的载体”指不会在所施用的受试者身上引发过敏反应或其他不适影响的载体，以及表示不干扰活性成分的生物活性的效カ的非毒性物质。合适的药学可接受的载体包括，例如，ー种或多种水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、こ醇和其他类似物，以及上述物质的组合。药学可接受的载体可进ー步包括能提高多肽、抗体或核酸分子的保存期限或效用的微量辅助物质，例如湿润剂或乳化剤、防腐剂或缓冲液。本发明的组合物，例如药物组合物的施用方式包括但不限于传统的施用途径，例如静脉滴注、肌肉注射、阴道、ロ服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径等。特别地，所述施用形式是注射或输液形式。本发明的组合物可以各种形式存在，包括但不限于例如，固体、半固体和液体的剂型，例如片剂、丸剂、粉末、溶液、分散液或悬浮液、脂质体、栓剂、注射用及输液用溶液。优选的形式根据具体的施用方式及其预防、治疗或诊断应用而定。适合肠胃外途径注射的本发明的组合物可能含有符合药物制备要求的无菌水或非水溶液、气雾剂、悬浮液或乳剂，或者可在临用时重悬成可注射的溶液或气雾剂的无菌粉齐U。如适合的水性和非水性载体，工具和各种稀释液如水、こ醇、多羟基化合物(如丙烯こニ醇、聚こ烯ニ醇、丙三醇及其类似物)，合适的混合物，菜油(如橄榄油)，和可用于注射的有机脂，如こ烷油酸，如使用卵磷脂衣壳维持药物的合适流动性，如使用气雾剂、表面活性剂以维持合适的颗粒尺寸。本发明所述的组合物还可含有ー些起保护性、保湿、乳化和气雾化的佐剂，也可以含有预防微生物污染的速溶成分，如各种抗细菌试剂、抗真菌试剂，如对羟苯甲酸甲酷、三氯叔丁醇、苯酚，山梨酸及类似物。也可以包括維持渗透压的试剂，如糖、NaCl及其类似物。可使用延长吸附的试剂来延长注射用药物成分吸附时间，如单硬脂酸盐和凝胶等。 本发明的组合物也可制成适合兽用治疗或诊断的混合物，或符合兽用的溶剂或初成药，井根据普通兽医和兽医从业者的要求制成最适合某种特定动物的施用剂量和剂型。本发明所述的表位多肽、抗体或组合物可以与其它抗病毒试剂相结合而用于预防和/或治疗Flu A感染及与之相关的疾病。本发明的组合物可以和其它抗病毒试剂同时、分开或连续施用。其它抗病毒试剂包括但不限于，例如利巴韦林、金刚烷、羧基服、IL-2、IL-12和五羧链胞酸。下面结合具体实施例与附图，进一歩对本发明加以描述，但这些描述并不构成对本发明的限制。除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里的普通技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分子生物学、生物化学、免疫学实验操作中的步骤均为相应领域内广泛使用的常规命名和步骤。实施例I :NP蛋白B细胞抗原表位区域的筛选由于Flu A NP蛋白氨基酸同源性高于90%，于是本发明选择Flu A毒株A/HK/212/2003(H5N1)用于NP蛋白B细胞抗原表位的筛选，所述毒株A/HK/212/2003 (H5N1)NP 蛋白的氨基酸序列如下(SEQ ID NO: I) MASQGTKRSYEQMETGGERQNATEIRASVGRMVSGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSITIERMVLSAFDERRNRYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRRDGKffVRELILYDKEEIRRIWRQANNGEDATAGLTHLMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELIRMIKRGINDRNFWRGENGRRTRIAYERMCNILKGKFQTAAQRAMMDQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGLAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVFSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVSSFIRGTRVVPRGQLSTRGVQIASNENMEAMDSNTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISVQPTFSVQRNLPFERSTIMAAFTGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKATNPIVPSFDMNNEGSYFFGDNAEEYDN根据A/HK/212/2003NP蛋白氨基酸序列，设计了亚克隆片段(128_305aa和300-498aa)及NP蛋白全长(l_498aa)。设计合成相应的引物，如表I所示，并将经PCR扩增后的DNA片段插入表达载体PT0-T7与His-tag进行融合表达。融合表达的NP亚克隆重组蛋白与抗甲型流感NP蛋白的小鼠血清进行蛋白质印迹(WB)分析，分析NP蛋白抗原表位所在区域，结果见表2所示。其中作为阴性对照，选用了一株こ型流感病毒的NP重组蛋白，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2) MSNMDIDGINTGTIDKAPEEITSGTSGTTRPIIRPATLAPPSNKRTRNPSPERATTIGEADVGRKTQKKQTPTEIKKSVYNMVVKLGEFYNQMMVKAGLNDDMERNLIQNAHAVERILLAATDDKKTEFQKKKNVRDVKEGKEEIDHNKTGGTFYKMVRDDKTIYFSPIRVTFLKEEVKTMYKTTMGSDGFSGLNHIMIGHSQMNDVCFQRSKALKRVGLDPSLISTFAGSTLPRRSGATGVAIKGGGTLVAEAIRFIGRAMADRGLLRDIKAKTAYEKILLNLKNKCSAPQQKALVDQVIGSRNPGIADIEDLTLLARSMAVVRPSVASKVVLPISIYAKIPQLGFNVEEYSMVGYEAMALYNMATPVSILRVGDDAKDKSQLFFMSCFGAAYEDLRVLSALTGTEFKPRSALKCKGFHVPAKEQVEGMGAALMSIKLQFWAPMTRSGGNEVG⑶GGSGQISCSPVFAVERPIALSKQAVRIMLSMNIEGRDADVKGNLLKMMNDSMAKKTNGNAFIGKKIFQISDKNKTNPVEIPIKQTIPNFFFGRDTAEDYDDLDY。简要 地，分析流程如下设计亚克隆片段序列——合成亚克隆片段的PCR引物——构建表达载体——诱导表达——亲和层析纯化亚克隆片段——检测表达产物与抗NP蛋白的小鼠血清的反应性——根据检测结果分析NP蛋白抗原表位所在的区域。结果分析表明，初步鉴定出的NP蛋白B细胞抗原表位区域为128_305aa。表INP蛋白亚克隆片段扩增的引物序列
NP蛋白片段「 序列编号 I引物名称I_引物序列_
SEO ID NO: 3 128-305F 5-GAATTCGACGCAACTGCTGGTCTTAC-3 128-305aa ----
__SEQ ID NO: 4 __128~305R__5=GTCGACACGGAAAGGATCTATTC= 3 _
SEO ID NO: 5 300-498F5-GAATTCGGAATAGATCCTTTC-3
300-498aa ------
__SEQ ID NO: 6 __300-498R__5-GTCGACATTGTCATACTCCTCTGC-3 _表2NP亚克隆片段与NP蛋白抗血清WB反应结果
序列编号 NP亚克隆片段WB结果
SEQ ID NO: 7 128-305aa+
SEQ ID NO: 8 300-498aa-
SEQ ID NO: I (阳性对照)l-498aa+
SEQ ID NO: 2(阴性对照)_こ型流感NP蛋白_ - _注每种NP亚克隆重组抗原以5 μ g/well进行15% SDS-PAGE ；NP蛋白小鼠抗血清为500倍稀释；“ + ”代表WB反应阳性，代表WB反应阴性。实施例2 NP蛋白杭原表位定位根据实施例I中初步鉴定出的抗原表位区域，设计合成了覆盖128_307aa的多肽库。库内共含有17条多肽，每条多肽由20个氨基酸组成，相邻2条多肽有10个氨基酸残基重叠。肽库合成由上海吉尔生化有限公司完成，所有多肽纯度大于60%，均进行了 HPLC和MS分析。将17条多肽分别以包被缓冲液(20mM CB，PH9. 6)稀释到5 μ g/ml，4°C包被过夜。次日以O. I % PBS-Tween洗板I次，以含I % BSA的PBS-T溶液37°C封闭2小时，拍干。将NP蛋白的小鼠抗血清与包被后的17条多肽进行间接ELISA分析，反应结果如表3所示，结果表明，经合成肽扫描及间接ELISA鉴定出的NP蛋白抗原表位序列为M12(238-257aa) (SEQID NO 17)。表3NP蛋白多肽与NP蛋白抗血清间接ELISA反应结果
权利要求
1.分离的抗原表位多肽，其能够诱导产生甲型流感病毒的特异性抗体和/或能够与甲型流感病毒的抗体特异性结合，所述抗原表位多肽选自 (a)甲型流感病毒核衣壳蛋白的多肽片段，其包含SEQID NO :29所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO 29所示的氨基酸序列至少97%序列一致的氨基酸序列；或 (b)在SEQID NO 29所示氨基酸序列的一端和/或两端经I个或几个氨基酸，例如I、2、3、4、5或6个氨基酸的延伸和/或在SEQ ID NO :29所示氨基酸序列中经I个或几个，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸的置换而得到的多肽； 其中，所述抗原表位多肽的长度可以是9-25个氨基酸，例如9-20个氨基酸，例如19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸。
2.权利要求I所述的抗原表位多肽，其包含SEQID NO 17-23或SEQID NO 25-29中任一项所示的氨基酸序列。
3.权利要求I或2所述的抗原表位多肽，其由SEQID NO 17-23或SEQ ID NO :25-29中任一项所示的氨基酸序列组成。
4.分离的多肽，其包含权利要求1-3中任一项所述的抗原表位多肽；特别地，其为甲型流感病毒核衣壳蛋白的多肽片段。
5.复合物，其包含 (i)权利要求1-3中任一项所述的抗原表位多肽或权利要求4所述的分离的多肽；和 ( )载体； 其中所述载体为蛋白、毒素或脂类；其中所述抗原表位多肽与所述载体通过偶联、缀合或融合得到所述复合物；优选地，所述载体为蛋白，例如HBVcAg。
6.权利要求5所述的复合物，其为融合蛋白。
7.类病毒颗粒，其展示权利要求1-3中任一项所述的抗原表位多肽。
8.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-3中任一项所述的抗原表位多肽、权利要求4中所述的分离的多肽或权利要求6所述的复合物的核酸序列。
9.核酸载体，其包含权利要求8所述的分离的核酸分子。
10.宿主细胞，其包含权利要求8所述的分离的核酸分子或权利要求9所述的核酸载体。
11.药物组合物或诊断组合物，例如疫苗，其包含权利要求1-3中任一项所述的抗原表位多肽，权利要求4所述的分离的多肽，权利要求5或6中所述的复合物，权利要求7所述的类病毒颗粒或者权利要求8所述的分离的核酸分子，以及任选地药学上可接受的载体。
12.权利要求1-3中任一项所述的抗原表位多肽，权利要求4所述的分离的多肽，权利要求5或6中所述的复合物，权利要求7所述的类病毒颗粒或者权利要求8所述的分离的核酸分子在制备用于检测、预防和/或治疗甲型流感病毒感染的组合物中的用途。
13.抗体，其特异性结合权利要求1-3中任一项所述的抗原表位多肽、权利要求4所述的分离的多肽或权利要求5或6所述的复合物；其中所述抗体可以是鼠源或人源或兔源或羊源或其他动物来源，或为基因工程抗体，如人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体；所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
14.权利要求13所述的抗体，其中 所述抗体的重链⑶R1、⑶R2和⑶R3分别包含SEQ ID NO :11-13所示的氨基酸序列或者分别由SEQ ID NO :11-13所示的氨基酸序列组成。
15.权利要求13或14所述的抗体，其中 所述抗体的轻链⑶R1、⑶R2和⑶R3分别包含SEQ ID NO :14-16所示的氨基酸序列或者分别由SEQ ID NO :14-16所示的氨基酸序列组成。
16.权利要求13-15中任一项所述的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与CCTCC保藏编号为C2010103的杂交瘤产生的抗体4D2的重链可变区的氨基酸序列相同。
17.权利要求13-16中任一项所述的抗体，其中所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与CCTCC保藏编号为C2010103的杂交瘤产生的抗体4D2的轻链可变区的氨基酸序列相同。
18.权利要求17所述的抗体，其是CCTCC保藏编号为C2010103的杂交瘤产生的抗体.4D2。
19.一种杂交瘤细胞株，其是CCTCC保藏编号为C2010103的杂交瘤。
20.药物组合物或诊断组合物，例如疫苗，其包含权利要求13-18中任ー项所述的抗体，以及任选地药学上可接受的载体。
21.权利要求13-18中任一项所述的抗体在制备用于检测、预防或治疗甲型流感病毒感染的组合物中的用途。
全文摘要
本发明涉及甲型流感病毒核衣壳蛋白的保守表位多肽及其用途。具体而言，本发明提供了甲型流感病毒核衣壳蛋白的保守表位多肽，及其保守性变异体或活性片段，及其相关编码序列，其融合蛋白或偶联物，及应用该多肽于预防或诊断的用途，本发明还提供特异识别该保守表位多肽的抗体，及其用于诊断或治疗甲型流感病毒感染的用途。
文档编号C12N15/63GK102775469SQ20111012246
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者吴兴容, 夏宁邵, 桂勋, 郑清炳, 陈毅歆, 黄德党 申请人:厦门万泰沧海生物技术有限公司, 厦门大学